Summary
Vi visar tillverkning av en låg kostnad kryogenisk steg för att passa de flesta reflekterat ljus mikroskop. Detta lab-byggda kryogen skede möjliggör effektiva och pålitliga korrelat avbildning mellan Cryo-ljus och Cryo-elektronmikroskopi.
Abstract
Kopplingen av Cryo-ljusmikroskop (Cryo-LM) och Cryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM) innebär en rad fördelar för att förstå cellulära dynamik och ultrastruktur. Första kan celler avbildas i en nära infödd miljö för båda teknikerna. För det andra, på grund av förglasning process, prover konserverade med snabb fysisk immobilisering snarare än långsam kemisk fixering. Tredje, bildhantering samma prov med både Cryo-LM och Cryo-EM ger korrelation av data från en enda cell, snarare än en jämförelse av "representativa". Medan dessa fördelar är väl kända från tidigare studier, den utbredda användningen av korrelat Cryo-LM och Cryo-EM är fortfarande begränsad på grund av den kostnad och komplexitet för att köpa eller bygga en lämplig kryogen skede ljusmikroskop. Här kan vi visa på montering och användning av en billig kryogen skede som kan tillverkas i något labb för mindre än $ 40 med delar finns på lokala hård-och livsmedelsbutiker. Detta Cryo-LM steg är konstruerad för användning med reflekterat ljus mikroskop som är utrustade med långa arbetsdagar målen avstånd luft. För korrelat Cryo-LM och Cryo-EM studier, anpassar vi användning av kol belagda standard 3-mm Cryo-EM nät som prov stöder. Efter adsorbera provet till nätet, är tidigare fastställda protokoll för vitrifying provet och överför / hantering nätet följas för att tillåta flera tekniken avbildning. Som ett resultat kan denna inställning något laboratorium med ett reflekterat ljus mikroskop för att ha tillgång till direkt korrelat avbildning av fryst hydratiserad prover.
Protocol
1. Tillverkning och montering
- Placera diskhon aluminium inuti 22,96 cm (9 ") pie pan ca 2 cm från sidan av pannan, enligt figur 1c använder en svart tuschpenna, markera hål för aluminium-kylfläns OBS:.. Om aluminium blocket (köpt på en lokal skrot butik eller online på http://www.onlinemetals.com ) inte kommer med förborrade hål, måste du låta hål borrade och försänkta före steg 1 för att säkra aluminium block till pie pan. Vi brukade 5 hål för att fästa blocket till plattformen och 4 extra hål för att kvävgas bubblor fly från under aluminium.
- Placera Cryo-nätet box nära platsen för aluminium-kylfläns och markera skåran och varje sida.
- Borra hål för varje markerad position med en # 17 borr för diskhon aluminium hål och en # 35 borr för Cryo-grid box hål.
- Montera diskhon aluminium med 5 - # 10, 1,9 cm (3 / 4 ") platt huvud slitsade bultar och motsvarande nötter samt 15 - # 10 brickor Placera två brickor under aluminiumblock och den tredje på baksidan av. pie pan för varje hål. OBS: Osäker överhäng av aluminiumblock nära visningsområdet kan resultera i vibrationer som begränsar bildhanteringsfunktioner av scenen Kontrollera att alla bultar är ordentligt åtdragna..
- Sätt in 3 - # 4, 0,95 cm (3 / 8 ") runt slitsade bultar och motsvarande muttrarna från baksidan av kakan pan att agera som Cryo-grid box fäste.
- Tejpa 4 ätpinnar tillsammans i par med en chopstick ovanpå varandra. Tejpa varje par motsatta kanter av kakan pannan att fungera som distanser.
- Blöt den övre och nedre ytan på kakan och paj kastruller respektive med DDH 2 O.
- Fyll tårta pan med två lager av isolerande spray skum. Vätning varje lager innan du går vidare till nästa steg.
- Tryck pie pan in i skummet.
- Vänd på kastruller upp och ned och tryck på tårta pan tills distanserna kontakta pie pan. Placera en vägd föremål ovanpå tårtan pannan och låt sitta över natten för att bota.
- Med en räfflad kniv, skär bort överflödigt torkat isolerande spray skum från kanten av kastruller och ta bort ätpinnar.
- Ta ut kakan pannan från pie pan. Det paj pan med aluminium kylfläns är nu isolerad och kommer att kallas "kryogen stage" (Fig 1a).
- Placera en genomskinlig plast urklipp (valfri färg och större än 3 mm tjock) under början av det kylmedium scenen. Markera med en svart markör placeringen av Cryo-nätet box monteras genom att rita en cirkel cirka 1,5 gånger diametern på en enda runda Cryo-grid rutan. Skär ut hålet med en 1,9 cm (3 / 4 ") hålsåg. Detta Urklipp kommer att hänvisas till som" loading screen "(Fig 1b).
- Sätt ett nytt transparent Windows urklipp toppen av kryogeniska scenen och plats på mikroskop med kylflänsen direkt under objektiv. Med en svart markör, markera sökvägen till mål som de roterar.
- Klipp längs den markerade linjen att ta bort en halvcirkel från kanten av klippbordet. Detta kan göras med en figursåg eller med hjälp av en 7,62 cm (3 ") hålsåg flera gånger som visas i videon.
- Slutligen skär en 1,9 cm (3 / 4 ") hålet bort från halv cirkeln, men fortfarande inom det område av skålen. Detta kommer att vara hamnen för att fylla på flytande kväve (LN 2) om sjunker medan bildbehandling. Kommer här Clipboard hänvisas till som "bildskärm" (fig 1c).
2. Provberedning
- Späd logga celler fas jästen odlas i syntetiska komplett (SC) media till en lämplig koncentration av 1x10 6 celler / ml i vatten.
- 2 ml av det utspädda jäst pipetteras på en R2 / 1 400 mesh Holey kol belagt koppar Cryo-EM nätet (SPI Supplies, West Chester, PA) och tillåts adsorbera i 15 sekunder.
- Blot bort överflödig vätska från nätet ytan genom att trycka på baksidan av nätet till en sönderriven bit mjuk cellulosa vävnad (Kimwipe) i 2 sekunder.
- Vid behov kan gallret tvättas med 3 mikroliter droppar vatten (1-3 gånger), och ogudaktiga bort som i steg 3 genom att blotting från baksidan.
- Innan den sista tvätten skall provet laddas i pneumatiska steget frysen och den hängande nätet tvättas som i steg 2,4. Efter blotting nätet med sönderrivna papper (Kimwipe) för att ta bort merparten av vattnet från ytan, är nätet kastats in lN 2 kyld flytande etan och överförs till en Cryo-grid box för förvaring 1. OBS: Det är viktigt att Lämna ett lager av flytande så tunt som möjligt på ytan för att hålla provet hydrerad. Felaktig blotting kommer antingen torka ut provet eller lämna isen som är ogenomskinlig för elektronstrålen.
3. Cryo-ljusmikroskopi
- Fyll kryogen scenen medlN 2 och täcker snabbt med lastning skärm (plast urklippet med enstaka 1,9 cm (3 / 4 ") hål).
- När metallen når lN 2 temperatur, överföra Cryo-nätet box via 1,9 cm (3 / 4 ") hålet på lastning skärmen och i överföringen montera som skapats av de 3 skruvarna som beskrivs i del A5. Skruva av Cryo-nätet box från hållaren och ta bort hållaren för bättre åtkomst. Håll Cryo-nätet rutan har rätt till enligt lN 2 i ett separat Dewar fram steg 3,10. Cryo-grid box bör också hållas under lN 2 för att förhindra uppvärmningen prov nätet.
- . Refill lN 2 i kryogena steg till strax under toppen av aluminium kylfläns OBS: ln 2 nivåer regelbundet måste kontrolleras och fyllas på under imaging process för att säkerställa lN 2 är kontinuerligt i kontakt med kylfläns. I allmänhet inträffar påfyllning var 10 minuter genom att fylla porten i bildskärm.
- Förkyla pincett spetsen i LN 2 och sedan överföra dina nätet (s) på den plana visning ytan av aluminium kylfläns med pincett, med 1,9 cm (3 / 4 ") hålet på lastning skärmen.
- Försiktigt flytta Cryo-scenen för att under det reflekterade ljuset mikroskop mål öppningar.
- Placera den genomskinliga bildskärm ovanpå lastning skärmen. Sedan sakta ut lastning skärmen genom att skjuta det under bildskärm. OBS: I detta läge är provet mest utsatta. All luft strömmar runt mikroskop bör minimeras, inklusive: andning, en närliggande dörröppning, människor som gick förbi, etc. Vi föreslår bär ansiktsmask eller hängande en transparent visir under mikroskop okular som en försiktighetsåtgärd.
- Vrid objektiv i kylan kvävgas miljö Cryo-scenen och söka efter provet på platt kylfläns visningsområdet. Med vanliga ljusa fält ljusmikroskop tekniker fokusera på nätet med en låg förstoring mål att hitta centrum och ta en översiktsbild. Specifikationerna för ljusmikroskopi linser används för detta experiment återfinns i experimentell Material avsnittet Obs:. LN 2 inte kommer i kontakt med objektiv och vi har ännu inte sett nedbrytning av bilder eller skador på linser från effekterna av avsvalning .
- Fokus i hög förstoring på ett område av intresse och få uppgifter med ljusa fält, mörkt fält, polariserat ljus eller fluorescens avbildning. Var noga med att registrera platsen för området av intresse på låg förstoring ljusa fält på bilden för en framtida korrelation. Om alla försiktighetsåtgärder som anges ovan för påfyllning av lN 2 följs, då det positiva trycket från avdunstar kväve är tillräcklig för att upprätthålla en förorening fri miljö (oberoende av rummets luftfuktighet) för den tid som avbildning.
- När du är klar, byt ut lastning skärmen genom att skjuta den över toppen på bildskärm. Ta bort visningsskärmen genom att sakta dra den under lastning skärmen.
- Ta bort Cryo scenen från mikroskopet och med nedkylda pincett, överföring nätet tillbaka till Cryo-grid rutan. Skruva fast Cryo-nätet box hållaren i Cryo-nätet rutan för att täta mot miljön och överföra innehavaren till en LN2 Dewar för lagring och framtida avbildning.
4. Cryo-elektronmikroskopi
- Efter standard och etablerade tekniker, ladda provet nätet i en Cryo-EM transfer innehavaren samtidigt hålla provet i flytande kväve temperatur hela tiden.
- Sätt Cryo-hållaren med provet nätet till ett transmissionselektronmikroskop.
- I en passande låg förstoring för (50-500x nominella förstoring), hitta centrum av provet nätet.
- Använd de tidigare insamlade låg förstoring Cryo-LM uppgifter från steg 3,7 för att bestämma den relativa orienteringen av rutnätet centrala koppar flikar (som beskrivs i figur 2) och identifiera exakta områden av intresse för korrelation.
- Fortsätt med mikroskop anpassning, låg dos Cryo-EM imaging och datainsamling.
5. Representativa resultat
Det kylmedium stadium (Fig 1a) är ett effektivt sätt att samla Cryo-LM data för Cryo-fluorescensmikroskopi och korrelat cryo-LM/cryo-EM analys. Figur 2 visar hur en kombination av låg och hög förstoring Cryo-LM-bilder kan du skapa referens kartor som dig till specifika områden i Cryo-EM. Den resulterande Cryo-LM referens karta (figur 2b) har utnyttjats under Cryo-EM datainsamling för att lokalisera exakt områden visas i figur 3.
Figur 1. Kryogena scenen. A) layout kryogen stadiet består av en Cryo-grid låda överför montera anges wed en vit pil och en aluminium kylfläns. Galler har överlåtits enligt lN 2 från Cryo-grid boxen och placeras direkt på kylflänsen är bildyta som anges av den svarta pilen. B) Bilden skildrar det kylmedium scenen med lastning skärmen. Hålet i lastning skärmen är placerad direkt över Cryo-grid box montera och fungerar som en port för att överföra prover och för att flytta prover från Cryo-nätet rutan till provet visningsområdet på kylflänsen med en pincett. C) det kylmedium skede i position under objektiv med bildskärm på plats. Den speciella cutout på bildskärm gör att objektiv för att enkelt svänga på plats utan att flytta det kylmedium scenen. Hålet i bildskärm bort från provet området fungerar som en lN 2 påfyllningsöppningen att fylla lN 2 nivåer om det behövs.
Figur 2. Navigera i Cryo-LM för korrelativa studier. A) låg förstoring Cryo-LM bild av jästceller följas ett prov rutnät. B) Samma bild i (a) belagd med en hög förstoring fluorescens bild av ett område av intresse och med en fylld apelsin polygon-märkning i mitten av provet nätet. Centrum består av en grupp av fyra rutor, tre att ha en extra metal-fliken och den fjärde öppen. För de tre rutor med extra metall fliken två par dela på fliken om den långa och korta axlar bildar en asymmetrisk centrum. Denna asymmetriska centret kan ses i övre vänstra hörnet och användes för att indikera rotationsvinkeln och godtycke i nätet mellan Cryo-LM och Cryo-EM. Från en låg många förstoring bilden intressanta områden kan markeras och användas som en referens karta för att hitta identiska områden i Cryo-EM. C) En förstorad fluorescens Cryo-LM bild av området av intresse i (b). HTA1-fiskeripolitiken, en C-terminal GFP histon markör, kan ses som en grön punktuell struktur märkning var kärnan. D) Ett Cryo-EM bild av motsvarande område i (c). Skala staplarna representerar 50 mikrometer.
Figur 3. Korrelation av Cryo-LM och Cryo-EM. Två synfält som skildrar identiska jästceller korrelerade med Cryo-ljusa fält (A, D), kryo-fluorescens (B, E) och Cryo-EM (C, F ). Scale stapel 5 mikrometer.
Discussion
Disclosures
Författarna förklarar ingen konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Brandon J. Zipp och Ken B. Kaplan för att ge tillgång till jästen stam som använts i denna studie. Författarna tackar också Julio Lenin Dominguez-Ramirez för hjälp med videofilmning. JEE erkänner NIH finansiering stöd från licensnummer 5RC1GM91755.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 – 22.86 cm (9") pie pan with sloped edge | Good Cook | Local grocery store | |
| 1 – 22.86 cm (9") cake pan | Good Cook | Local grocery store | |
| 4 pairs of chopsticks | Local grocery store | ||
| 1 - Great Stuff spray foam | Great Stuff | Local hardware store | |
| 1 - 4cm x8cm x1cm block of aluminum | Local hardware store or metal scrap yard | ||
| 5 - #10 1.91 cm (3/4") flat head slotted bolts w/ nuts | Local hardware store | ||
| 3 - #4 0.95 cm (3/8") round slotted bolts w/ nuts | Local hardware store | ||
| 15 - #10 washers | Local hardware store | ||
| 2 - transparent plastic clipboards | Local office store | ||
| 1 - Cryo-EM grid box holder | Ted Pella | 160-41 | |
| 1 - Cryo-EM grid box handling rod | Ted Pella | 160-46 | |
| 1 - R2/1 holey carbon film, 400-mesh copper cryo-EM support grid | SPI Supplies | 4340C-XA | |
Experimental materials |
|||
|
|||
References
- Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of vitrified biological speciments. Trends Biochem. Sci. 10, 143-146 (1985).
- Plitzko, J. M., Rigort, A., Leis, A. Correlative cryo-light microscopy and cryo-electron tomography: from cellular territories to molecular landscapes. Curr Opin Biotechnol. 20, 83-89 (2009).
- Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching. J Microsc. 227, 98-109 (2007).
- Lepper, S., Merkel, M., Sartori, A., Cyrklaff, M., Frischknecht, F. Rapid quantification of the effects of blotting for correlation of light and cryo-light microscopy images. J Microsc. 238, 21-26 (2010).
- Sartori, A. Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography. J Struct Biol. 160, 135-145 (2007).
- McDonald, K. L. A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues. J Microsc. 235, 273-281 (2009).
- van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells. Eur J Cell Biol. 88, 669-684 (2009).
- Gaietta, G. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science. 296, 503-507 (2002).
- Sosinsky, G. E., Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Gaietta, G. M., Ellisman, M. H. Markers for correlated light and electron microscopy. Methods Cell Biol. 79, 575-591 (2007).
