Summary
Флуоресцентные наночастицы производится в нашей лаборатории используются для работы с изображениями концентрации ионов и потоков ионов в биологических системах, таких как клетки во время сигнализации и межклеточной жидкости во время физиологического гомеостаза.
Abstract
Плотно регулируется ионного гомеостаза в организме необходимо для предотвращения таких изнурительных государств, как обезвоживание. 1 В отличие от быстрых потоков ионов на клеточном уровне, необходимых для инициирования потенциалов действия в возбудимых клеток. 2 Натрий регулирование играет важную роль в обоих этих случаях, однако, ни один метод в настоящее время существует для постоянного контроля уровня натрия в естественных условиях 3 и внутриклеточных зондов натрия 4 не дают подробные указания, аналогичные результаты, как кальций зондов. В попытке заполнить обе эти пустоты, флуоресцентный наносенсоров были разработаны, которые могут контролировать концентрацию натрия в пробирке и в естественных условиях. 5,6 Эти датчики на основе ионоселективных optode технологии и состоят из пластифицированных полимерных частиц, в которых натрия особого признания элементы, рН-чувствительных флуорофоров и добавки встраиваются. 7-9 механистически, элемент натрия признание экстракты натрия в датчик. 10 Это извлечение причины рН-чувствительных флуорофора, чтобы освободить ионов водорода для поддержания заряда нейтральности в датчик, который вызывает Изменение флуоресценции. Натрия датчики являются обратимыми и селективных для натрия над калием даже при высокой внутриклеточной концентрации. 6 Они примерно 120 нм в диаметре и покрыты полиэтиленгликоля придать биосовместимости. Использование микроинъекции техники, датчиков может быть доставлен в цитоплазму клетки, где они были показаны на мониторе временной и пространственной динамики натрия в избиении кардиомиоцитов. 11 Кроме того, они также отслеживаются в режиме реального времени изменения в концентрации натрия в естественных условиях при введении подкожно мышам 3 настоящей статьи, мы подробно объяснить и показать методологию для изготовления флуоресцентных наносенсоров натрия и кратко продемонстрировать биологических приложений нашей лаборатории используются для наносенсоров. микроинъекции датчиков в клетки, и подкожного введения мышам датчиков .
Protocol
1. Подготовка optode
Перед тем, optode аликвоты компоненты необходимо, чтобы они могли быть легко измерено и хранить.
- 50 мг натрия ионофором X (NaIX) флакон и 50 мг натрия тетракис [3,5-бис (трифторметил) фенил] борат (NaTFPB) каждому из них будет воспитываться в tetrahyrdofuran (ТГФ) и аликвоты в 1,5 мл пробирок полистирола центрифуги. В химический вытяжной шкаф, растворите 50 мг NaIX в 1 мл ТГФ в судоходной флакон и перемешайте, чтобы твердое тело полностью не растворится. Передача 100 мкл этого раствора в 10 отдельных трубы центрифуги. Повторите эти действия для NaTFPB. Разрешить ТГФ испаряться в химической вытяжного шкафа в одночасье, этикетки центрифужные пробирки и поместите их в 4 градуса холодильник для хранения. Это создает 5 мг аликвоты сухой NaIX и NaTFPB.
- Растворите Chromoionophore III (CHIII) в 1 мл ТГФ и трансфер в 3 стеклянный пузырек мл. Добавить еще 1 мл ТГФ во флакон доставки CHIII распустить любой остаточной CHIII и добавить это к 3 стеклянный пузырек мл. Там будет в общей сложности 2 мл сейчас. Передача 1 мл CHIII в растворе ТГФ с двумя отдельными 1,5 мл стеклянных флаконах с тефлоновым покрытием крышки. Магазин решение CHIII в 4 градуса холодильнике при конечной концентрации 5 мг / мл.
Эти аликвоты и решения будут использованы для optode материала.
- Внесите 66 мкл бис (2-этилгексил) sebacate (DOS) в 1,5 мл стеклянный флакон с тефлоновым покрытием колпачок - это optode флаконе. DOS представляет собой вязкую решения, с тем необходимо соблюдать осторожность, чтобы обеспечить надлежащее количество раствор переносят в пробирку. Объем соответствует ~ 60 мг DOS.
- Взвесьте из 30 мг с высоким молекулярным весом поли (винил) хлорида (ПВХ) и передачу этого optode флаконе.
- Теперь добавьте аликвоты функциональных компонентов optode флакон для создания нужного optode. Относительные концентрации CHIII, NaIX и NaTFPB будет определять реакцию датчика натрия. Эти концентрации могут быть скорректированы, чтобы датчик, который идеально отвечает на внутриклеточные концентрации, с Kd 10 мм, или внеклеточной концентрации, с Kd 150 мм. Кроме того, вероятно, будут партии к партии изменчивость химических веществ из поставщиков и калибровки датчиков необходимо, чтобы определить, правильный ответ, что происходит для каждой новой партии химических компонентов. Здесь мы опишем метод для создания датчиков с концентрациями, которые обычно используются для внутриклеточных измерений натрия.
- В химический вытяжной шкаф, передача 100 мкл 5 мг / мл CHIII в ТГФ решение optode флаконе.
- Растворите 5 мг NaIX в 300 мкл ТГФ и передачи 300 мкл до optode флаконе, это коррелирует с 5 мг NaIX.
- Растворите 5 мг аликвоты NaTFPB в 500 мкл ТГФ и передачи 20 мкл решение optode флаконе, это коррелирует до 0,1 мг NaTFPB.
- Добавить 80 мкл ТГФ в optode флаконе.
- Решение в optode флакон содержит 30 мг ПВХ, 60 мг DOS, 5 мг NaIX, 0,2 мг NaTFPB, 0,5 мг CHIII в 500 мкл ТГФ. Аккуратно вихрь этого флакона, пока все не растворится ПВХ. Optode должны быть красного цвета. Общая сумма ТГФ добавлены флакон необходимо 500 мкл независимо от соотношения используемых компонентов.
- Разрешить оставшиеся ТГФ в NaIX и NaTFPB аликвоты испариться в течение ночи и повторно маркировать трубки с правильным количеством химических веществ.
2. Создание наносенсоров
- Внесите 100 мкл 10 мг / мл 1,2-Distearoyl-Sn-глицеро-3-Phosphoethanolamine-N - [метокси (полиэтиленгликоль) -550] в хлороформе (ПЭГ-липида) в 4 стеклянный пузырек драм. Разрешить хлороформ испаряется в химической вытяжной шкаф. Этот процесс может быть ускорен путем высушивания раствора с азотом или дома воздух.
- Добавить 4 мл желаемого водного раствора во флакон с ПЭГ-липида. Место флакон на лабораторный разъем под наконечник sonicating и поднять флакон до кончика составляет около 7 мм в глубину в раствор и разрушать ультразвуком при малой мощности ультразвука в течение 30 секунд. Здесь мы используем Брэнсон цифровой sonifier установлен в 15% амплитуды с ½ дюйма рог диаметром шагом чаевые. Водный раствор может быть какое-либо решение. Например, чтобы определить реакцию датчиков мы используем 10 мМ HEPES рН 7,2 с базой trizma.
- Хотя решение в настоящее время обрабатывают ультразвуком, смешайте 50 мкл optode материала с 50 мкл дихлорметана в 0,6 трубки микроцентрифужных мл. Смешать с пипеткой для обеспечения равномерного перемешивания.
- Отрегулируйте sonifier управления разрушать ультразвуком в течение 3 минут. Начало ультразвуком и в то время как sonicating добавить optode решение смесь во флакон путем погружения пипетки в раствор и отпуск по 100 мкл раствора в один быстрый, даже инъекции. Решение должно синей, депенахождении на водный раствор используется.
- Разрешить ультразвуком продолжаться в течение приблизительно 30 секунд, затем опустите домкрат так, чтобы кончик sonicating составляет около 2 мм в глубину в растворе. Это следует начать, чтобы проветрить решения и решения станут непрозрачными. Этот шаг позволяет удалить остаточную ТГФ и дихлорметана из раствора.
- После завершения обработки ультразвуком, подтяните наносенсор раствора в 5 мл шприца. Прикрепить 0,2 мкм шприц фильтр и обойтись наносенсор раствора в стеклянный пузырек с винтом верхней крышке. Решение должно быть ясным и синим, если водный раствор, который содержит менее 10 мМ натрий и имеет рН менее около 9 используется. В противном случае он не должен иметь цвет или розовые.
3. Определение nanonsensor ответ
Этот метод используется для определения реакции наносенсоров предназначен для измерения внутриклеточного натрия. Различные концентрации рекомендуется использовать для внеклеточных наносенсоров концентрации натрия.
- Сделать растворы 10 мМ HEPES (0 Na) и 1 М хлорида натрия (NaCl) в 10 мМ HEPES (1 М Na) и рН каждого из этих решений до 7,2 использованием trizma базы. Смешайте растворы Na от 0 и 1 М Na в 50 мл конические пробирки центрифуги для создания решений с: 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 мм NaCl концентрации.
- Использование оптического дно 96 ячейках, чтобы определить реакцию. Добавить 100 мкл каждого концентрации натрия до 3 скважин в колонне. Это даст массив 3 х 10 скважин.
- Для каждой лунки добавить по 100 мкл свежеприготовленного наносенсоров и загрузить в планшет флуорометр. Мы используем Molecular Devices Spectramax M3.
- Прочитайте каждую лунку со следующими длинами волн:
| Возбуждение (нм) | Выбросов (нм) | Cut-Off (нм) |
| 488 | 570 | 530 |
| 488 | 670 | 610 |
| 639 | 680 | 665 |
Наносенсор интенсивности для каждой длины волны, зависит от концентрации натрия. Использование длин волн зависит от приложения. Для внутриклеточные медленный измерения динамики, мы используем 488 nm/570 нм (возбуждение / излучение) и 488 нм nm/670 которые позволяют нам соотношение двух длинах волн и снизить уровень шума.
- Традиционно optode данные преобразуются в значения которых являются: α = (I - я мин) / (I макс - I мин), где я есть интенсивность в данной концентрации натрия, я мин является самой низкой интенсивности в ответ измерений , и я макс является самой высокой интенсивности в ответ измерений. Преобразование либо отношение интенсивности при 570 нм, разделенных интенсивности на 670 нм или интенсивности при 680 нм до α.
- Используйте построение программного обеспечения, либо Excel или происхождения, как правило, используются в нашей лаборатории, для построения α против журнала концентрации натрия, установка журнал нулевой концентрации натрия в -1. Fit сигмоидального кривой в ответ. По кривой, рассчитать концентрации натрия на α = 0.5, которое представляет концентрация, при которой датчик оптимально отвечает.
- Отрегулируйте соотношение CHIII, NaIX и NaTFPB в optode создать наносенсоры с оптимальным ответом вокруг натрия концентрацией интереса.
4. Внутриклеточное изображений
- Для внутриклеточных измерений, наносенсоров выполнены в 5 мг / мл глюкозы в воде и microinjected в клетки.
- Расти или передачи клеткам блюдо со стеклянным дном или изображений камеры с нижней покровного стекла.
- Инкубируйте клетки в ясную средствах массовой информации или решение Тирода. Горы камеры изображений или блюдо на epifluorescence микроскопом. Мы используем Zeiss LSM 7 конфокальной микроскопии.
- Вытяните капиллярной стекла с съемник пипетки. Мы используем Саттер пылающий коричневый Р-97 с 1 мм диаметром, 0,78 мм ID стекло, чтобы конечный диаметр кончика около 300-500 нм.
- Засыпка пипетки с наносенсор решение с помощью шприца и иглы Гамильтон, или погрузчика микроострийных и пипетки.
- Горы пипетки в держатель, который крепится к микроманипулятора и подключен к давлению управляемой системы впрыска. Здесь мы используем Берли EXFO PCS микроманипулятора 6000 и медицинских систем корпорации инжектора.
- Нижняя пипетки на верхней части клетки и в цитоплазме, иногда это необходимо "крана" манипулятором держатель для прокалывания мембраны. Inject наносенсор решение и быстро снять пипеткой.
5. В естественных изображений
Все процедуры были рассмотрены и одобрены Animal Care Северо-восточного университета и использование комитета.
- Наносенсорыдля прижизненного, внеклеточные изображения сделаны в фосфатном буферном растворе и корректируются, чтобы оптимальным ответом на натрия при концентрации натрия в 135 мМ.
- Для инъекций настройки и визуализации флуоресцентных наносенсоров у мышей, мы используем ИВИС Lumina II и связанные с ней блок анестезии. Лечить индукции и изображения камер. Место CD1 голым мышам (примерно 20 г) в индукции камеры и подвергать их изофлуран. Процента изофлуран и кислорода, расход введения будет варьироваться в зависимости от веса и вида мышей. Подождите, мышей, чтобы стать полностью под наркозом.
- После мышей под наркозом, удаление мышей от камеры индукции и поместить в камеру изображения. Держите мыши под анестезией. Для каждой мыши, дезинфекции требуемых областях инъекций.
- Заполните стерильные 31G шприц инсулина с 10 мкл наносенсоров убедившись, чтобы удалить все пузырьки воздуха.
- Использование щипцов, держитесь небольшие складки кожи на спинке мыши на нужном месте инъекции. Хотя захватывая кожу, вставьте шприц в кожу конических вверх и иглы параллельно коже.
- До инъекционных датчики, потяните на себя поршень шприца для обеспечения игла не вставляются в кровеносный сосуд. Затем, осторожно двигаться иглы вправо и влево для создания кармана в кожу. Это сведет к минимуму обратного давления, который вызывает датчики утечки из места инъекции. Inject датчиков и аккуратно удалить шприц.
- Осторожно надавите на месте инъекции и вытереть любое решение, которое, возможно, утечка из места инъекции. Это минимизирует флуоресценции от датчиков, которые не вводят в кожу.
- Повторяет шаги 5,4 через 5,7, пока число требуемых областях инъекций не будет достигнуто. Шесть инъекций равномерно расположенных на левой и правой стороны спины рекомендуется. Для каждой отдельной мыши, изменение иглы, если игла становится трудно вставить в кожу. Иглы не должны быть разделены между мышами. Это сведет к минимуму передачи болезни или перекрестного загрязнения среди мышей.
- Для визуализации натрия флуоресцентных датчиков, мы приобретаем как светлое и флуоресцентные изображения мышах наборы фильтров, которое наиболее близко соответствует 640 nm/680 нм (возбуждение / излучение) спектр наносенсоров и что также минимизирует флуоресценции кожи.
6. Представитель Результаты
Рисунок 1. Кривые ответа из пяти различных наносенсоров наборы натрия. Каждый набор представляет наносенсоров из разных формулировках optode, которые столько же CHIII, NaTFPB, ПВХ и DOS, но различное количество NaIX. Данные были преобразованы в α значения, используя 639/680 интенсивности нм. Данные в среднем на 3, погрешности опущены для ясности, кухню сигмоидального кривой с использованием происхождения. В этом ответе кривой, максимальная концентрация натрия использовался 500 мм. Kd из натрия наносенсоров для натрия составляет от 10 мм (оранжевые алмазы) до примерно 150 мм (черные квадраты).
Рисунок 2. Injected новорожденных кардиомиоцитов. Клетки культивировали на покровного стекла, установленный на микроскоп и вводят натрия наносенсоров. Показаны люминесцентные (639 возбуждения нм), светлое и наложения. Заметим, что некоторые датчик кластеризации происходит, но клетки нормальной морфологией, датчики распространяется по всей цитозоле и нет никакой ядерной нагрузкой.
Рисунок 3. Подкожное введение мышам с натрием наносенсоров. Девять различных инъекции натрия наносенсоров были сделаны в пространстве подкожной голым мышам. Оба светлого поля и флуоресцентных изображений (640/680), перекрываются.
Discussion
Образование наносенсоров должен занимать не более 10 минут один раз optode решение принято и липидного PEG сушат. Optode не могут быть сделаны только быстро, когда это необходимо, но при условии хранения при температуре 4 градуса по Цельсию, они могут быть стабильными в течение нескольких месяцев. Мы показали, что nansensors, как только образуется, стабильные в растворе, по крайней мере неделю. Тем не менее, необходимо соблюдать осторожность, чтобы предотвратить фотообесцвечивания за это время, блокируя наносенсоров от светло-6 Хотя натрия наносенсоров были продемонстрированы здесь, optodes были создан для самых биологически соответствующих ионов, таких как калий и хлорид. 10,12 Мы также расширили эту технологию для малых молекул, таких как глюкоза 13.
В дополнение к генерации наносенсоров для контроля различных аналитов, эти наносенсоров поддаются другие изменения, которые сделают их полезными в большинстве биологических экспериментов. Например, покрытие поверхности, в данном случае поли (этиленгликоля), могут быть легко изменены с помощью любого амфифильные молекулы, которые растворяются в воде. Это дает возможность функционализации этих наночастиц для различных приложений или цели. Размер наночастиц можно регулировать путем изменения поверхности покрытия, интенсивности ультразвука или используемого растворителя.
Кальций флуоресцентных индикаторов внесли неоценимый вклад в определение внутриклеточной сигнализации кальция, однако, не доступных натрия чувствительных красителей имеют те же идеальные характеристики. Optode наночастиц призвана обеспечить альтернативный метод для работы с изображениями ионов внутриклеточно были в разработке в течение лет 14. Мы построили на этом предыдущие исследования по созданию наносенсоров специфичные для визуализации внутриклеточных натрия, который, мы надеемся обеспечить средства чтобы понять, как натрий сигнализации влияет на функционирование клетки и изменения в сигнализации, которые приводят к определенным болезням.
Использование флуоресцентных наносенсоров в естественных условиях предлагает в режиме реального времени минимально-инвазивной альтернативой для мониторинга аналитов по сравнению с другими методами, такими как кровь ничьих. 3 натрия и глюкозы наносенсоров на основе технологии выше было показано, отслеживать изменения в натрия и глюкозы, соответственно, в естественных условиях. 3,13 Тем не менее, в настоящее время существуют ограничения на этот метод как средство для контроля. Например, датчики должны содержать флуорофора с достаточно спектр смещается в сторону ближнего инфракрасного красный с целью минимизации фона флуоресценции от кожи. 15 Во-вторых, текущий технику инъекции не производит равномерное введение наносенсоров, которые могут быть вызваны такими ошибки, как изменение инъекции глубину. Несмотря на эти ограничения, развитие этих флуоресцентных наносенсоров и их успешная демонстрация может сделать эти датчики неоценимый инструмент исследования и метод для мониторинга здоровья пациентов.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
JMD и МКБ финансируются за счет науки IGERT Наномедицина и технологии программы Северо-Восточного университета (финансирование из NCI и NSF гранта DGE-0504331). Эта работа была также финансируемых Национальным институтом здоровья Национальный Институт общей медицинских наук Грант R01 GM084366. Мы также благодарим саумйа Дас и Энтони Розенцвейг из BIDMC в Бостоне для обеспечения кардиомиоцитов и Кевин Наличные за вклад в развитие протокола животного.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Lumina II Instrument Package | Caliper Life Sciences | 126273 | |
| CD-1 Nude Mice | Charles River Laboratories | Strain Code: 086 | Immunodeficient |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 328438 | 3/10 ccmL , 8mm, 31G |
| High Molecular Weight PVC | Sigma-Aldrich | ||
| DOS | Sigma-Aldrich | ||
| CHIII | Sigma-Aldrich | ||
| NaTFPB | Sigma-Aldrich | ||
| NaIX | Sigma-Aldrich | ||
| Thin walled capillary glass | Sutter Instrument Co. | ||
| PEG lipid | Avanti Polar Lipid, Inc | ||
| Table 1. Provides a list of chemicals and equipment used in this procedure. All common chemicals not listed were purchased from Sigma. | |||
References
- Adrogue, H. J., Madias, N. E.
- Kim, D. Y. BACE1 regulates voltage-gated sodium channels and neuronal activity. Nat Cell Biol. 9, 755-764 (2007).
- Dubach, J. M., Lim, E., Zhang, N., Francis, K. P., Clark, H. in vivo sodium concentration continuously monitored with fluorescent sensors. Integr Biol (Camb). , (2010).
- Minta, A., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic sodium. J Biol Chem. 264, 19449-19457 (1989).
- Dubach, J. M., Harjes, D. I., Clark, H. A. Ion-selective nano-optodes incorporating quantum dots. Journal of the American Chemical Society. 129, 8418-8418 (2007).
- Dubach, J. M., Harjes, D. I., Clark, H. A. Fluorescent ion-selective nanosensors for intracellular analysis with improved lifetime and size. Nano Letters. 7, 1827-1831 (1021).
- Schaffar, B., Wolfbeis, O.
- Seiler, K. Characterization of sodium-selective optode membranes based on neutral ionophores and assay of sodium in plasma. Clin Chem. 37, 1350-1355 (1991).
- Zhujun, Z., Mullin, J., Seitz, W. Optical sensor for sodium based on ion-pair extraction and fluorescence. Anal Chim Acta. 184, 251-251 (1986).
- Bakker, E., Buhlmann, P., Pretsch, E. Carrier-Based Ion-Selective Electrodes and Bulk Optodes. 1. General Characteristics. Chem Rev. 97, 3083-3132 (1997).
- Dubach, J. M., Das, S., Rosenzweig, A., Clark, H. A. Visualizing sodium dynamics in isolated cardiomyocytes using fluorescent nanosensors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16145-16150 (2009).
- Harjes, D. I., Dubach, J. M., Rosenzweig, A., Das, S., Clark, H. A. Ion-Selective Optodes Measure Extracellular Potassium Flux in Excitable Cells. Macromolecular Rapid Communications. 31, 217-221 (2010).
- Balaconis, M. K., Billingsley, K. L., Dubach, J. M., Clark, H. A. Pittsburgh Conference on Analytical Chemistry and Applied, , Forthcoming.
- Park, E. J., Brasuel, M., Behrend, C., Philbert, M. A., Kopelman, R. Ratiometric optical PEBBLE nanosensors for real-time magnesium ion concentrations inside viable cells. Anal Chem. 75, 3784-3791 (2003).
- Frangioni, J. V.
