Summary
我们展示了一种低成本的低温阶段，设计，以适应最反射光显微镜的制造。这个实验室建成的低温阶段，实现高效，可靠的冷冻光线和低温电子显微镜之间的相关性成像。
Abstract
耦合低温光镜（冷冻LM）和低温电子显微镜（冷冻电镜）对细胞动力学的理解和超微结构的许多优点。首先，细胞可成像两种技术在不久的原生环境。其次，由于玻璃化过程中，样品保存快速物理固定，而不是缓慢的化学固定。第三，成像同一样品冷冻LM和冷冻电镜提供相关的数据从一个单细胞，而不是一个“有代表性的样品”的比较。虽然这些好处是从以前的研究，相关冷冻- LM和冷冻电镜仍然广泛使用有限的，由于购买或建立一个合适的低温光镜阶段的费用和复杂性。在这里，我们展示了大会，并用不到40美元，在当地的硬件和杂货店发现部分可以在任何实验室制造的一种廉价的低温阶段。这冷冻LM阶段的目的是反映装有长工作距离的空中目标的光学显微镜的使用。对于相关的冷冻LM和冷冻电镜研究，我们适应标本支持使用碳涂层标准的3毫米的冷冻电镜电网。网格吸附样品后，vitrifying样品和转让/处理电网先前建立的协议之后，允许多技术成像。因此，此设置允许任何一个反射光显微镜实验室有直接相关的冷冻水合样品成像。
Protocol
1。制造和装配
- 广场内的22.96厘米（9“）馅饼泛泛一边约2厘米，如图1c所示，使用一个黑色的记号笔，铝散热器的标志孔注铝散热器。铝块（在本地废旧金属店或在网上购买http://www.onlinemetals.com ）不与预钻孔，您将需要安排有洞钻，埋头前第1步，以确保铝块馅饼泛，我们采用5孔，以确保块平台和4个额外的孔，让氮气泡沫从铝下逃生。
- 广场的铝质散热片的位置附近的冷冻格框和马克的缺口，每个侧面。
- 每个标记的位置，使用＃17钻铝散热器安装孔位＃35钻头和冷冻格箱孔钻导向孔。
- 摩的铝质散热片，用5 - ＃10，1.9厘米（3 / 4“）的平头开槽螺栓和相应的螺母，以及15 - 10号垫圈放置两个垫圈下方的铝块和第三的背面。 。馅饼泛每孔注：观赏区附近的铝块的无抵押出挑可以导致振动限制成像能力的阶段检查，以确保所有的安装螺栓拧紧。
- 从锅饼作为冷冻格箱装载的背面，插入3 - ＃4，0.95厘米（3 / 8“）轮开槽螺栓和相应的螺母。
- 磁带4筷子之上另一个用筷子对。磁带每对相对边缘的蛋糕盘作为垫片。
- 湿的蛋糕和馅饼的顶部和底部表面盘分别与DDH 2 O 。
- 两层绝缘喷涂泡沫填充蛋糕盘。润湿前准备进行下一个步骤，每一层。
- 按泡沫的馅饼泛。
- 倒挂的平底锅翻转，蛋糕上的泛按，直到垫片接触的馅饼盘。放置任何上盖蛋糕盘的加权对象，让坐在一夜之间治愈。
- 锯齿刀，切掉多余的干喷涂泡沫保温锅的边缘，取出筷子。
- 删除从馅饼盘蛋糕盘。铝散热器的馅饼泛现在是绝缘的，将被称为“低温阶段”（图1A）。
- 剪贴板在低温阶段顶部放置一个透明的塑料（任何颜色和大于3毫米厚）。马克用黑色标记的冷冻格箱安装位置画一个圆圈，直径约1.5倍的单轮冷冻格框。剪出一个1.9厘米（3 / 4“）的孔，孔锯剪贴板将称为”载入画面“（图1b）。
- 之上直属物镜与散热器的低温阶段，并在显微镜放在一个新的透明剪贴板。一个黑色的标记，标记的目标的路径，因为它们旋转。
- 剪切清除剪贴板的边缘半圈沿标记线。这可以完成拼图或使用一个7.62厘米（3“）孔锯多次在视频所示。
- 最后远离了半圈，但仍然菜面积内切一个1.9厘米的洞（3 / 4“），这将是该端口加气站液氮（LN 2）如果水平下降，而成像，这将被称为剪贴板“查看屏幕”（图1C）。
2。样品制备
- 淡化对数期酵母细胞合成完整的（SC）的媒体发展到一个适当的浓度为1 × 10 6细胞/毫升在水中。
- 2毫升稀释后的酵母吸管到R2 / 1 400目多孔碳包覆铜冷冻电镜网格（SPI用品，西切斯特，PA），并允许15秒吸附。
- 通过触摸发车2秒（Kimwipe）的软纤维组织撕裂一块远离电网的表面吸干多余的液体。
- 如果有必要，电网的可洗3μL的水珠（1-3倍），而恶人在第3步，从后面的印迹。
- 之前的最后一次洗涤，样品装入气动暴跌冷冻和挂网冲在步骤2.4。印迹用纸巾撕裂（Kimwipe），以去除表面的水大部分电网后，电网陷入液氮冷却的液态乙烷和转移到冷冻格框为储存 1注 ：重要的是要表面上留下一层液体，保持样品的水分尽可能薄。不适当的印迹，将干出来的样品，或离开冰是不透明的电子束。
3。低温光显微镜
- 填写的低温阶段，LN 2，并迅速覆盖载入画面（单1.9厘米（3 / 4“）孔的塑料剪贴板） 。
- 一旦金属达到液氮温度，通过1.9厘米（3 / 4“）加载屏幕孔，并安装到转移部分A5所描述的3个螺丝创建传输的冷冻格框。拧下的冷冻格框其持有人持有，以提高访问和删除，保持在3.10步之前单独杜瓦液氮下的冷冻格框持有。冷冻格框也应根据液氮保存，以防止样品电网变暖。
- 。笔芯在低温级的铝质散热片的顶部略低于第 2注 ：LN 2的水平，必须定期检查，并在成像过程中进行重新充装，以确保LN 2与散热片接触 不断。在一般情况下，加气发生在观看屏幕每隔10分钟通过填写端口。
- 预冷的镊子尖2号法律公告，然后转移到平 坦的观赏面的铝质散热片用镊子您的网格（S），使用1.9厘米（3 / 4“）加载屏幕孔。
- 小心移动的低温阶段下的反射光显微镜的客观光圈。
- 将透明上盖的载入画面观看屏幕。观看屏幕注意下方滑动，然后慢慢松开载入画面 ：在这一点上，样品是最脆弱的。显微镜周围所有的空气电流应尽量减少，包括：呼吸，附近一开门，人走过去，等我们建议戴口罩，或挂一个透明的面罩，作为一项预防措施，在显微镜目镜以下。
- 进入寒冷的气体环境中氮的低温阶段和扫描样品在平面上的散热器可视面积旋转的物镜。使用低倍率的客观标准的明场光学显微镜技术，重点对电网的中心，并采取概览图像。本实验所用的光学显微镜镜头的规格就列出了部分实验材料注 ：LN 2不接触物镜和冷却的影响，我们还没有看到的图像退化或损坏的镜片。
- 感兴趣的领域和重点在高放大倍率，明场，暗场，偏振光或荧光成像获取数据。可以肯定的感兴趣的区域的位置上记录的低倍率为未来相关的明场像。如果所有上面列出加气站LN 2的注意事项，然后从蒸发氮的正压力足以维持一个无污染的环境（独立室内湿度）的成像时间。
- 完成后，取代加载屏幕，在观看屏幕的顶部滑动。删除放缓载入画面下方滑动，观看屏幕。
- 从显微镜中删除的低温阶段，预冷的镊子，传输电网的冷冻格框。到冷冻格箱的冷冻格框支架螺丝密封对环境和存储和未来成像的持有人转移到液氮杜瓦。
4。低温电子显微镜
- 标准和技术成熟之后，装入一个冷冻电镜转让持有的样品电网，同时保持在任何时候都液氮温度下的标本。
- 透射电子显微镜样品电网插入冷冻人。
- 在一个合适的低倍率查看（50 - 500X标称的放大倍率），发现样本电网的中心。
- 使用以前收集的低倍率从步骤3.7冷冻LM数据，以确定电网的中央铜标签的相对取向（如在图2中所述），并确定相关利益的具体领域。
- 继续显微镜对齐，低剂量的冷冻电镜成像和数据收集。
5。代表性的成果
低温阶段（图1A）是一种有效的方式来收集冷冻LM低温荧光显微镜及相关cryo-LM/cryo-EM分析数据。图2显示了如何在低和高放大倍率的冷冻LM图像的组合，使您可以构建参考地图，你直接在冷冻电镜的具体领域。由此产生的冷冻LM参考图（图2b）是利用冷冻电镜数据采集期间找到在图3所示的确切地区。
图1 低温级 ）的低温阶段的布局由一个挂载表示瓦特的冷冻格箱转移第i个白色箭头和铝散热器。网格转2号法律公告，从冷冻格框，直接放置在散热器的可视面积的黑色箭头表示 B）图片描绘了载入画面的低温阶段。载入画面中的孔是直接放置在冷冻格箱安装和行为，作为一个港口转移样品和样品散热器用镊子从冷冻格中移动样品可视面积 。 C）低温在观看屏幕的物镜下阶段的位置。观看屏幕上的特殊切口，使物镜容易进入的位置不移动的低温阶段摆动。在观看屏幕远离样本区的孔行为填写端口，以补充LN 2的水平，如果有必要 ，作为LN 2。
图2。 冷冻- LM导航相关研究。A）低倍率酵母细胞冷冻LM坚持一个样品电网。B）相同的图像（一）在高放大倍率的荧光图像感兴趣的领域覆盖标志着一个充满橙色多边形样本电网的中心。该中心由一组4个广场，有一个额外的金属片，并提出开放三。对于一个额外的金属片的三个广场，两对共享的长期和短期形成一个非对称中心轴的标签。左上角可以看出，在这种不对称的中心，是用来表示旋转的角度和电网之间的冷冻- LM和冷冻电镜的霸道。从一个低倍率的形象感兴趣的许多领域可以被标记，并用来作为参考图冷冻电镜定位在相同的地区。C）放大的荧光冷冻LM感兴趣的区域的图像（b）中。 HTA1 - CFP，C -末端CFP组蛋白标记，可以看到一个绿色的点状结构标记细胞核的位置。d）对相应区域的冷冻电镜图像（C）。标尺代表 50微米。
图3。 冷冻- LM和冷冻电镜的相关性。领域的观点，描绘了相同的酵母细胞相关冷冻明场（A，D），低温荧光（B，E），和冷冻电镜（C，F ）。 比例尺代表5微米。
Discussion
Disclosures
作者声明没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
作者衷心感谢布兰登J. Zipp和肯B.卡普兰在这项研究中所使用的酵母菌株提供访问。作者还感谢胡里奥列宁多明格斯，拉米雷斯与摄录援助。高考承认授予数量5RC1GM91755从美国国立卫生研究院的资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 – 22.86 cm (9") pie pan with sloped edge | Good Cook | Local grocery store | |
| 1 – 22.86 cm (9") cake pan | Good Cook | Local grocery store | |
| 4 pairs of chopsticks | Local grocery store | ||
| 1 - Great Stuff spray foam | Great Stuff | Local hardware store | |
| 1 - 4cm x8cm x1cm block of aluminum | Local hardware store or metal scrap yard | ||
| 5 - #10 1.91 cm (3/4") flat head slotted bolts w/ nuts | Local hardware store | ||
| 3 - #4 0.95 cm (3/8") round slotted bolts w/ nuts | Local hardware store | ||
| 15 - #10 washers | Local hardware store | ||
| 2 - transparent plastic clipboards | Local office store | ||
| 1 - Cryo-EM grid box holder | Ted Pella | 160-41 | |
| 1 - Cryo-EM grid box handling rod | Ted Pella | 160-46 | |
| 1 - R2/1 holey carbon film, 400-mesh copper cryo-EM support grid | SPI Supplies | 4340C-XA | |
Experimental materials |
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References
- Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of vitrified biological speciments. Trends Biochem. Sci. 10, 143-146 (1985).
- Plitzko, J. M., Rigort, A., Leis, A. Correlative cryo-light microscopy and cryo-electron tomography: from cellular territories to molecular landscapes. Curr Opin Biotechnol. 20, 83-89 (2009).
- Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching. J Microsc. 227, 98-109 (2007).
- Lepper, S., Merkel, M., Sartori, A., Cyrklaff, M., Frischknecht, F. Rapid quantification of the effects of blotting for correlation of light and cryo-light microscopy images. J Microsc. 238, 21-26 (2010).
- Sartori, A. Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography. J Struct Biol. 160, 135-145 (2007).
- McDonald, K. L. A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues. J Microsc. 235, 273-281 (2009).
- van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells. Eur J Cell Biol. 88, 669-684 (2009).
- Gaietta, G. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science. 296, 503-507 (2002).
- Sosinsky, G. E., Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Gaietta, G. M., Ellisman, M. H. Markers for correlated light and electron microscopy. Methods Cell Biol. 79, 575-591 (2007).
