Summary
صلابة من المصفوفة خارج الخلية يؤثر بشدة السلوكيات متعددة من الخلايا الملتصقة. مصفوفة صلابة يختلف مكانيا في جميع أنحاء الأنسجة ، ويخضع لتعديل في الحالات المرضية المختلفة. نحن هنا لتطوير أساليب تميز الاختلافات المكانية في صلابة في الحالات العادية وتليفي الماوس أنسجة الرئة باستخدام المجهر الذري microindentation القوة.
Abstract
مصفوفة الصلابة تؤثر تأثيرا قويا النمو ، والتمايز وظيفة الخلايا الملتصقة 1-3. على المستوى الكلي للتصلب الأنسجة والأعضاء داخل الجسم البشري تمتد عدة أوامر من حجم 4. لا يعرف الكثير الكثير عن كيفية تصلب الأنسجة يختلف مكانيا داخل ، وما هو نطاق وحجم التغيرات المكانية وصلابة في عمليات المرض التي تؤدي إلى إعادة تشكيل الأنسجة. إلى فهم أفضل لكيفية التغيرات في صلابة مصفوفة تسهم في الفيزيولوجيا الخلوية في الصحة والمرض ، وهناك حاجة إلى تصلب الأنسجة من القياسات التي تم الحصول عليها على نطاق والمكانية ذات الصلة على الخلايا المقيمين. هذا صحيح لا سيما بالنسبة لسرطان الرئة ، وأنسجة متوافقة للغاية ومرنة في إعادة تشكيل المصفوفة الذي هو سمة بارزة في أمراض مثل الربو ارتفاع ضغط الدم وانتفاخ الرئة والتليف. لتحديد خصائص البيئة المحلية الميكانيكية لحمة الرئة على نطاق والمكانية ذات الصلة على الخلايا المقيمين ، وقمنا بتطوير أساليب مباشرة لقياس الخصائص المحلية المرنة من الفئران الطازجة أنسجة الرئة باستخدام المجهر قوة نووية (فؤاد) microindentation. مع الاختيار المناسب للINDENTOR فؤاد ، ناتئ ، وعمق المسافة البادئة ، وهذه الأساليب تسمح القياسات المحلية معامل نسيج القص بالتوازي مع المرحلة وعلى النقيض من التصوير مضان المنطقة من الفائدة. أخذ عينات منتظمة من شرائط نسيج توفر خرائط لخصائص الأنسجة الميكانيكية التي تكشف الاختلافات المكانية المحلية في معامل القص. الارتباط بين الخواص الميكانيكية والكامنة الميزات التشريحية والمرضية لتوضيح كيفية صلابة يختلف مع ترسب مصفوفة في التليف. ويمكن تمديد هذه الأساليب إلى الأنسجة اللينة والعمليات الأخرى للكشف عن المرض كيف الخصائص الميكانيكية النسيج المحلية تختلف باختلاف المكان وتطور المرض.
Protocol
1. تحضير نسيج الرئة قطاع
- أنسجة الرئة متوافق للغاية ويصعب مقطعة إلى شرائح لتوصيف فؤاد. عابر لتحقيق الاستقرار في بنية الرئة لتقطيع ، تضخيم الرئتين الماوس معزولة intratracheally مع وزن الجسم 50 مل / كغ من 2 ٪ منخفضة نقطة agarose هلام (المعد في برنامج تلفزيوني) تحسنت إلى 37 درجة مئوية. التعادل خارج القصبة الهوائية والرئتين تهدئة مضخمة في حمام من برنامج تلفزيوني في 4 لمدة 60 دقيقة درجة مئوية. سوف agarose هلام ، وتشديد في الأجواء لتحقيق الاستقرار في الهيكل برفق الرئة خلال هذا الفاصل الزمني 5. ويمكن استخدام تركيزات أعلى agarose ، 3-4 ٪ ، أي لمواصلة تعزيز الاستقرار الأنسجة لعدة قطاعات.
- قطع الرئة الماوس agarose استقرت الأنسجة بشفرة الحلاقة أو شفرة المشرط إلى شرائح من 5 × 5 ملم في الطول والعرض و 400 ميكرومتر في السمك ، ثم تغسل الشرائط في حمام PBS مسبقا إلى درجة حرارة 37 درجة مئوية باستخدام 100 مل الدورق الزجاجي على مقعد في قمة ساخنة لوحة يحرك لمدة 5 دقائق لإزالة agarose المتبقية. استبعاد الهوائية الكبيرة والسفن ، وقطع شرائح من مناطق بعيدة عن الشعب الهوائية تحت الجنبة الجذعية الرئيسية. إذا الهوائية والسفن الكبيرة وسيتم تصويرها ، وقطع شرائح من أنسجة الرئة أكثر الأقرب إلى الشعب الهوائية الجذعية الرئيسية.
2. فؤاد Microindentation والتصوير الإسفار
- لعزل المناطق التي تهم microindentation فؤاد ، يمكن تصور الأنسجة بواسطة المجهر النقيض من المرحلة ، أو تصور وimmunostained بواسطة المجهر مضان. لimmunostaining ، كتلة شرائح الأنسجة مع 5 ٪ من مصل مصدر الأجسام المضادة الثانوية المطلوبة (في برنامج تلفزيوني) لمدة 2 ساعة دون تثبيت أو permeabilization في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان قطاع النسيج مع الأجسام المضادة الأولية المناسبة (مثل أرنب المضادة للالكولاجين الأول لتصور الكولاجين خلالي (1:250 تمييع) ، الأرنب مكافحة laminin (1:250 التخفيف) لتصور الغشاء القاعدي) في بئر لوحة 12 - جيدا على الكرسي الهزاز مع اهتزاز لطيف لمدة 1 ساعة ، وغسل العينة 3 مرات لمدة 5 دقائق مع كل برنامج تلفزيوني ، تليها الضد الثانوية مترافق المناسبة لوضع علامة فلوري (مثل اليكسا فلور 546 الماعز المضادة للأرنب الضد الثانوية (1:250 تمييع)) : 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- تغسل شرائح الأنسجة على نطاق واسع مع برنامج تلفزيوني وتخزينها في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية
- مباشرة قبل توصيف فؤاد ، إرفاق الشريط الأنسجة إلى ساترة من عيار 15 ملم بولي - L - يسين المغلفة برفع ساترة من تحت النسيج العائمة ، والتأكد من الشريط الأنسجة ينتشر بالتساوي على سطح ساترة ، وإذا لزم الأمر ، شطيرة الشريط مع نظيف الثانية ، غير المصقول ساترة والضغط الخفيف للمساعدة في رباط أنسجة إلى ساترة بولي - L - يسين المغلفة.
- معايرة نظام AFM التعليمات التالية للتصنيع على الفور قبل كل جولة من التجارب microindentation. تحديد معلمتين الحرجة : 1) فصل الربيع ناتئ المستمر باستخدام الأسلوب تقلبات الحرارية في الهواء 6 ، و، 2) حساسية انحراف ناتئ ، وهو المعلمة المستخدمة لقياس إشارة خرج الثنائي الضوئي لمسافة ناتئ انحراف الفعلية ، Δd. معايرة حساسية انحراف عن طريق الحصول على مستوى قوة إزاحة المنحنى في برنامج تلفزيوني على شريحة زجاجية نظيفة ثم حساب المنحدر من منحنى القوة التشريد (Fig.1B). في قياس منحنى القوة التشريد ، تمتد نحو غيض فؤاد وتراجع من سطح العينة في مكان واحد (بدون rastering في اتجاهات XY) ، مع انحراف للناتئ ، Δd ، رصدت بوصفها وظيفة من التشرد الطرف ، Δz .
ونحن نوصي باستخدام مثلث ناتئ نيتريد السيليكون مع 5 ميكرون قطر الحافة كروية البورسليكات (Novascan). باستخدام المسابر فؤاد مع الربيع الدائم 0.06 نيوتن / متر ، وتتميز نحن ميكانيكيا مواد لينة مع moduli القص الممتدة من 100 إلى 50000 باسكال.
- يمسح السطح السفلي من ساترة عينة مع المناديل الورقية ، إلى ربط شريحة زجاجية قياسية مع الشحوم فراغ ، تركيب شريحة زجاجية على المسرح عينة فؤاد ، وتغطية الأنسجة مع 500 ميكرولتر PBS (درجة حرارة الغرفة).
- تعيين لمجهر العين قطعة عرض لمحاذاة الطرف فؤاد في مركز مجال الرؤية عن طريق ضبط عينة المرحلة المجهر. اختيار مساحة الفائدة على الأنسجة التي تتحرك في المرحلة عينة فؤاد ، ثم التبديل إلى كاميرا CCD عرض لتسجيل صورة النقيض من المرحلة و / أو صور مضان من الأنسجة ، وعلى النحو المرغوب فيه.
- أداء قياسي عملية انخراط فؤاد بتحريك طرف فؤاد ببطء إلى أسفل حتى يتم في اتصال مع العينة.
- توصيف دقيق microindentation فؤاد عينات الناعمة يتطلب عمق المسافة البادئة صغيرة لتفادي الضغوط المحلية الكبيرة التي يبطل النموذج هيرتز تستخدم لحساب معامل المرونة. لتجنب توترات كبيرة ، نفذ المسافة البادئة في وضع الزناد عن طريق تحديد الحد الأقصى للانحراف ناتئ (نقطة الزناد) إلى 500 نانومتر. وهذا الحد كبح انحرافأقصى قوة المسافة البادئة إلى أقل من 30 NN (F = الربيع ناتئ النزوح المستمر * ، أو كحد أقصى F = 0.06 ن ن / ن م * 500 = 30 نانومتر NN).
يجب أن يتم تحديد سرعة المسافة البادئة لتكون بطيئة بما فيه الكفاية لاستكشاف الخصائص اللزجة مرنة بدلا من العينة لينة 7. وهناك مجموعة من السرعة 2-20 ميكرون في الثانية مناسبة لأنسجة الرئة.
- لقياس واحد من منطقة المصالح ، ونقل التحقيق إلى موقع AFM من الاهتمام وإجراء تسنن واحد أن يحصل على معيار القوة التشريد منحنى (المسبار يتحرك فقط في الاتجاه دون Z - المسح XY).
- الآلي لرسم خرائط لمنطقة المصالح ، والتحول إلى قوة ، خريطة واسطة ، وتحديد حجم عينة المسح وجهات داخل المنطقة المحددة. القوة في خارطة الوضع ، المنقطات غيض فؤاد عبر سطح العينة بين الحركات المسافة البادئة ، ويجمع الفرد بالقوة تشريد المنحنيات عند كل نقطة ضمن الشبكة عينة محددة. وسوف توفر المزيد من نقاط أخذ العينات أعلى المكاني القرار ولكن إطالة الوقت اللازم لرسم الخرائط. وجدنا أن العملية لاستخدام الشبكة 16 × 16 عينة من 80 إلى الخريطة X 80 ميكرون المنطقة في سرعة المسافة البادئة من 20 ميكرون في الثانية الواحدة ، والتي يمكن الانتهاء منها في 10 دقيقة ~.
3. فؤاد استخراج البيانات
- لحساب معامل للشباب ، وتناسب منحنى القوة التشريد لنموذج البادئة كروية هيرتز باستخدام المربعات الصغرى غير الخطية المناسب التقويس 8 (Fig.1 A ، C) :
حيث F = ك ج * Δ د ، هو القوة لثني ناتئ ، ك ج هو الربيع ناتئ المستمر ، والبحث هو المجال قطرها الطرف ، δ = Δ ض -- Δ د هي البادئة وυ هو العينة نسبة بواسون (υ = 0.4 لأنسجة الرئة 9). - لتقييم نوعية تناسب ، وحساب قيمة الاشتراكية السوفياتية ، أو مجموع مربعات الفرق بين البيانات والقيم مناسبا ، وخلال تركيب المنحنى غير الخطية. القضاء على قياسات غير موثوق بها أو غير التأويل ، من خلال تجاهل البيانات من المنحنيات "سيئة" مع القيم الاشتراكية السوفياتية الكبيرة.
- إذا رغبت في ذلك ، لتحويل معامل المرونة (E) لمعامل القص (G) ، وذلك باستخدام العلاقة E = 2 × (1 + υ) × G. إلى تصور الأنماط المكانية التي تم جمعها من تصلب في خريطة القوة ، واسطة ، ورسم البيانات المعامل في الخرائط الكنتورية (على سبيل المثال في 16 × 16 عينة شبكة تغطي 80 × 80 ميكرون للمنطقة).
- لمعالجة كمية كبيرة من البيانات منحنى القوة ، قد تتم كتابة خوارزمية مخصصة لتناسب القوة تلقائيا التشريد والمنحنيات ، واستخراج moduli ، و / أو elastographs مؤامرة باستخدام نفس الإجراءات والمعلمات على النحو المبين في 3.2 و 3.3 (على سبيل المثال مطلب).
الشكل 1 (أ) رسم تخطيطي للmicroindentation فؤاد لعينة لينة على ركيزة صلبة باستخدام مسبار كروية (مستنسخة بإذن من Dimitriadis هاء ، وآخرون ، 2002 Biophys J 8). (ب) الممثل القوة التشريد منحنى تم جمعها من شريحة زجاجية نظيفة في برنامج تلفزيوني لتحديد حساسية ناتئ انحراف. (C) الممثل القوة التشريد المنحنيات التي جمعت من عينات (أحمر) لينة (الأزرق) وقاسية تظهر المعلمات المقابلة من (A).
4. ممثل النتائج :
الشكل 2A يظهر الشريط حمة الرئة تعلق على بولي - L - يسين ساترة المغلفة في برنامج تلفزيوني مع التحقيق في مكان فؤاد مباشرة فوق المنطقة ذات الاهتمام وعلى استعداد لرسم خرائط microindentation. 2B الرقم يدل على ان في النسيج الملون وقطع بشكل صحيح ، يتم الاحتفاظ جيدا من المعمارية المصغرة السنخية حمة الرئة ، كما لوحظ من خلال تلوين مناعي لالغشاء القاعدي laminin المكون من دون تثبيت أو permeabilization. الرقم تظهر CD 2 تلوين مناعي لالكولاجين كنت في الرئتين غير المثبتة جديدة تحصد من الفئران التي عولجت سابقا مع برنامج تلفزيوني (الشكل 2C) ، أو تعامل مع بليوميسين (الشكل 2D) للحث على التليف 10.
ويبين الشكل 3A نموذج القوة التشريد المؤامرات التي تم الحصول عليها من microindentation فؤاد. مع تطبيق نفس القوة ، AFM غيض يولد المسافة البادئة كبير على منطقة الناعمة (الخط الأزرق) ، مما أدى إلى نسبيا "مسطح" منحنى القوة التشريد مقابل البادئة الصغيرة و "حاد" منحنى القوة التشريد لصلابة المنطقة ( خط أحمر). من أجل الحصول على منحنيات القوة النظيفة ، وبعد كل المسافة البادئة غيض فؤاد يحتاج إلى تراجع تماما عن سطح العينة وخالية من الاتصال قبل البادئة المقبل. هذه الحالة الاتصال مجانا يناظر المنطقة المسطح من المنحنى في الشكل 3A ، حيث يترجم طرف دون انحراف ناتئ. ويبين الشكل 3B منحنى نموذجي كاذبة دون منطقة مسطحة والذي يحدث عندما لا تراجع عن الحافة تماما من سطح العينة (العينة الناعمة مثلاttaches إلى الحافة) مما يجعل من المستحيل تحديد نقطة اتصال. إذا كان محاصرا تماما غيض في عينة لينة ، قد تبدو المنحنى كما هو مبين في الشكل 3C ، دون انحراف واضح ولكن الضوضاء الصغيرة.
ويبين الشكل 4 معامل القص البيانات المستخرجة من قوة التشريد منحنيات مكانيا كما عرض الخرائط صلابة (elastographs) ، حيث مقاييس الألوان مع معامل القص. Elastographs إظهار الفوارق الصارخة في نطاق وتوزيع معامل النسيج في القص العادي (الشكل 4A) وتليفي (الشكل 4B) حمة الرئة ، والاختلافات المكانية كبيرة في معامل القص ، ولا سيما داخل العينة تليفي الرئة.
الشكل 2 : (أ) صورة مجهرية النقيض من المرحلة تظهر اجراء تحقيق حول شريط فؤاد حمة الرئة الماوس. مقياس بار ، و 50 ميكرومتر. (ب) من Immunostaining laminin الماوس العادي في أنسجة الرئة تظهر السنخية من المعمارية المصغرة حمة الرئة الطبيعية. المربع الأبيض يشير إلى مرونة نموذجية تعيين 80 بواسطة 80μm المنطقة. شريط الحجم : 20 ميكرون. (C و D) Immunostaining الكولاجين كنت في المياه المالحة (C) وبليوميسين (D) معاملة الماوس حمة الرئة. أشرطة النطاق ، 100 ميكرون.
الشكل 3 : (أ) الممثل التأويل بالقوة تشريد المنحنيات التي تم جمعها من المياه المالحة (الأزرق) وبليوميسين المعالجة (الحمراء) الماوس حمة الرئة ، على التوالي. الخطوط السوداء هي الأكثر ملاءمة الناتجة عن النموذج الكروي وهيرتز وصفت مع ما يقابلها من moduli الشباب المحسوب. (B ، C) ، ممثل الامم المتحدة التأويل بالقوة تشريد المنحنيات.
الشكل 4. elastographs الممثل جمعها من المياه المالحة (A) وبليوميسين المعالجة (B) الماوس حمة الرئة. أشرطة ملونة تشير إلى معامل القص في kilopascals. تسميات المحور تبين النطاق المكاني في ميكرومتر. شريط الحجم : 20 ميكرون
Discussion
توصيف الميكانيكية للأنسجة الرئة باستخدام فؤاد microindentation عروض لم يسبق لها مثيل القرار المكانية (الشكل 4) ، وتقديم منظور فريد على الاختلافات في تصلب الأنسجة الميكروسكيل. كمثال على فائدتها ، وأشار السابقة الماكرو النطاق العادي والقياسات في تليفي شرائح أنسجة الرئة تقريبي 2-3 أضعاف الزيادة في مرانية مع التليف 11،12. في المقابل ، يكشف عن أن فؤاد microindentation تشنج الأنسجة المترجمة للغاية ، مع اظهار بعض المناطق تصل إلى ~ يزيد 30 أضعاف في معامل القص فوق المتوسط التي لوحظت في أنسجة الرئة العادية 10. كما هو معروف الآن صلابة مصفوفة للتأثير حاسم وظيفة الخلية ، وهذه القياسات المحلية توفير معلمات لا تقدر بثمن لتعزيز biofidelity دراسة ثقافة خلية من خلايا الرئة.
قضايا عملية عديدة تنشأ مع استخدام شرائح رقيقة من نسيج الرئة. السطوح من شرائط ليست مسطحة تماما ، كما يلي ملف الأنسجة بنية الحويصلات الكامنة. نظام AFM تلقائيا بضبط موقف طرف في Z - الاتجاه خلال البادئة عند ارتفاع سطح التباين عينة أصغر من 15 ميكرومتر للمساعدة في التغلب على هذا التحدي. يتم إجراء قياسات في درجة حرارة الغرفة ، وليس 37 درجة مئوية ، لذلك لا يمكن أن الانحرافات في الخواص الميكانيكية الناجمة عن هذا الاختلاف في درجات الحرارة يمكن تقييمها ، بالرغم من أنه سيكون من المتوقع أن تكون طفيفة. تأثير العمارة الجدار السنخي الكامنة على الخواص الميكانيكية لوحظ من الصعب تحديد الإعداد مع ضوء الفحص المجهري الحالي. على سبيل المثال ، سيكون من المرغوب فيه لتحديد ما إذا الجدران السنخية معرض تباين الخواص الميكانيكية ومختلفة عند بادئة في اتجاهات تتماشى مع أو عرضية لطائرة من الجدار. ومع ذلك ، فإن العينات الحالية هي سميكة ونظام التصوير لا يملك قدرات 3D ، وبالتالي فمن غير الممكن لتحديد اتجاه الجدار السنخي المحلية في كل نقطة اتصال. أخيرا ، فإن تأثير الناخبين الخليوي في قياس الخصائص الميكانيكية لا يزال يتعين توضيحها بشكل كامل. في أساليب مفصلة هنا ، لم تبذل جهود لإزالة المكونات الخلوية تحديدا من الأنسجة. ومع ذلك ، فإن الخلايا موجودة على سطح متاح المسافة البادئة من غير المحتمل أن تكون مجدية بالنظر إلى الوقت الذي انقضى منذ الحصاد الأنسجة وضرورة قطع الأنسجة للوصول إلى الحويصلات الهوائية. وتجارب محددة لإزالة الخلايا ، أو اعد اسكان المصفوفات مع خلايا قابلة للحياة ، وتقييم التغيرات الناتجة في تصلب الأنسجة تظهر يبرره.
لأن هناك حاجة الأنسجة غير المثبتة جديدة لهذه القياسات ، ينبغي التقليل من الوقت الذي انقضى من محصول الأنسجة لقياس ويجب أن يتم تخزين العينات في 4 درجات مئوية لتفادي تغيرات في الخصائص الميكانيكية. وينبغي إيلاء اهتمام خاص عندما يتم نقل الحاويات بين شرائح النسيج خلال غسلها أو تلطيخ بحيث يتم إنشاء الحد الأدنى من التشويه أو أضرار. للتطبيق في AFM السائل ، هو خطوة حاسمة لقطع الانسجة كما شقة ممكن ، ويستوقف العينة على دعم ساترة. إذا كانت متوفرة ، ويمكن استخدام جهاز الآلي sectioning مثل تقطيع اللحم والأنسجة vibratome أو لقطع شرائح من سمك موحد للغاية. من المهم أن نولي شرائح الأنسجة مباشرة قبل قياسات AFM وتقليل الوقت المنقضي لقياسات AFM كما العينة سيتم فصل في نهاية المطاف من coverslips. من المفيد الملاحظة هو أن أكبر شرائح يبدو أن نعلق أكثر ثابت لتغطية زلات وتبقى في مكانها لفترات أطول في برنامج تلفزيوني من أصغر شرائح.
يمكن فؤاد microindentation تميز عينات تغطي مجموعة واسعة من 100 الى 50 كيلو باسكال (معامل القص) عند استخدام معيار 0.06 غ / م ناتئ مع طرف قطره 5 ميكرومتر كروية. ويمكن توسيع هذا النطاق باستخدام المسابر مع ثوابت الربيع مختلفة ؛ تحقيقات فؤاد مع نصائح الزجاج كروية تتراوح 0،6 حتي 12 ميكرون في القطر ، والثوابت الربيع تتراوح 0،01-0،58 نيوتن / متر متوفرة تجاريا (مثل Novascan) وتستخدم عادة 3. مع تلميح كروية 5 ميكرون ، ومنطقة التماس بين النظرية والأنسجة غيض حوالي 5-9 ميكرون 2 للتسنن 400-700 نانومتر (الشكل 1A). ويمكن استخدام نصائح أصغر أو أكبر لتقديم جداول أصغر أو أكبر من القرار المكانية. كما تم استخدامها في الهرمية نصائح microindentation فؤاد 13-16 ، توفير مساحات أصغر ، وبالتالي زيادة الاتصال المكاني القرار في رسم الخرائط ، وعلى الرغم من البيانات المناسب هو أكثر تعقيدا لهذه الهندسة الحافة.
وتجدر الإشارة إلى العديد من القيود على هذا الأسلوب. وقد جرت العادة في الرئة تميزت ميكانيكيا غير جراحية ، على سبيل المثال باستخدام الضغط تحليل حجم 17 أو لكمة المسافة البادئة في الرئتين كله 19،20. طرق الغازية مثل تلك الموصوفة هنا تغيير بنية الرئة في الطرق الهامة من خلال فقدان كثافة الهواء السائلerface موجود بشكل طبيعي في الرئة مليئة بالهواء وفقدان التوتر قبل أن يحافظ على معدل التضخم عند جزئية الرئة استرخاء عضلات الجهاز التنفسي. هذه القيود هي مشتركة بين جميع القياسات التي أجريت في 18 شرائح أنسجة الرئة. على وجه الخصوص ، ومع ذلك ، فإن صلابة الوسيط يقاس في لحمة النسيج رئة طبيعية (معامل القص ~ 0.5kPa) لا يختلف كثيرا عن التقديرات على أساس المسافة البادئة لكمة من الرئتين سليمة في حجم راحة 19،20. بينما هو معروف أنسجة الرئة يحمل غير الخطية تشنج مع زيادة التشوه ، لم يكن ممكنا لاختبار على نحو دقيق ما إذا استمرت هذه الخاصية وصولا الى النطاق الجزئي مع الأساليب المستخدمة هنا. نموذج هيرتز يفترض تجانس العينة. ومع ذلك ، معظم المواد البيولوجية ، بما فيها لحمة الرئة ، وغير متجانسة بشكل متزايد على خفض مستويات مكانية. يمكن عدم تجانس العينة نتيجة في مثل التحف تباين في معامل يونغ اعتمادا على عمق المسافة البادئة ، اعتمادا على أي طبقة أو المكون الذي هو تشويه. ويمكن أن يقتصر على عدم التجانس في الطائرة - XY باختيار دقيق لحجم المناسبة غيض كروية اعتمادا على البنية المجهرية للمادة بيولوجية كما اقترح آخرون Dimitriadis بن EK 8 وهو أكثر من الصعب التنبؤ أو تصحيح الخطأ نموذج هيرتز بسبب المواد عدم التجانس في الاتجاه التصاعدي. Azeloglu وآخرون. اقترحت مؤخرا نموذج هجين الحسابية لتوصيف خصائص المرونة من الركيزة غير المتجانسة مع منفصلة جزءا لا يتجزأ من شوائب 21. التقنية الجديدة توفر الوسائل المحتملة لحساب خصائص ادراج مواد غير متجانسة التغلب على القيود المفروضة على تحليل الهرتزية.
نموذج هيرتز يفترض أيضا مرونة السلوك المطلق ، في حين عرض المواد البيولوجية عادة السلوكيات اللزجة التي تعتمد على الوقت. ويمكن الحصول على توصيف كامل اللزجة من الأنسجة من خلال تغيير السرعات البادئة المستخدمة. اختبار الأهم من ذلك ، السابقة الماكرو النطاق للفحص الميكانيكي للأنسجة الرئة الطبيعية وضعف الاعتماد تليفي يوضح تواتر الخصائص الميكانيكية أنسجة الرئة ، والحفاظ على الفوارق بين الأنسجة الطبيعية والخصائص الميكانيكية تليفي جميع الترددات 11. هذه النتائج تشير بقوة إلى أن قياس الخواص الميكانيكية باستخدام السرعة المسافة البادئة واحد مع فؤاد يجسد جانبا أساسيا من التغييرات في خصائص ميكانيكية الأنسجة التي تصاحب التليف.
النسبة من 0.4 بواسون لأنسجة الرئة المستخدمة في هذا العمل هو من قياس العيانية 9. للأسف ، ونسبة بواسون في الحجم الصغير ، وأية تغييرات في ظل حالة المرض ليست متوفرة في الأدب. كما يمكن لبدائل E ، E / (1 - υ 2) أو (1 - υ 2) / πE (تدل على مرونة ك الثابتة) تحسب من 22 microindentation فؤاد وعندما ذكرت أن نسبة بواسون غير معروف. بالنسبة لمعظم المواد الحيوية نسبة بواسون في نطاق 0،4-0،5 بسبب محتواها المياه العالية. في نطاق 0،3-0،5 ، عامل 1 / (1 - υ 2) يختلف فقط 1،10-1،33 ، ان هذه الاختلافات في نسبة معقولة من بواسون الى تأثيرات طفيفة على المعامل عنها. الزيادة في معامل القص أننا تقرير عن النسبية نسيج متليف إلى الأنسجة الطبيعية هي أضعاف عدة في الحجم ، مما يعني أن الأخطاء المرتبطة مع وجود اختلافات في نسبة بواسون نسبية طفيفة على تغييرات في الخصائص الميكانيكية ملاحظتها.
الخوارزمية الفعلية والبرمجية التي يمكن استخدامها لتحليل البيانات النزوح بالقوة يخضع لشرط تطبيق معين وخصائص لاحقة من مختلف فئات السكان من النزوح بالقوة المنحنيات. إذا كان التحليل هو أكثر تعقيدا من الفوائد ، يمكن للمرء الاطلاع على عمل لين وآخرون 23. الكتاب ترجمة سلسلة من الاستراتيجيات التآزر إلى الخوارزمية التي يتغلب العديد من التعقيدات التي أعاقت جهود سابقا لأتمتة تركيب نماذج البيانات هيرتز المسافة البادئة.
عدة مجالات أخرى متاحة لمزيد من التنمية واستغلال هذا الأسلوب. في الحالات التي يهتم احد في الرؤية والجدران السنخية الأضداد دون وضع العلامات ، وكلاهما يمكن الإيلاستين والكولاجين يمكن تصور لهم من إشارة autofluorescent في الطيف الخضراء. من ناحية أخرى ، يمكن أن أفضل تصوير ، وذلك باستخدام إما المقاطع أرق النسيج ، وتقنيات التصوير 3D ، أو كليهما ، وتعزيز القدرة على ربط العمارة مع الأنسجة الكامنة الخواص الميكانيكية. في حين أن الأساليب الحالية تسمح للتلوين والتصور من مكونات المصفوفة خارج الخلية مثل الكولاجين وlaminin ، يمكن أن تهدف إلى بذل جهود إضافية في تلطيخ علامات سطح الخلية لتحديد السكان خلية معينة وتحديد سمات microenvironments الميكانيكية في محيط هؤلاء السكان. بديلernatively ، يمكن أن تحصد من أنسجة الفئران معربا عن fluorescently الموسومة النسب علامات أو بروتينات معينة خلية لمتابعة نفس الهدف. أخيرا ، يظهر هنا طريقة مفصلة مناسبة تماما لتوصيف ملامح تشريحية أخرى في الرئة ، مثل السفن التي يعيد في ارتفاع ضغط الدم ، والذي يعيد الهوائية في حالات الربو. بناء على حالته الراهنة من تطور وإمكانات تعزيز مزيد من فؤاد microindentation يبدو تستعد لانتاج رؤى قيمة حول التغييرات في تصلب الأنسجة التي ترافق تطور المرض في الرئة ، ومما لا شك فيه أن تكون ذات قيمة في تشخيص التغيرات المكانية والزمانية في صلابة من مجموعة متنوعة من الانسجة الرخوة الأخرى.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر ألف باء Tager وشيا لتعاونهم المستمر ، وتوفير أنسجة الرئة تستخدم لأغراض العرض التوضيحي هنا. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح HL - 092961. تم تنفيذ هذا العمل في الجزء في مركز لأنظمة النانو (CNS) ، وهو عضو في شبكة تقنية النانو البنية التحتية الوطنية ، وهو مدعوم من قبل مؤسسة العلوم الوطنية في إطار جبهة الخلاص الوطني جائزة ECS - 0335765. الجهاز العصبي المركزي هو جزء من كلية الآداب والعلوم في جامعة هارفارد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM tip | Novascan Technologies, Inc. | PT.GS | 5 micron Borosilicate bead, 0.06 N/m |
| Poly-L-Lysine coverslips | VWR international | 354085 | BD BioCoat 12 mm round No.1 glass |
| Agarose, Low Gelling Temperature | Sigma-Aldrich | A0701 | |
| Rabbit anti-Collagen I (Rb pAb) antibody | Abcam | ab34710-100 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit antibody | Invitrogen | A11010 | |
| Rabbit anti-Laminin | Sigma-Aldrich | L9393 |
References
- Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells. Am J Physiol Cell Physiol. 279, C1345-C1350 (2000).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Klein, E. A. Cell-cycle control by physiological matrix elasticity and in vivo tissue stiffening. Curr. Biol. 19, 1511-1518 (2009).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Bergner, A., Sanderson, M. J. Airway contractility and smooth muscle Ca(2+) signaling in lung slices from different mouse strains. J Appl Physiol. 95, 1325-1332 (2003).
- Thundat, T., Warmack, R. J., Chen, G. Y., Allison, D. P. Thermal and ambient-induced deflections of scanning force microscope cantilevers. Appl Phys Lett. 64, 2894-2896 (1994).
- Mahaffy, R. E., Shih, C. K., MacKintosh, F. C., Kas, J. Scanning probe-based frequency-dependent microrheology of polymer gels and biological cells. Phys Rev Lett. 85, 880-883 (2000).
- Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophys. J. 82, 2798-2810 (2002).
- Butler, J. P., Nakamura, M., Sasaki, H., Sasaki, T., Takishima, T. Poissons' ratio of lung parenchyma and parenchymal interaction with bronchi. Jap. J. Physiol. 36, 91-106 (1986).
- Liu, F. Feedback amplification of fibrosis through matrix stiffening and COX-2 suppression. J Cell Biol. 190, 693-706 (2010).
- Ebihara, T., Venkatesan, N., Tanaka, R., Ludwig, M. S. Changes in extracellular matrix and tissue viscoelasticity in bleomycin-induced lung fibrosis. Temporal aspects. Am J Respir Crit Care Med. 162, 1569-1576 (2000).
- Dolhnikoff, M., Mauad, T., Ludwig, M. S. Extracellular matrix and oscillatory mechanics of rat lung parenchyma in bleomycin-induced fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 160, 1750-1757 (1999).
- Rehfeldt, F., Engler, A. J., Eckhardt, A., Ahmed, F., Discher, D. E. Cell responses to the mechanochemical microenvironment--implications for regenerative medicine and drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 59, 1329-1339 (2007).
- Berry, M. F. Mesenchymal stem cell injection after myocardial infarction improves myocardial compliance. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, 2196-2203 (2006).
- Azeloglu, E. U., Bhattacharya, J., Costa, K. D. Atomic force microscope elastography reveals phenotypic differences in alveolar cell stiffness. J Appl Physiol. 105, 652-661 (2008).
- Wagh, A. A. Localized elasticity measured in epithelial cells migrating at a wound edge using atomic force microscopy. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 54-60 (2008).
- Martinez, F. J., Flaherty, K. Pulmonary function testing in idiopathic interstitial pneumonias. Proc Am Thorac Soc. 3, 315-321 (2006).
- Cavalcante, F. S. Mechanical interactions between collagen and proteoglycans: implications for the stability of lung tissue. J Appl Physiol. 98, 672-679 (2005).
- Hajji, M. A., Wilson, T. A., Lai-Fook, S. J. Improved measurements of shear modulus and pleural membrane tension of the lung. J Appl Physiol. 47, 175-181 (1979).
- Lai-Fook, S. J., Wilson, T. A., Hyatt, R. E., Rodarte, J. R. Elastic constants of inflated lobes of dog lungs. J Appl Physiol. 40, 508-513 (1976).
- Azeloglu, E. U., Kaushik, G., Costa, K. D. Developing a hybrid computational model of AFM indentation for analysis of mechanically heterogeneous samples. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 4273-4276 (2009).
- A-Hassan, E. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy. Biophys J. 74, 1564-1578 (1998).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. J. Biomech. Eng. 129, 430-440 (2007).
