Summary
Жесткость внеклеточного матрикса сильно влияет на поведение нескольких прилипшие клетки. Матрица жесткости изменяется пространственно всей ткани, и подвергается модификации в различных условиях болезни. Здесь мы разрабатываем методы, чтобы охарактеризовать пространственные изменения жесткости в нормальных и фиброзных тканей легких мыши с помощью атомно-силовой микроскопии микроиндентирования.
Abstract
Матрица жесткости сильно влияет на рост, дифференцировку и функцию прилипшие клетки 1-3. На макроуровне жесткости ткани и органы в человеческом теле занимать несколько порядков 4. Гораздо меньше известно о том, как жесткость колеблется в пределах пространственно тканей, и то, что масштаб и пространственный масштаб жесткости изменений в болезненные процессы, которые приводят к ткани ремоделирования. Чтобы лучше понять, как изменения в матрицу жесткости способствуют клеточной физиологии в норме и патологии, измерения жесткости тканей, полученных при пространственном масштабе, имеющие отношение к резидентам клетки необходимы. Это особенно верно для легких, высоко совместимый и упругой ткани, в которой матрица ремоделирования является характерной чертой при таких заболеваниях, как астма, эмфизема легких, гипертонии и фиброз. Для характеристики локальных механических среды паренхимы легких в пространственном масштабе, имеющие отношение к резидентам клетки, мы разработали методы прямого измерения локальных упругих свойств свежего мышиной легочной ткани с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) микроиндентирования. При соответствующем выборе АСМ индентора, консольные и углубление глубиной, эти методы позволяют измерять локальный модуль сдвига ткани параллельно с фазового контраста и флуоресценции визуализации области интереса. Систематический отбор образцов ткани полос предоставляет карты ткани механическими свойствами, которые показывают местные пространственные изменения модуля сдвига. Корреляция между механическими свойствами и лежащий в основе анатомических и патологических функций показать, как жесткость изменяется в зависимости от матрицы отложения в фиброз. Эти методы могут быть распространены на другие мягкие ткани и болезненные процессы, чтобы показать, как местные ткани механические свойства меняются в пространстве и прогрессирования заболевания.
Protocol
1. Легочной ткани Газа Подготовка
- Легкие ткани очень совместимые и трудно нарезать полосками для определения характеристик АСМ. Чтобы временно стабилизировать структуру легких для резки, изолированных раздувать легкие мыши интратрахеально с 50 мл / кг массы тела в 2% гель низкой точки агарозы (подготовленную в PBS), нагревают до 37 ° C. Галстук от трахеи и прохладный завышенным легких в ванну PBS при 4 ° С в течение 60 минут. Агарозном геле и будут напрягаться в воздушном пространстве, чтобы мягко стабилизируется легких структуры в течение этого интервала 5. Высшее агарозном концентраций, т. е. 3-4%, может быть использован для дальнейшего укрепления тканей стабилизации для резки.
- Вырезать агарозном стабилизированного мыши легочной ткани с бритвой или лезвие скальпеля на полосы 5 х 5 мм в длину и ширину и 400 мкм в толщину, затем промыть полосы в ванне PBS предварительно нагревают до 37 ° С с использованием 100 мл стеклянный стакан на настольный нагретой пластине движение в течение 5 минут, чтобы удалить остатки агарозы. Чтобы исключить большие дыхательные пути и сосуды, вырезать полосы из субплеврально районах, удаленных от основного ствола бронхов. Если дыхательные пути и большие суда для включения в образ, вырезать полосы из ткани легкого более проксимальнее главного стебля бронхов.
2. АСМ микроиндентирования и флуоресценции
- Для выделения областей, представляющих интерес для микроиндентирования AFM, ткань может быть визуализированы фазы микроскопии контрастность или immunostained и визуализируются с помощью флуоресцентной микроскопии. Для иммунной, блок ткани полосы с 5% сыворотки от источника желаемых вторичных антител (в ФСБ) в течение 2 часов без фиксации или пермеабилизации при комнатной температуре.
- Инкубируйте ткани полосы с соответствующей первичных антител (например, кролика против коллагена я визуализировать интерстициального коллагена (1:250 разведение), кролик анти-ламинин (1:250 разведение) для визуализации базальной мембраны) в лунку 12-луночного планшета на рокер с осторожном встряхивании в течение 1 часа, мыть образец 3 раза по 5 минут каждая с PBS, после чего соответствующие вторичные антитела, конъюгированные с флуоресцентной метки (например, Alexa Fluor 546 козьего анти-кролик вторичных антител (1:250 разведение)) в течение 1 час при комнатной температуре.
- Вымойте ткань полосы экстенсивно с PBS и хранят в PBS при 4 ° С
- Непосредственно перед характеристики AFM, придают ткани полоску поли-L-лизин покрытием 15-мм покровным, подняв покровное снизу плавающей ткани, убедившись, что полоса ткани равномерно распределяется на поверхности покровного стекла, при необходимости, сэндвич полосы со вторым чистым, без покрытия покровное и применять мягкое давление, чтобы помочь с тканью привязанность к поли-L-лизин покрытием покровное.
- Калибровка системы АСМ следующие инструкции завода-изготовителя непосредственно перед каждым раундом микроиндентирования экспериментов. Определите два важнейших параметра: 1) консольной пружины использованием термического метода колебания воздуха 6, а, 2) чувствительность отклонения кантилевера, который является параметр используется для масштабирования сигнала фотодиода вывод на фактическое расстояние отклонения кантилевера, Δd. Калибровка отклонения чувствительности путем получения стандартных сила-смещение кривой в PBS на чистом предметном стекле затем вычислить наклон сила-смещение кривой (рис.1б). В сила-смещение кривой измерения, иглой АСМ простерта к и отказался от поверхности образца в одном месте (без rastering в направлениях XY), при этом отклонения кантилевера, Δd, мониторинг в зависимости от наконечника перемещением, Δz .
Мы рекомендуем использовать треугольник нитрида кремния кантилевера с 5-мкм в диаметре боросиликатного сферическим наконечником (Novascan). Использование АСМ зондов с пружины на 0,06 Н / м, у нас есть механически характерны мягкие материалы с модулями сдвига охватывающих 100 до 50 000 Па.
- Протрите нижнюю поверхность образца с покровным оберточную бумагу, прикрепите ее к стандартной предметное стекло с вакуумной смазкой, установите стекло на сцене образца АСМ, и охватывают ткани с 500 мкл PBS (комнатной температуры).
- Установите микроскоп для окуляра просмотр выровнять иглой АСМ в центре поля зрения, регулируя столик микроскопа образца. Выберите область интересов на ткани, перемещая этапе АСМ образца, затем переключиться на ПЗС-камера просмотр записи фазы контрастность изображения и / или флуоресцентные изображения тканей, как хотелось бы.
- Выполните стандартное АСМ участие операцию, перемещая иглой АСМ медленно вниз, пока он находится в контакте с образцом.
- Точная микроиндентирования АСМ характеристики мягких образцов требует небольших глубинах отступы, чтобы избежать больших местных штаммов и в силу этого Герцем модели, используемой для расчета упругого модуля. Чтобы избежать больших деформаций, выполнить углубление в режим запуска, установив отклонению кантилевера максимум (триггерных точек) до 500 нм. Это отклонение предела будет сдерживатьМаксимальная сила отступа до менее чем 30 нН (F = консольной пружины смещение * или F макс = 0,06 нН / нм * 500 нм = 30 нН).
Отступы скорость должна быть выбрана достаточно медленно изучает упругой, а вязко-упругих свойств мягких образца 7. Диапазон скоростей от 2-20 мкм в секунду подходит для легочной ткани.
- Для единичного измерения от области интересов, перемещение зонда АСМ к месту интерес и выполнять один отступ собрать стандартный сила-смещение кривой (зонд движется только в Z-направлении без XY сканирование).
- Для автоматического отображения интересующей нас области, переключиться на Силы Режим карты, выберите размер сканирования и выборочных точек в выбранной области. В Силе Карта режиме иглой АСМ растров по поверхности образца между отступы движений, и собирает отдельные сила-смещение кривой в каждой точке в течение определенного образца сетки. Более точек отбора обеспечит более высокое пространственное разрешение, но удлиняют время, необходимое для отображения. Мы сочли целесообразным использовать 16 х 16 образца сетки карта 80 х 80-мкм области на углубление скоростью 20 мкм в секунду, что может быть завершена в ~ 10 минут.
3. АСМ Извлечение данных
- Чтобы рассчитать модуль Юнга, пригодные сила-смещение кривой Герц сферической модели отступы использованием наименьших квадратов нелинейных изогнутыми установки 8 (рис. 1, С):
где F = к с * Δ г, является силой, чтобы согнуть консольные, к с-консольной пружины, R-радиус сферы наконечник, δ = Δ Z - Δ г является углубление и υ является коэффициент Пуассона образца (υ = 0,4 для легочной ткани 9). - Оценить качество подгонки, рассчитать ССР стоимости, или сумма квадратов разницы между данными и соответствуют значениям, при нелинейной подгонки кривой. Ликвидация недостоверной или не-интерпретации измерений удаления данных из «плохие» кривые с большими значениями ССР.
- При желании, конвертировать модуль упругости (Е) для модуля сдвига (G), с помощью соотношения E = 2 х (1 + υ) х Г. Для визуализации пространственных структур жесткости, собранных в Силе Режим карты, сюжет модуль данных в контурные карты (например, в 16 х 16 образец сетки, покрывающей 80 х 80 мкм область).
- Для обработки больших объемов данных силовой кривой, пользовательский алгоритм может быть записан для автоматического подходят сила-смещение кривых, экстракт модулей, и / или участок elastographs используя те же процедуры и параметры, как указано в 3.2 и 3.3 (например, Matlab).
Рисунок 1 () Схема АСМ микроиндентирования мягкого образца на жесткой подложке использованием сферического зонда (Воспроизводится с разрешения Димитриадис Е., и др.. 2002 Biophys J 8). (B), представитель сила-смещение кривой собраны из чистой предметное стекло в ФБР, чтобы определить чувствительность отклонения кантилевера. (C) представитель сила-смещение кривых собраны из мягкого (синий) и жесткие (красный) показывает образцы соответствующих параметров из (А).
4. Представитель Результаты:
Рисунок 2А показывает полосу паренхимы легких прикреплены на поли-L-лизин покрытием покровное в ФБР с зонда АСМ на месте непосредственно над областью интересов и готовы к микроиндентирования отображения. Рисунок 2B показывает, что в правильно вырезать и окрашивали ткани, альвеолярных микроархитектуры паренхимы легких хорошо сохранился, как заметил иммунофлуоресцентного окрашивания базальной мембраны компонента ламинина без фиксации или пермеабилизации. Рисунок 2 CD-шоу иммунофлуоресцентного окрашивания для коллагена I в пресной незаписанных легких собрано от мышей, ранее получавших PBS (рис. 2), или лечение с блеомицин (рис. 2D), чтобы вызвать фиброз 10.
На рис.3 показан пример сила-смещение графики, полученные от микроиндентирования АСМ. С той же силой, приложенной, АСМ порождает большое углубление на мягкой области (синяя линия), что приводит к относительно "плоской" сила-смещение кривой по сравнению с небольшой отступ и "крутой" сила-смещение кривой жесткой области ( красная линия). Для того чтобы получить чистые кривые силы, после каждого отступа АСМ необходимо полностью отодвигаются от поверхности образца и без контакта до следующего отступа. Этот контакт свободном состоянии соответствует плоский участок кривой на рисунке 3A, где чаевые переводится без отклонения кантилевера. На рисунке 3б показана типичная кривая без ложной плоской регионе, который происходит, когда кончик не полностью отказался от поверхности образца (например, мягкий образецttaches до кончика), что делает невозможным определение точки контакта. Если наконечник полностью в ловушке мягкого образца, кривая может выглядеть, как показано на рисунке 3C, без четких отклонения, но небольшие шумы.
Рисунок 4 показывает время набора данных модуля извлекается из сила-смещение кривой отображается пространственно как жесткость карт (elastographs), где цветовые гаммы с модулем сдвига. Elastographs демонстрируют поразительные различия в диапазон и распределение модуля сдвига ткани в нормальном (рис. 4а) и фиброзных (рис. 4б) паренхимы легких, и большие пространственные изменения модуля сдвига, особенно в фиброзных образец легкого.
Рисунок 2. () Фазового контраста микрофотография показывает зонда АСМ за мышью полосу паренхимы легких. Шкала бар, 50 мкм. (B) Иммуноокрашивание ламинина в нормальной легочной ткани мыши показывает альвеолярного микроархитектуры нормальной паренхимы легких. Белое поле указывает типичный 80-к-80μm эластичность отображение области. Шкала бар: 20 мкм. (С и D) Иммуноокрашивание коллагена я в физиологическом растворе (С) и блеомицин (D) рассматривается мыши паренхимы легких. Шкала баров, 100 мкм.
Рисунок 3. () Представитель интерпретируемых сила-смещение кривых собраны из физиологического раствора (синий) и блеомицин обработанные (красный) мыши паренхимы легких, соответственно. Черные линии наилучшего в результате сферической модели Герца и помечены с их соответствующими расчетными модулями Юнга. (В, С), представитель ООН-интерпретируемых сила-смещение кривых.
Рисунок 4. Представителю elastographs собраны из физиологического раствора () и блеомицин обработанные (Б) мышь паренхимы легких. Цветные полоски указывают на модуль сдвига в кПа. Подписи оси указывают на пространственный масштаб в микронах. Шкала бар: 20 мкм
Discussion
Механические характеристики легочной ткани использованием АСМ микроиндентирования предлагает беспрецедентную пространственным разрешением (рис. 4), что обеспечивает уникальный взгляд на микромасштабной изменений в ткани жесткость. В качестве примера его полезность, предыдущие макромасштабе измерений в нормальных и фиброзной полосы ткани легкого указал примерный 2-3-кратное увеличение эластичности с фиброзом 11,12. В отличие от АСМ микроиндентирования показывает, что ткани жесткости крайне локализованным, с некоторыми регионами экспонирования до ~ 30-кратное увеличение модуля сдвига выше среднего наблюдается в нормальной ткани легкого 10. Как матрица жесткости, как теперь известно критически влияние клеточной функции, эти локальные измерения оказать неоценимую параметры для повышения достоверности биофизических параметров клеточных культур изучения клетки легких.
Несколько практических вопросов, возникающих при использовании тонких полосок ткани легкого. Поверхности полосы не идеально ровная, как ткань профиля следующим архитектура основных альвеол. Система AFM автоматически регулирует кончиком позиция в Z-направлении в течение отступы, когда высота поверхности образца изменение меньше, чем 15-мкм, чтобы помочь преодолеть эту проблему. Измерения проводились при комнатной температуре, а не 37 ° C, так что отклонения в механических свойствах, вызванные этим изменения температуры не могут быть оценены, хотя они, как ожидается, будет незначительным. Влияние основных альвеолярной архитектуры стены на наблюдаемые механические свойства трудно определить, с текущей настройки световой микроскопии. Например, было бы желательно, чтобы определить, альвеолярных стенок выставку анизотропии и различных механических свойств при отступом в направлении, в соответствие с или поперечном к плоскости стены. Однако в настоящее время образцы толстые и системы визуализации не имеет возможности 3D, следовательно, это не представляется возможным определить местные альвеолярного ориентации стены в каждой точке контакта. Наконец, влияние сотовых составляющих на измеряемых механических свойств остается не полностью выяснены. В методы, описанные здесь, не предпринимаются усилия по специально удалить сотовой составляющих ткань. Тем не менее, клетки, присутствующие на площади, предназначенной для отступа, вряд ли будут жизнеспособными данного времени, прошедшего с урожая ткани и необходимость сокращения ткани, чтобы получить доступ к альвеол. Специальные эксперименты, чтобы удалить клетки, или повторного заполнения матрицы с жизнеспособных клеток, и оценить соответствующие изменения в ткани жесткость представляется оправданным.
Потому что свежие незаписанных ткани необходимы для этих измерений, время, прошедшее от ткани жатвы, чтобы измерение должно быть сведено к минимуму и образцы должны храниться при температуре 4 ° С, чтобы избежать изменения механических свойств. Особое внимание должно быть уделено всякий раз, когда ткани полосы передаются между контейнерами во время мытья или окрашивания, так что минимальные искажения или повреждения не генерируется. Для АСМ применение в жидкости, важнейшим шагом является сокращение ткани плоской, как можно и обездвижить образца на поддержку покровное. Если возможно, автоматизированных секционирования машин, таких как vibratome или ткани резки можно использовать, чтобы сократить ломтиками очень равномерной толщины. Важно приложить ткань полосы непосредственно перед АСМ измерений и минимизировать время, затраченное на АСМ измерений в качестве образца, в конечном счете оторваться от покровных. Одним из полезных наблюдений, что более крупные полосы появляются приложить более стабильно, чтобы покрыть скользит и остаются на месте для более длительные в ФСБ, чем меньше полос.
АСМ микроиндентирования можно охарактеризовать образцы охватывающих широкий диапазон от 100 Па до 50 кПа (модуль сдвига) при использовании стандартных 0,06 Н / м кантилевера с 5 мкм в диаметре сферического наконечника. Этот диапазон может быть расширен с помощью зондов с различными постоянными весной; АСМ зонды со сферическими советы стекла от 0,6 до 12 мкм в диаметре и весной константы в диапазоне от 0,01 до 0,58 Н / м имеются в продаже (например, Novascan) и обычно используется 3. С 5 мкм сферическим наконечником, теоретическая площадь контакта между зондом и тканей составляет около 5-9 мкм 2 для 400-700 нм отступа (рис. 1А). Меньше или больше, советы могут быть использованы для обеспечения большего или меньшего масштаба пространственного разрешения. Пирамидальная советы были также использованы в АСМ микроиндентирования 13-16, обеспечивая меньшие области контакта и тем самым увеличивая пространственным разрешением в картографии, хотя данные установки является более сложной для этой геометрии зонда.
Некоторые ограничения этого метода должно быть отмечено. Легких традиционно характеризуется механическим неинвазивно, например, с использованием давление-объем анализ 17 или удар-отступ целом легкие 19,20. Инвазивные методы, такие как описан здесь изменить легких архитектуры в важных путей, через потерю воздушно-жидкостной Interface, которые обычно существуют в заполненных воздухом легких и потери предварительного напряжения, который поддерживает легких частичной инфляции при релаксации дыхательных мышц. Эти ограничения являются общими для всех измерений, выполненных в легочную ткань полосы 18. Примечательно, однако, средняя жесткость измеряется в паренхиме нормальной ткани легкого (модуль сдвига ~ 0.5kPa) не отличается существенно от оценки, основанные на удар-отступы интактных легких при покоя объемы 19,20. Хотя легочной ткани, как известно, выставка нелинейной жесткости с ростом деформации, это не возможно проверить в строгой моде ли это свойство сохраняется вплоть до микро-масштабе с методов, используемых здесь. Модель Герц предполагает однородность выборки. Однако большинство биологических материалов, в том числе легочной паренхимы, все чаще гетерогенных при уменьшении пространственных масштабов. Неоднородность образца может привести к помехам, как изменение модуля Юнга в зависимости от глубины отступа, т.е. в зависимости от слоя или компонент, деформирующий. Неоднородности в плоскости х, может быть ограничено путем тщательного выбора соответствующих сферических размер наконечника в зависимости от микроструктуры биоматериала, предложенные Димитриадис Е.К. и др. 8. Это гораздо более трудно предсказать или исправить Герц модель ошибок из-за материальных неоднородность в Z-направлении. Azeloglu и соавт. недавно предложил гибридные вычислительные модели для характеристики упругих свойств гетерогенных подложки с дискретным встроенным включений 21. Их новая техника обеспечивает потенциальное средство для расчета включение свойств гетерогенных материалов преодоления ограничений Герца анализа.
Модель Герц также предполагает абсолютного упругого поведения, в то время как биологические материалы обычно отображают зависящих от времени поведения вязкоупругих. Полной характеристики вязкоупругих ткани могут быть получены путем изменения отступа скоростях используются. Важно отметить, что предыдущий макромасштабе механических испытаний нормальных и фиброзной ткани легкого демонстрирует слабую зависимость частоты легочной ткани механических свойств, и сохранение различий между нормальным и фиброзной ткани механических свойств на всех частотах испытания 11. Эти данные убедительно показывают, что измерения механических свойств с помощью одной скорости вдавливания АСМ фиксирует существенный аспект изменения в тканях механических свойств, которые сопровождают фиброза.
Коэффициент Пуассона 0,4 для легких тканей, используемых в этой работе составляет от макроскопических измерений 9. К сожалению, коэффициент Пуассона на микро-масштабе, и любые изменения в болезненного состояния не доступны в литературе. В качестве альтернативы Е, Е / (1-υ 2) или (1-υ 2) / πE (обозначается упругости к) 22 может быть рассчитана по микроиндентирования АСМ и сообщили, когда коэффициент Пуассона, неизвестно. Для большинства биоматериалов коэффициент Пуассона находится в диапазоне от 0,4 до 0,5 из-за их высокого содержания воды. В диапазоне 0,3-0,5, коэффициент 1 / (1-υ 2) меняется только от 1.10-1.33, например, что разумные изменения коэффициента Пуассона оказывают лишь незначительное влияние на отчетный модуль. Увеличение модуля сдвига, что мы отчете за фиброзных тканей относительной к нормальной ткани в несколько раз по величине, подразумевая, что ошибки, связанные с изменением коэффициента Пуассона являются незначительными по отношению к изменениям механических свойств наблюдается.
Фактический алгоритм и код, который может быть использован для анализа сила-смещение данных с учетом конкретных условий применения и последующей характеристики различных групп населения форс-смещение кривых. Если более сложный анализ представляет интерес, можно ознакомиться с работой Лина и др.. 23. Авторы составлен ряд синергетических стратегий в алгоритм, который позволяет преодолеть многие из осложнений, которые ранее препятствует усилиям по автоматизации установки Герца моделей отступа данных.
Несколько других областях доступны для дальнейшего развития и использования этого метода. В случаях, когда есть заинтересованность в визуализации альвеолярных стены без антител маркировки, как эластин и коллаген могут быть визуализированы с их autofluorescent сигнал в зеленом спектре. С другой стороны, лучше с изображениями, используя либо тоньше срезах тканей, 3D методов визуализации, или обоих, могло бы повысить умение соотносить ткани архитектуры с основными механическими свойствами. Хотя в настоящее время методы позволяют окрашивания и визуализации компонентов внеклеточного матрикса, таких как коллаген и ламинин, дополнительные усилия могли бы быть направлены на окрашивание маркеры клеточной поверхности для определения конкретных клеточных популяций и охарактеризовать механические микросреды в непосредственной близости от таких групп населения. Alternatively, ткань может быть собран из мышей, экспрессирующих флуоресцентно с метками линии маркеров или сотовый специфических белков к достижению той же цели. Наконец, метод подробно описаны здесь появляется хорошо подходит для характеристики других анатомических особенностей в легких, таких как суда, которые реконструируют при гипертонии, и дыхательные пути которых реконструируют в астму. Основываясь на своем текущем состоянии развития и потенциал для дальнейшего расширения, АСМ микроиндентирования, похоже, намерен дать ценную способность проникновения в суть изменений в тканях жесткости, которые сопровождают развитие болезни в легких, и, несомненно, будет иметь значение для характеристики пространственных и временных изменений Жесткость ряд других мягких тканей.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим А. Тагер и Б. Ши за их постоянное сотрудничество, а также для обеспечения легочной ткани используются для демонстрационных целей здесь. Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья грант HL-092 961. Эта работа была выполнена частично в Центре наноразмерных систем (ЦНС), член Национальной сетевой инфраструктуры нанотехнологий, которая поддерживается Национальным Фондом Науки под NSF награду ECS-0335765. ЦНС является частью факультета искусств и наук в Гарвардском университете.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM tip | Novascan Technologies, Inc. | PT.GS | 5 micron Borosilicate bead, 0.06 N/m |
| Poly-L-Lysine coverslips | VWR international | 354085 | BD BioCoat 12 mm round No.1 glass |
| Agarose, Low Gelling Temperature | Sigma-Aldrich | A0701 | |
| Rabbit anti-Collagen I (Rb pAb) antibody | Abcam | ab34710-100 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit antibody | Invitrogen | A11010 | |
| Rabbit anti-Laminin | Sigma-Aldrich | L9393 |
References
- Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells. Am J Physiol Cell Physiol. 279, C1345-C1350 (2000).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Klein, E. A. Cell-cycle control by physiological matrix elasticity and in vivo tissue stiffening. Curr. Biol. 19, 1511-1518 (2009).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Bergner, A., Sanderson, M. J. Airway contractility and smooth muscle Ca(2+) signaling in lung slices from different mouse strains. J Appl Physiol. 95, 1325-1332 (2003).
- Thundat, T., Warmack, R. J., Chen, G. Y., Allison, D. P. Thermal and ambient-induced deflections of scanning force microscope cantilevers. Appl Phys Lett. 64, 2894-2896 (1994).
- Mahaffy, R. E., Shih, C. K., MacKintosh, F. C., Kas, J. Scanning probe-based frequency-dependent microrheology of polymer gels and biological cells. Phys Rev Lett. 85, 880-883 (2000).
- Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophys. J. 82, 2798-2810 (2002).
- Butler, J. P., Nakamura, M., Sasaki, H., Sasaki, T., Takishima, T. Poissons' ratio of lung parenchyma and parenchymal interaction with bronchi. Jap. J. Physiol. 36, 91-106 (1986).
- Liu, F. Feedback amplification of fibrosis through matrix stiffening and COX-2 suppression. J Cell Biol. 190, 693-706 (2010).
- Ebihara, T., Venkatesan, N., Tanaka, R., Ludwig, M. S. Changes in extracellular matrix and tissue viscoelasticity in bleomycin-induced lung fibrosis. Temporal aspects. Am J Respir Crit Care Med. 162, 1569-1576 (2000).
- Dolhnikoff, M., Mauad, T., Ludwig, M. S. Extracellular matrix and oscillatory mechanics of rat lung parenchyma in bleomycin-induced fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 160, 1750-1757 (1999).
- Rehfeldt, F., Engler, A. J., Eckhardt, A., Ahmed, F., Discher, D. E. Cell responses to the mechanochemical microenvironment--implications for regenerative medicine and drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 59, 1329-1339 (2007).
- Berry, M. F. Mesenchymal stem cell injection after myocardial infarction improves myocardial compliance. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, 2196-2203 (2006).
- Azeloglu, E. U., Bhattacharya, J., Costa, K. D. Atomic force microscope elastography reveals phenotypic differences in alveolar cell stiffness. J Appl Physiol. 105, 652-661 (2008).
- Wagh, A. A. Localized elasticity measured in epithelial cells migrating at a wound edge using atomic force microscopy. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 54-60 (2008).
- Martinez, F. J., Flaherty, K. Pulmonary function testing in idiopathic interstitial pneumonias. Proc Am Thorac Soc. 3, 315-321 (2006).
- Cavalcante, F. S. Mechanical interactions between collagen and proteoglycans: implications for the stability of lung tissue. J Appl Physiol. 98, 672-679 (2005).
- Hajji, M. A., Wilson, T. A., Lai-Fook, S. J. Improved measurements of shear modulus and pleural membrane tension of the lung. J Appl Physiol. 47, 175-181 (1979).
- Lai-Fook, S. J., Wilson, T. A., Hyatt, R. E., Rodarte, J. R. Elastic constants of inflated lobes of dog lungs. J Appl Physiol. 40, 508-513 (1976).
- Azeloglu, E. U., Kaushik, G., Costa, K. D. Developing a hybrid computational model of AFM indentation for analysis of mechanically heterogeneous samples. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 4273-4276 (2009).
- A-Hassan, E. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy. Biophys J. 74, 1564-1578 (1998).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. J. Biomech. Eng. 129, 430-440 (2007).
