Summary
एक विधि नवजात hypoxia-ischemia के जैव रासायनिक मार्करों के उपाय वर्णित है. दृष्टिकोण उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) और गैस क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी / एमएस) का इस्तेमाल करता.
Protocol
1. नमूना संग्रह और प्रसंस्करण
- 6ml K3E EDTA K3 ट्यूब जो बर्फ पर रखा जाता है में खून का नमूना ले लीजिए.
- संग्रह के 2 मिनट के भीतर, 4 में नमूना अपकेंद्रित्र ° C 10 मिनट के लिए 1500 ग्राम में.
- एक 1.5ml microcentrifuge ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला (प्लाज्मा).
- 4 ° C पर 30 मिनट के लिए 18000 जी पर अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला aliquots निकालें और उन्हें अलग microcentrifuge ट्यूबों में प्यूरीन (200μl), allantoin (50μl), एमडीए (100μl), और XO विश्लेषण (120μl) के लिए स्थानांतरण. लाल रक्त कोशिकाओं के साथ नमूने दूषित नहीं सावधान रहो. आप एमडीए, XO, और purines उपलब्ध प्लाज्मा की कुल मात्रा पर आधारित के लिए प्लाज्मा की मात्रा को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है.
2. आंतरिक मानक, 2-Aminopurine (2 - एपी) Purine और XO विश्लेषण के लिए, तैयारी
- 0.01351g दो - एपी वजन और यह है कि एचसीएल की 2-5 बूंदों के साथ किया गया acidified है पानी के 8ml में जोड़ें. यदि 2 - एपी भंग नहीं है आप अधिक एसिड को जोड़ने की जरूरत है. 10ml के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करें.
- यूवी - विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करने के लिए अपने शेयर समाधान 2 - एपी के सच एकाग्रता का निर्धारण. (315 λmax, ε 4000).
- एक बार शेयर की एकाग्रता 2 - एपी समाधान निर्धारित किया जाता है, 1x10 -7 2 एपी mol प्यूरीन मापन के लिए आंतरिक मानक और 1x10 -8 mol 2 एपी XO माप के लिए आंतरिक मानक शामिल करने के लिए आवश्यक मात्रा की गणना.
- अलग microcentrifuge ट्यूबों में गणना की मात्रा विभाज्य और SpeedVac में सूखापन के लिए लुप्त हो जाना.
एक समीकरण: 
2 समीकरण: 
3. HPLC purines के मापन
- स्थानांतरण Microcon YM-10 केन्द्रापसारक फिल्टर और 4 पर डिवाइस अपकेंद्रित्र ° 1.5 घंटे के लिए 14,000 जी सी प्लाज्मा (200μl).
- छानना निकालें और एक microcentrifuge 1x10 -7 2 एपी mol युक्त ट्यूब को हस्तांतरण. छानना की मात्रा microcentrifuge ट्यूब 2 - एपी युक्त जोड़ा रिकॉर्ड करने के लिए सुनिश्चित करें. 10-20 सेकंड के लिए नमूने भंवर.
- एक HPLC के साथ नमूने का विश्लेषण. तीन 50 μl इंजेक्शन प्रत्येक नमूना के लिए उपयोग किया जाता है. नमूने Supelcosil LC-18-एस पर इंजेक्शन हैं, 15 सेमी x 4.6 मिमी, 5 सुक्ष्ममापी स्तंभ Supelguard LC-18-एस स्तंभ गार्ड के साथ सुसज्जित है. विलायक एक पानी, विलायक बी मेथनॉल, विलायक सी 50mm अमोनियम formate बफर, 5.5 पीएच: ढाल तालिका 1 में वर्णित शर्तों को पर्याप्त चोटी जुदाई को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए है.
| समय | फ्लो (/ एमएल मिनट) | % | % बी | % सी | |
| 1 | 1.00 | 0.0 | 0.0 | 100.0 | |
| 2 | 16.00 | 1.00 | 0.0 | 0.0 | 100.0 |
| 3 | 17.00 | 1.00 | 100.0 | 0.0 | 0.0 |
| 4 | 22.00 | 1.00 | 100.0 | 0.0 | 0.0 |
| 5 | 27.00 | 1.00 | 0.0 | 100.0 | 0.0 |
| 6 | 32.00 | 1.00 | 0.0 | 100.0 | 0.0 |
| 7 | 33.00 | 1.00 | 100.0 | 0.0 | 0.0 |
| 8 | 38.00 | 1.00 | 100.0 | 0.0 | 0.0 |
| 9 | 39.00 | 1.00 | 0.0 | 0.0 | 100.0 |
| 10 | 45.00 | 1.00 | 0.0 | 0.0 | 100.0 |
प्यूरीन यौगिकों के HPLC माप के लिए तालिका 1. सॉल्वेंट परिवर्तन.
- नमूना में purines की एकाग्रता का निर्धारण करते हैं. यों hypoxanthine, xanthine, और यूरिक एसिड को बनाए रखने और तालिका में वर्णित 2. 2 - एपी के शिखर क्षेत्र का निर्धारण तरंगदैर्य में चोटी क्षेत्रों को प्राप्त करने के द्वारा. 2 - एपी hypoxanthine, xanthine के क्षेत्र अनुपात, और यूरिक एसिड का निर्धारण और μmolar सांद्रता मानक घटता का उपयोग करने के लिए अनुपात कन्वर्ट.
| अवधारण समय * | मनाया λ अधिकतम * | Λ अधिकतम 19 रिपोर्टेड | Ε अधिकतम 19 रिपोर्टेड | |
| यूरिकअम्ल | ~~ 3.5 मिनट | 288 | 283 [2] | 11,500 [2] |
| Hypoxanthine | ~~ 7.0 मिनट | 248 | 248 [1] | 10,800 [1] |
| Xanthine | ~~ 9.5 मिनट | 267 | 267 [2] | १०२०० [2] |
| 2-Aminopurine | ~~ 12.5 मिनट | 305 | 314 [2] | +४,००० [2] |
तालिका 2 ठेठ प्रतिधारण purines और आंतरिक मानक के लिए और समय λ अधिकतम . * HPLC पर निश्चय 1mL/min का एक प्रवाह की दर के साथ isocratic 50mm अमोनियम formate बफर (5.5 पीएच) का उपयोग कर. पीएच [] में है.
- तीन प्रतियों में सभी नमूनों का विश्लेषण, लेकिन केवल बाद में विश्लेषण के लिए मूल्यों में शामिल अगर विभिन्नता का गुणांक 10% से कम है.
4. जीसी / एमएस allantoin के मापन
- जोड़ें 50μl 10μM डीएल-allantoin 5 - 13 सी, 1 - 15 50 μl नमूना संग्रह और प्रसंस्करण के दौरान allantoin परख के लिए अलग सेट प्लाज्मा N (आंतरिक मानक) .
- इस प्लाज्मा समाधान के लिए 100 μl acetonitrile जोड़ें.
- भंवर 10-20 के लिए मिश्रण सेकंड तो 4 बजे 10 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस +२०००० जी अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें, यह एक जीसी / एमएस शीशी में जगह है और एन के तहत शुष्क 2.
- सूखने के बाद, pyridine में (MTBSTFA) एन tert-Butyldimethylsilyl - एन methyltrifluoroacetamide (01:01 खंड / खंड), टोपी शीशियों एजेंट derivatizing के 50 μl जोड़ने और उन्हें 50 में सेते ° 2 एच. के लिए सी 15 एन, क्रमशः 20 1; यह derivatization allantoin और सी डीएल-allantoin-5-13 के लिए पैदावार लगातार 398.0 और 400.0 के quantifiable मी / z चोटियों .
- Agilent टेक्नोलॉजीज जीसी 6890N और एमएस 5973 नमूनों का विश्लेषण एक ऑटो पारखी के साथ सुसज्जित है. एक 122-5532G केशिका स्तंभ (25.7m लंबाई, आंतरिक व्यास 0.25mm) Agilent परिसर जुदाई प्रदर्शन. वाहक गैस के रूप में 1.5 मिलीलीटर / मिनट की एक प्रवाह दर पर हीलियम का प्रयोग करें. विभाजन मोड (20:01 अनुपात, विभाजन प्रवाह 29.4 मिलीग्राम / मिनट, कुल प्रवाह 33.8 मिलीग्राम / मिनट विभाजित) में derivatized उत्पाद (1 μl) इंजेक्षन. 100 पर प्रारंभिक स्तंभ तापमान सेट ° सी और 2 मिनट के लिए उस तापमान पर यह 180 के लिए बढ़ती से पहले पकड़ डिग्री सेल्सियस 10 के दर पर डिग्री सेल्सियस / मिनट. 4 मिनट के लिए तापमान पकड़ो और फिर इसे 260 डिग्री सेल्सियस डिग्री सेल्सियस मिनट / 20 की दर में वृद्धि. चलाने के अंत तक यह तापमान बनाए रखें. प्रत्येक नमूने के बाद, hexane के 2 इंजेक्शन के साथ स्तंभ साफ.
- यों allantoin का चयन करें आयन निगरानी मोड डीएल-allantoin-5-13 सी के लिए, जबकि 398.0 मीटर z / आयन allantoin के लिए और 400.0 मी / z आयन निगरानी का उपयोग कर, 1 - 15 एन Allantoin के micromolar सांद्रता तैयार मानक वक्र का उपयोग करने के लिए / allantoin (भारी allantoin) आयन बहुतायत के अनुपात में कनवर्ट करें.
- सभी नमूनों तीन प्रतियों में विश्लेषण कर रहे हैं, लेकिन कम से कम 10% की भिन्नता के गुणांक के साथ ही मूल्यों को आगे के विश्लेषण में उपयोग किया जाता है.
5. एमडीए विश्लेषण के लिए आंतरिक मानक, मिथाइल Malondialdehyde (MMDA), की तैयारी
- 1477μl 7m NaOH के लिए एक 100ml दौर नीचे फ्लास्क में 3 ethoxymethacrolein 523μl जोड़ें. Stirbar जोड़ें.
- एक पानी के स्नान में 45 फ्लास्क प्लेस डिग्री सेल्सियस और हलचल जब तक प्रतिक्रिया पूरा करने के लिए चला गया है. यह मोटे तौर पर 140 मिनट लेने चाहिए. तरल पदार्थ की एक 10μl विभाज्य 10 मिनट के अंतराल पर समय - समय को हटाने के द्वारा प्रतिक्रिया की प्रगति मॉनिटर. प्रत्येक 50 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट बफर (7 पीएच) का उपयोग कर और यूवी विज़ के साथ absorbance को मापने 5 10 के एक पहलू द्वारा एकत्र नमूने पतला. एक बार 275nm पर absorbance तक पहुँच 0.658 मोटे तौर पर प्रतिक्रिया पूरा हो गया है. के रूप में प्रतिक्रिया की प्रगति, पीले तो नारंगी समाधान बंद हो जाएगा.
- प्रतिक्रिया के लिए एक अतिरिक्त 15 मिनट के लिए प्रगति की अनुमति दें.
- दौर नीचे फ्लास्क के लिए आसुत विआयनीकृत जल के 5ml जोड़ें और एक जुदा कीप करने के लिए हल हस्तांतरण. पानी की एक अतिरिक्त 3 मिलीलीटर का उपयोग करने के लिए कीप में कुप्पी की सामग्री धो. कीप के लिए पानी की एक अतिरिक्त 2ml जोड़ें.
- समाधान 5 मिलीलीटर dichloromethane के साथ 3 बार निकालें. प्रत्येक निकासी के बाद कार्बनिक परत त्यागें.
- तीसरे निष्कर्षण के बाद, एक दौर नीचे फ्लास्क जलीय परत हस्तांतरण और सूखापन rotovap.
- 3ml इथेनॉल और एक पूर्व तौला 15ml शंक्वाकार ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण में उत्पाद Resuspend. एक अतिरिक्त 2ml इथेनॉल के साथ फ्लास्क कुल्ला और शंक्वाकार ट्यूब कुल्ला जोड़ने.
- 5ml बेंजीन जोड़ें और गर्म पानी में ट्यूब सेते हैं जब तक उत्पाद तो घुल तुरंत बर्फ पर 10 मिनट के लिए ट्यूब की जगह. यह 15000 जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटायें.
- Precip के लिए 5ml इथेनॉल और 5 मिलीलीटर isopropyl ईथर जोड़ेंitant. गर्म पानी में ट्यूब incubating और समय - समय पर झुकने ट्यूब बहुत धीरे से तेज़ भंग. एक बार वेग भंग कर रहा है, बर्फ पर 10 मिनट के लिए ट्यूब जगह. इस recrystallization इथेनॉल और isopropyl ईथर के साथ दो से अधिक बार प्रदर्शन करना. उत्पाद के कुछ अघुलनशील सफेद हिस्सा गठन किया जा सकता है.
- पिछले recrystallization कदम के बाद बहुत संभव है और सूखी एक Speedvac में परिणामी उत्पाद के रूप में सतह पर तैरनेवाला के रूप में हटा दें. संश्लेषित उत्पाद के साथ शंक्वाकार ट्यूब वजन.
- ट्यूब भंवर 5ml पानी जोड़ें, और बाहर किसी भी शेष ठोस फ़िल्टर.
- यूवी की तुलना स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का प्रयोग MMDA के अंतिम एकाग्रता का निर्धारण. MMDA के लिए 50 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट बफर में λmax (7 पीएच) 29,900 एम -1 -1 सेमी 14 के विलुप्त होने गुणांक के साथ 274 एनएम है .
6. जीसी / एमएस एमडीए के मापन
- 9ml इथेनॉल के लिए 0.11 छ BTH से जोड़ने और 10ml के लिए अंतिम मात्रा का समायोजन करके 0.5mm butylated इथेनॉल में हाइड्रॉक्सिल टोल्यूनि BTH () के एक समाधान तैयार करें. फिर 990μl इथेनॉल के लिए इस केंद्रित समाधान के 10μl जोड़कर एक कमजोर पड़ने का प्रदर्शन.
- 50mm फिनाइल hydrazine की एक समाधान 995μl पानी की एक अंधेरे microcentrifuge ट्यूब में फिनाइल hydrazine की 4.92μl जोड़कर तैयार करें. भंवर समाधान.
- 100μl नमूना संग्रह और प्रसंस्करण के दौरान एमडीए परख के लिए अलग सेट प्लाज्मा 5μl 10μM MMDA जोड़ें.
- फिर / MMDA प्लाज्मा 4 पीएच पर 200μl 1M सोडियम साइट्रेट के अलावा द्वारा पीछा मिश्रण 10μl 0.5mm BTH से जोड़ने के इस पीएच नमूना का सही derivatization के लिए महत्वपूर्ण है.. एक उच्च या कम पीएच विषम एमडीए स्तर में परिणाम देगा.
- 480μl के अंतिम मात्रा करने के लिए आसुत विआयनीकृत जल जोड़कर अंतिम मिश्रण पतला.
- 20μl 50mm फिनाइल hydrazine जोड़ने, शीशियों कैपिंग और एक कक्षीय हिलनेवाला पर 30 मिनट के लिए 25 में समाधान ° सी incubating द्वारा समाधान Derivatize.
- Hexane, 1 मिनट, 10 मिनट के लिए 3000 rpm पर अपकेंद्रित्र के लिए भंवर के 1ml जोड़ें.
- एक शीशी जीसी / एमएस के लिए कार्बनिक परत स्थानांतरण और एन धारा 2 द्वारा 100μl का हल ध्यान केंद्रित .
- ऑटो पारखी का उपयोग एक जीसी / एमएस के नमूने का विश्लेषण. प्रदर्शन एक Agilent पर यौगिक जुदाई 122 5532G केशिका स्तंभ (25.7 मीटर लंबाई, 0.25 मिमी आंतरिक व्यास). वाहक गैस के रूप में 0.6-0.8 मिलीलीटर / मिनट की एक प्रवाह दर पर हीलियम का प्रयोग करें. विभाजन मोड (20:01 अनुपात विभाजन, विभाजन प्रवाह 23.0 मिलीग्राम / मिनट, कुल प्रवाह 27.1 मिलीलीटर / मिनट) में derivatized उत्पाद (2 μl) इंजेक्षन. 110 पर प्रारंभिक स्तंभ तापमान सेट ° सी और 1 मिनट के लिए पहले यह 250 से बढ़ रही है उस तापमान पर पकड़ डिग्री सेल्सियस 40 की दर पर डिग्री सेल्सियस / मिनट. चलाने के अंत तक यह तापमान बनाए रखें. प्रत्येक नमूने के बाद, hexane के 2 इंजेक्शन के साथ स्तंभ साफ.
- एमडीए यों का चयन करें आयन निगरानी मोड का उपयोग कर 144.00 मीटर / एमडीए के लिए z और 158.00 मी / MMDA के लिए z का उपयोग. Micromolar सांद्रता का उपयोग एक मानक वक्र / एमडीए MMDA आयन बहुतायत के अनुपात में कनवर्ट करें.
- तीन प्रतियों में नमूनों का विश्लेषण और कम से कम 10% के गुणांक परिवर्तन के साथ ही मानों का उपयोग.
7. Xanthine oxidase के HPLC मापन
- xanthine oxidase समारोह का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता एक उपयुक्त (pterin) सब्सट्रेट के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपने उत्पाद (isoxanthopterin) के स्तर को मापने की क्षमता पर निर्भर है. प्लाज्मा 0 मिनट (नियंत्रण) के लिए या 4 घंटे के लिए सब्सट्रेट के साथ incubated है, और ऊष्मायन निर्भर उत्पाद रूपांतरण के लिए सब्सट्रेट निर्धारित किया जाता है.
- प्रत्येक ट्यूब (0 और 4) 240μl 0.2 एम Tris - एचसीएल (9.0 पीएच) बफर और 4.63μl 7.083x10 -3 एम pterin जोड़ें और उन्हें 37 में preincubate ° 5 मिनट के लिए सी.
- प्रत्येक ट्यूब प्लाज्मा की 60μl जोड़कर एंजाइम की प्रतिक्रिया आरंभ करें.
- तत्काल 4 HClO नियंत्रण ट्यूब (0 मिनट) 300μl 4% पर जोड़ने के अन्य मिश्रण शमन से पहले 4 घंटे के लिए 300μl 4% 4 HClO के साथ प्रतिक्रिया सेते की अनुमति.
- 4 HClO के अलावा के बाद, सख्ती ट्यूब हिला और फिर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस 15000 छ अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला के 500μl निकालें और 5M कश्मीर 2 3 सीओ 20μl जोड़ने बेअसर. सख्ती ट्यूब हिला और फिर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस 15000 छ पर अपकेंद्रित्र.
- एक microcentrifuge 1x10 -8 2 एपी mol युक्त ट्यूब के लिए निष्प्रभावी समाधान के 350μl जोड़ें.
- एक स्कैनिंग प्रतिदीप्ति डिटेक्टर के साथ सुसज्जित एक HPLC पर नमूने का विश्लेषण. तीन 50 μl इंजेक्शन प्रत्येक नमूना के लिए उपयोग किया जाता है. नमूने Wacosil 5C-18-200 250 मिमी 6.0 x मिमी, 5 सुक्ष्ममापी Supelguard स्तंभ LC-18-एस गार्ड के साथ सुसज्जित स्तंभ पर अंतःक्षिप्त किया जाएगा. 95% 20mm केपीओ 4 बफर (2.2 पीएच) और एक प्रवाह दर 1ml/min पर 5% मेथनॉल: निम्नलिखित isocratic शर्तों पर्याप्त चोटी जुदाई और पहचान प्राप्त किया होना चाहिए. प्रतिदीप्ति डिटेक्टर के लिए 345 एनएम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और उत्सर्जन लहर सेटलंबाई 410 एनएम.
- Pterine के अनुपात और प्रतिदीप्ति डिटेक्टर स्पेक्ट्रम से पीक क्षेत्रों को प्राप्त करने के द्वारा 2 एपी isoxanthopterine का निर्धारण करते हैं. स्पेक्ट्रम में पहली शिखर ~ 5 मिनट, 2 - एपी से मेल खाती है है. दूसरी और सबसे बड़ी चोटी pterine जाएगा. Isoxanthopterine शिखर पिछले elutes.
- 0 और 4 घंटे ऊष्मायन समय अंक के बीच isoxanthopterine/2-AP चोटी क्षेत्र अनुपात में अंतर को प्राप्त करते हैं. इस मान का उपयोग करने के लिए मानक घटता से XO गतिविधि की गणना.
- Triplicates में नमूनों का विश्लेषण, लेकिन केवल मानों का उपयोग कम से कम 10% के गुणांक परिवर्तन के साथ.
8. प्रतिनिधि परिणाम:
प्यूरीन यौगिकों के HPLC मात्रा का ठहराव का एक उदाहरण चित्र 1A में दिखाया गया है. विशिष्ट अवधारण समय और hypoxanthine, xanthine के उत्सर्जन तरंगदैर्य, और यूरिक एसिड (तालिका 2) प्यूरीन यौगिकों के साथ - साथ मात्रा का ठहराव की अनुमति . जब परख सही ढंग से चलाया जाता है, यौगिकों पर्याप्त जुदाई है और चोटी आकृति तेज और unimodal जाएगा. इन चोटियों तो सांद्रता, तालिका 3 में दिखाया पर्वतमाला में परिवर्तित कर रहे हैं, मानक घटता के उपयोग के माध्यम से. क्योंकि इस परख के लिए नमूना प्रसंस्करण कम है, केवल नमूना आधारित जो समस्याएं पैदा हो सकता है लाल रक्त कोशिकाओं की lysing होगा. यदि लाल रक्त कोशिकाओं lyse पहले नमूने centrifuged हैं, प्लाज्मा एक नारंगी / लाल रंग पर ले लो और hypoxic ischemia के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल नहीं कर सकते हैं. अन्य मुद्दों पर जो पैदा हो सकता है जब purines मापने HPLC प्रणाली और स्तंभ (चित्रा 1 बी) शामिल है. अगर वहाँ HPLC प्रणाली में हवा बुलबुले हैं प्रतिधारण बार बदलाव और HPLC दबाव में नाटकीय उतार चढ़ाव हो जाएगा. यदि गार्ड कारतूस को बदलने की जरूरत है, दबाव बढ़ाने के लिए और चोटियों को चौड़ा करने और द्वि या त्रि - मॉडल बन जाएगा.
| Hypoxanthine (सुक्ष्ममापी) | Xanthine (सुक्ष्ममापी) | यूरिक एसिड (सुक्ष्ममापी) | Xanthine oxidase ((nmol उत्पाद) / मिनट) | Malondialdehyde (सुक्ष्ममापी) | Allantoin (सुक्ष्ममापी) | |
| अवधि Normoxic | 1.13-19.3 (64) | .02-3.69 (61) | 107.20-726.12 (63) | 2.47x10 -6 - 3.92x10 -3 (20) | 0.44-3.76 (53) | NA |
| अवधि श्वसन संकट | 1.78-12.59 (27) | .07-11.8 (24) | 225.40-653.32 (27) | 0 - 1.03x10 -5 (8) | .82-2.73 (24) | NA |
| अवधि hypoxic | 0.38-31.80 (13) | .11-2.88 (13) | 235.65-1348.13 (13) | -236.44 1.20x10 -5 (9) | .95-2.15 (7) | NA |
| Preterm Normoxic | 1.54-4.39 (9) | .03-1.77 (9) | 178.92-593.49 (9) | 2.46x10 -5 - 5.44x10 -4 (2) | .95-2.74 (8) | 2.30-5.26 (67) |
| Preterm श्वसन संकट | 3.04-8.04 (2) | NA | 327.56-365.11 (2) | NA | 2.40-3.46 (3) | NA |
न्यूनतम अधिकतम (एन)
टेबल 3. Purines, xanthine oxidase, malondialdehyde, और allantoin के लिए प्रतिनिधि पर्वतमाला .
Allantoin की मात्रा का ठहराव जीसी / एमएस की एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है. क्योंकि derivitized allantoin और derivitized भारी allantoin के बड़े पैमाने पर जाना जाता है का चयन करें, आयन मोड सामूहिक कल्पना पर इन यौगिकों की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि परख सही ढंग से किया है, दो चोटियों समान प्रतिधारण समय में मनाया जाएगा. Allantoin के लिए संगत (398.00 मी / z) और भारी allantoin (400.00 मी / z) अन्य. इन चोटियों तो सांद्रता, तालिका 3 में दिखाया पर्वतमाला में परिवर्तित कर रहे हैं, एक मानक वक्र के प्रयोग के माध्यम से. यदि परख गलत तरीके से चलाया जाता है, और नमूने ठीक नहीं derivitized थे, चोटियों मौजूद नहीं हो सकता है या मात्रात्मक प्रतिनिधि नहीं हो सकता है हो सकता है. एक बार फिर, यदि लाल रक्त कोशिकाओं lysed प्लाज्मा नवजात hypoxic ischemia में oxidative तनाव का मूल्यांकन नहीं किया जा इस्तेमाल किया जा सकता है.
एमडीए की मात्रा का ठहराव के लिए परिणाम allantoin के लिए अपवाद है कि दो चोटियों अलग प्रतिधारण समय पर मनाया जाता है के साथ उन लोगों के लिए समान हैं. कम ~ 3.5 प्रतिधारण समय मिनट, एक 144.00 मीटर / z एमडीए के लिए चोटी और ~ 4 मिनट प्रतिधारण समय में, एक 158.00 मीटर / z MMDA के लिए पीक (चित्रा 3) मनाया जाता है. इन चोटियों तो सांद्रता, तालिका 3 में दिखाया पर्वतमाला में परिवर्तित कर रहे हैं, एक मानक वक्र के प्रयोग के माध्यम से. यदि परख गलत तरीके से चलाया जाता है, या नमूने ठीक से नहीं derivitized हैं, कोई चोटियों जब 144.00m / z और / 158.00m जेड चुनने के लिए मनाया जा सकता है है ऐसा लगता है कि ध्यान दिया जाना चाहिएअगर वहाँ सांस मौखिक feedings या नसों लिपिड प्रशासन से प्लाज्मा में लिपिड का एक अतिरिक्त है, प्लाज्मा एक दूधिया उपस्थिति पर लेने के लिए और नवजात hypoxic ischemia में oxidative तनाव का मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है.
Xanthine oxidase समारोह के HPLC आधारित मात्रा का ठहराव का एक उदाहरण चित्रा 4 में दिखाया गया है. यदि परख सही ढंग से चलाया जाता है, तीन चोटियों फ्लोरोसेंट डिटेक्तार के साथ मनाया जाना चाहिए, pterin के लिए, एक isoxanthopterin के लिए, और एक 2 - एपी के लिए. इन चोटियों तो सांद्रता, तालिका 3 में दिखाया पर्वतमाला में परिवर्तित कर रहे हैं, एक मानक वक्र के प्रयोग के माध्यम से. वहाँ भी एक isoxanthopterin और पीडीए डिटेक्टर से उत्पन्न स्पेक्ट्रम पर 2-AP इसी चोटी होना चाहिए. यदि एंजाइम गतिविधि अनुपस्थित है, isoxanthopterin को इसी शिखर नहीं देखा जाएगा. क्योंकि इस परख एंजाइम समारोह के उपाय, दोहराया ठंड और नमूने के विगलन इस बदल सकता है.
चित्रा 1. HPLC प्यूरीन यौगिकों की पहचान के लिए स्पेक्ट्रम . ए). प्रतिनिधि परिणाम अगर परख सही ढंग से चलाने किया गया था. बी). प्रतिनिधि परिणाम अगर वहाँ HPLC, स्तंभ, या गार्ड कारतूस के साथ एक समस्या है.
चित्रा 2. Allantoin की मात्रा का ठहराव के लिए स्पेक्ट्रम जीसी / एमएस 398.00 आयन मी / z के लिए allantoin संगत में चोटी . आयन 400.00 मी / z चोटी पर भारी allantoin से मेल खाती है है.
चित्रा 3. एमडीए की मात्रा का ठहराव के लिए स्पेक्ट्रम जीसी / एमएस आयन 144.00 मी / z शिखर एमडीए से मेल खाती है . आयन 158.00 मी / z शिखर MMDA से मेल खाती है.
चित्रा 4. HPLC स्पेक्ट्रम XO गतिविधि की माप के लिए एक) 0 मिनट ऊष्मायन और 4 घंटे ऊष्मायन समय के लिए समय बी) के प्रतिनिधि के परिणाम के लिए प्रतिनिधि का परिणाम है. नोट 4 घंटे ऊष्मायन समय के लिए उच्च isoxanthopterine चोटी (~ 17 मिनट पर). प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम में 2 एपी ~ ~ 10min पर 5min और pterine अगले elutes पर पहली elutes.
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Discussion
यहाँ वर्णित तरीकों नवजात hypoxia ischemia के मूल्यांकन की अनुमति. इस प्रोटोकॉल की उपस्थिति एक समग्र जैव रासायनिक चित्र या यहाँ तक कि hypoxic ischemia की डिग्री हासिल करने के लिए ऊर्जा के अभाव (एटीपी), oxidative तनाव, oxidative नुकसान, और एंजाइम गतिविधि के मार्करों के माप को जोड़ती है. इस पद्धति की उपयोगिता के बावजूद, वहाँ संभावित सीमाएं हैं. सबसे पहले, यह मोटे तौर पर खून की 1-2 मिलीलीटर लेता करने के लिए पर्याप्त प्लाज्मा इकट्ठा करने के लिए assays के सभी चलाने. यह वयस्कों या बच्चों में एक समस्या नहीं हो, लेकिन यह एक चिंता का विषय बन जाता है जब नवजात शिशुओं, विशेष रूप से जो समय से पहले कर रहे हैं के साथ काम कर रहे हैं. हम assays प्राथमिकता है और यदि आवश्यक हो तो कुछ नमूनों की गिराए द्वारा इस मुद्दे के आसपास काम दूसरे, यह MMDA synthesize करने के लिए मुश्किल हो सकता है, लेकिन deuterated, एमडीए MMDA के लिए एक आंतरिक मानक के रूप में एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
इन सीमाओं के बावजूद, विधियों नवजात hypoxia ischemia के रूप में अच्छी तरह से असंतुलित redox homeostasis के साथ जुड़े विकारों के मूल्यांकन में एक उपयोगी उपकरण प्रदान करते हैं वर्णित है. इसके अलावा, इन मार्करों के सभी XO के अपवाद के साथ, मूत्र में मापा जा सकता है, निगरानी नवजात शिशुओं की एक गैर इनवेसिव साधन उपलब्ध कराने.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम - R01 NR011209 03 स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा वित्त पोषित है
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6ml K3E EDTA K3 tube | Fisher Scientific | 2204061 | |
| 5702R centrifuge | Fisher Scientific | 05413319 | With 13&16MM adaptor |
| 1.5ml microcentrifuge tube | USA Scientific, Inc. | 1615-5599 | |
| 2-Aminopurine | Sigma-Aldrich | A3509 | |
| Varian Cary 100 spectrophotometer | Agilent Technologies | 0010071500 | |
| Savant SpeedVac | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SC210A-115 | |
| Micron centrifugal filter device | Fisher Scientific | UFC501596 | |
| Supelcosil LC-18-S Column | Sigma-Aldrich | 58931 | |
| Supelcosil LC-18-S Supelguard cartridge and holder | Sigma-Aldrich | 59629 | |
| HPLC | Waters | ||
| GCMS Vial | Fisher Scientific | 03376607 | |
| DL-Allantoin-5-13C;1-15N | CDN Isotopes | M-2307 | Lot #L340P9 |
| MTBSTFA | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 48920 | |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | |
| 5973E GC/MSD | Agilent Technologies | G7021A | Part # for 5975E GC/MS |
| 3-Ethoxymethacrolein | Sigma-Aldrich | 232548 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Benzene | Sigma-Aldrich | 401765 | |
| Diisopropyl ether | Sigma-Aldrich | 38270 | |
| BHT | Sigma-Aldrich | B1378 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Phenylhydrazine | Sigma-Aldrich | P26252 |
References
- Harkness, R. A., Whitelaw, A. G., Simmonds, R. J. Intrapartum hypoxia: the association between neurological assessment of damage and abnormal excretion of ATP metabolites. J Clin Pathol. 35, 999-1007 (1982).
- Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant-current concepts. Early Hum Dev. 80, 125-141 (2004).
- Webster, W. S., Abela, D.
- Engerson, T. D., McKelvey, T. G., Rhyne, D. B., Boggio, E. B., Snyder, S. J., Jones, H. P. Conversion of xanthine dehydrogenase to oxidase in ischemic rat tissues. J Clin Invest. 79, 1564-1570 (1987).
- Choi, E. Y., Stockert, A. L., Leimkuhler, S., Hille, R. Studies on the mechanism of action of xanthine oxidase. J Inorg Biochem. 98, 841-848 (2004).
- Godber, B. L., Schwarz, G., Mendel, R. R., Lowe, D. J., Bray, R. C., Eisenthal, R. Molecular characterization of human xanthine oxidoreductase: the enzyme is grossly deficient in molybdenum and substantially deficient in iron-sulphur centres. Biochem J. 388, 501-508 (2005).
- Gruber, J., Tang, S. Y., Jenner, A. M., Mudway, I., Blomberg, A., Behndig, A. Allantoin in human plasma, serum, and nasal-lining fluids as a biomarker of oxidative stress: avoiding artifacts and establishing real in vivo concentrations. Antioxid Redox Signal. 11, 1767-1776 (2009).
- Zitnanova, I., Korytar, P., Aruoma, O. I., Sustrova, M., Garaiova, I., Muchova, J. Uric acid and allantoin levels in Down syndrome: antioxidant and oxidative stress mechanisms? Clin Chim Acta. 341, 139-146 (2004).
- Siciarz, A., Weinberger, B., Witz, G., Hiatt, M., Hegyi, T. Urinary thiobarbituric acid-reacting substances as potential biomarkers of intrauterine hypoxia. Arch Pediatr Adolesc Med. 155, 718-722 (2001).
- Buonocore, G., Perrone, S., Longini, M., Terzuoli, L., Bracci, R. Total hydroperoxide and advanced oxidation protein products in preterm hypoxic babies. Pediatr Res. 47, 221-224 (2000).
- Berne, R. M. Cardiac nucleotides in hypoxia: possible role in regulation of coronary blood flow. Am J Physiol. 204, 317-322 (1963).
- Harkness, R. A., Lund, R. J. Cerebrospinal fluid concentrations of hypoxanthine, xanthine, uridine and inosine: high concentrations of the ATP metabolite, hypoxanthine, after hypoxia. J Clin Pathol. 36, 1-8 (1983).
- Plank, M. S., Boskovic, D. S., Sowers, L. C., Angeles, D. M.
- Cighetti, G., Allevi, P., Anastasia, L., Bortone, L., Paroni, R. Use of methyl malondialdehyde as an internal standard for malondialdehyde detection: validation by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry. Clin Chem. 48, 2266-2269 (2002).
- Paroni, R., Fermo, I., Cighetti, G. Validation of methyl malondialdehyde as internal standard for malondialdehyde detection by capillary electrophoresis. Anal Biochem. 307, 92-98 (2002).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Ciuffreda, P., Allevi, P. Beta-ethoxyacrolein contamination increases malondialdehyde inhibition of milk xanthine oxidase activity. Free Radic Biol Med. 25, 818-825 (1998).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Paroni, R., Allevi, P. Free and total malondialdehyde assessment in biological matrices by gas chromatography-mass spectrometry: what is needed for an accurate detection. Anal Biochem. 266, 222-229 (1999).
- Yamamoto, T., Moriwaki, Y., Takahashi, S., Tsutsumi, Z., Yamakita, J., Nasako, Y. Determination of human plasma xanthine oxidase activity by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Biomed Appl. 681, 395-400 (1996).
- Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. Fasman, G. , 3 ed, CRC Press. Boca Raton. (1988).
- Chen, X. B., Calder, A. G., Prasitkusol, P., Kyle, D. J., Jayasuriya, M. C. Determination of 15N isotopic enrichment and concentrations of allantoin and uric acid in urine by gas chromatography/mass spectrometry. J Mass Spectrom. 33, 130-137 (1998).
