Summary
Een methode wordt beschreven om biochemische markers van neonatale hypoxie-ischemie te meten. De aanpak maakt gebruik van hoge druk vloeistofchromatografie (HPLC) en gaschromatografie-massaspectrometrie (GC / MS).
Abstract
Neonatale hypoxie ischemie wordt gekenmerkt door onvoldoende bloeddoorstroming van een weefsel of een systemische gebrek aan zuurstof. Deze voorwaarde wordt gedacht dat oorzaak / goed gedocumenteerd neonatale neurologische aandoeningen, waaronder bijzondere waardeverminderingen 1-3 verergeren. Verminderde productie van adenosine trifosfaat optreedt als gevolg van een gebrek aan oxidatieve fosforylering. Ter compensatie van deze energie verstoken status moleculen die bestaan uit hoge energie-fosfaat obligaties zijn afgebroken 2. Dit leidt tot verhoogde niveaus van adenosine, die wordt vervolgens afgebroken tot inosine, hypoxanthine, xanthine, en uiteindelijk naar urinezuur. De laatste twee stappen in dit proces degradatie worden uitgevoerd door xanthine oxidoreductase. Dit enzym bestaat in de vorm van xanthine dehydrogenase onder normoxische omstandigheden, maar wordt omgezet in xanthine-oxidase (XO) onder hypoxie-reperfusie omstandigheden 4, 5. In tegenstelling tot xanthine dehydrogenase, XO genereert waterstofperoxide als een bijproduct van purine degradatie 4, 6. Deze waterstof-peroxide in combinatie met andere reactive oxygen species (ROS) geproduceerd tijdens hypoxie, oxideert urinezuur te vormen allantoïne en reageert met lipide membranen te genereren malondialdehyde (MDA) 7-9. De meeste zoogdieren, de mens uitgezonderd, bezitten het enzym uricase, die zet urinezuur naar allantoïne. Bij de mens kan echter allantoïne alleen worden gevormd door ROS-gemedieerde oxidatie van urinezuur. Vanwege dit, is allantoïne beschouwd als een marker van oxidatieve stress bij mensen te zijn, maar niet in de zoogdieren die uricase hebben.
We beschrijven methoden gebruik hoge druk vloeistofchromatografie (HPLC) en gaschromatografie massaspectrometrie (GCMS) om biochemische markers van neonatale hypoxie ischemie te meten. Menselijk bloed wordt gebruikt voor de meeste tests. Dierlijk bloed kan ook worden gebruikt met erkenning van het potentieel voor uricase gegenereerde allantoïne. Purine metabolieten waren gekoppeld aan hypoxie al in 1963 en de betrouwbaarheid van hypoxanthine, xanthine, en urinezuur als biochemische indicatoren van de neonatale hypoxie werd gevalideerd door verschillende onderzoekers 10-13. De HPLC-methode wordt gebruikt voor de kwantificering van purine verbindingen is snel, betrouwbaar en reproduceerbaar zijn. De GC / MS methode die wordt gebruikt voor de kwantificering van allantoïne, een relatief nieuwe marker van oxidatieve stress, werd aangepast van Gruber et al. 7. Deze methode vermijdt bepaalde artefacten en vereist lage volumes van het monster. Methoden die worden gebruikt voor de synthese van MMDA werden elders 14 beschreven, 15. GC / MS kwantificering van de MDA was aangepast van Paroni et al.. en Cighetti et al.. 16, 17. Xanthine oxidase activiteit werd gemeten door middel van HPLC door het kwantificeren van de omzetting van pterine aan isoxanthopterin 18. Deze aanpak bleek voldoende gevoelig en reproduceerbaar.
Protocol
1. Sample Verzamelen en verwerken
- Verzamel bloedmonster in een 6 ml K3E EDTA K3 buis, die wordt gehouden op het ijs.
- Binnen 2 minuten van de collectie, centrifuge het monster bij 4 ° C bij 1500 g gedurende 10 minuten.
- Breng het supernatans (plasma) met een 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Centrifugeer bij 4 ° C bij 18.000 g gedurende 30 minuten.
- Verwijder het supernatant aliquots en zet ze in aparte microcentrifugebuizen voor purine (200μl), allantoïne (50μl), MDA (100μl), en de XO (120μl) analyse. Wees voorzichtig dat u de monsters besmet met rode bloedcellen. Mogelijk moet u de volumes van de plasma aan te passen voor MDA, XO, en purines op basis van het totale volume van het plasma aanwezig.
2. Voorbereiden interne standaard, 2-aminopurine (2-AP), voor Purine en XO-analyse
- Weeg 0.01351g 2-AP en voeg deze toe 8 ml van het water dat is aangezuurd met 2-5 druppels HCl. Als de 2-AP is niet op te lossen moet je meer zuur toe te voegen. Pas het uiteindelijke volume te 10ml.
- Gebruik maken van de UV-Vis spectrofotometer om de werkelijke concentratie van uw voorraad 2-AP oplossing te bepalen. (Λmax 315, ε 4000).
- Zodra de concentratie van de voorraad 2-AP oplossing is bepaald, het berekenen van de volumes nodig is om 1x10 -7 mol 2-AP interne standaard voor purine metingen en 1x10 -8 mol 2-AP interne standaard voor de XO-metingen bevatten.
- Aliquot de berekende volumes in afzonderlijke microcentrifugebuizen en damp deze volledig in een SpeedVac.
Vergelijking 1: 
Vergelijking 2: 
3. HPLC Meting van Purines
- Transfer plasma (200μl) om een Microcon YM-10 centrifugaal filter apparaat en centrifugeer bij 4 ° C bij 14.000 g gedurende 1,5 uur.
- Verwijder het filtraat en over te dragen aan een microcentrifugebuis met 1x10 -7 mol 2-AP. Zorg ervoor dat het volume van het filtraat toegevoegd aan het microcentrifugebuis met het 2-AP record. Vortex de monsters voor 10-20 sec.
- Analyseren monsters met een HPLC. Drie 50 ul injecties worden gebruikt voor elk monster. Monsters worden geïnjecteerd op een Supelcosil LC-18-S, 15 cm x 4,6 mm, 5 um kolom uitgerust met een Supelguard LC-18-S-kolom te bewaken. De gradiënt voorwaarden beschreven in tabel 1 moet worden gebruikt om adequate piek scheiding te verkrijgen: oplosmiddel A-water, oplosmiddel B-methanol, solvent C-50mm ammoniumformiaat-buffer, pH 5,5.
| Tijd | Flow (ml / min) | % A | % B | % C | |
| 1 | 1.00 | 0.0 | 0.0 | 100,0 | |
| 2 | 16,00 | 1.00 | 0.0 | 0.0 | 100,0 |
| 3 | 17,00 | 1.00 | 100,0 | 0.0 | 0.0 |
| 4 | 22,00 | 1.00 | 100,0 | 0.0 | 0.0 |
| 5 | 27,00 | 1.00 | 0.0 | 100,0 | 0.0 |
| 6 | 32,00 | 1.00 | 0.0 | 100,0 | 0.0 |
| 7 | 33,00 | 1.00 | 100,0 | 0.0 | 0.0 |
| 8 | 38,00 | 1.00 | 100,0 | 0.0 | 0.0 |
| 9 | 39,00 | 1.00 | 0.0 | 0.0 | 100,0 |
| 10 | 45,00 | 1.00 | 0.0 | 0.0 | 100,0 |
Tabel 1. Oplosmiddel veranderingen voor HPLC meting van purine verbindingen.
- Bepaal de concentratie van purines in het monster. Kwantificeer hypoxanthine, xanthine, en urinezuur door het verkrijgen van pieken gebieden op het behoud en de golflengten beschreven in Tabel 2. Bepaal het piekoppervlak van 2-AP. Bepaal het gebied verhoudingen van hypoxanthine, xanthine, en urinezuur tot en met 2-AP en zetten de verhoudingen om μmolar concentraties met behulp van standaard curves.
| Retentie Tijd * | Waargenomen λ max * | Gerapporteerde λ max 19 | Gerapporteerde ε max 19 | |
| Urine-Zuur | ~ 3,5 min | 288 | 283 [2] | 11.500 [2] |
| Hypoxanthine | ~ 7,0 min | 248 | 248 [1] | 10.800 [1] |
| Xanthine | ~ 9,5 min | 267 | 267 [2] | 10.200 [2] |
| 2-aminopurine | ~ 12,5 min | 305 | 314 [2] | 4000 [2] |
Tabel 2. Typische retentietijden en λ max voor purines en de interne standaard. * Bepaald op HPLC met behulp van isocratische 50 mM ammoniumformiaat buffer (pH 5,5) met een debiet van 1mL/min. pH-waarde is in [].
- Analyseer alle monsters in drievoud, maar alleen onder de waarden voor later analyses als de coëfficiënt van de variatie is minder dan 10%.
4. GC / MS Meting van Allantoin
- Voeg 50μl 10μM DL-Allantoïne-5-13 C, 1 - 15 N (interne standaard) om de 50 ul plasma gereserveerd voor de allantoïne test tijdens het verzamelen en verwerken.
- Voeg 100 ul acetonitril aan deze plasma oplossing.
- Vortex het mengsel voor 10-20 sec centrifugeer bij 4 ° C bij 20.000 g gedurende 10 minuten.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof, plaats het in een GC / MS flacon en droog onder N 2.
- Na het drogen, voeg 50 ul van derivatiserend middel N-tert-butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoroacetamide (MTBSTFA) in pyridine (1:1 vol / vol), cap de flesjes en incubeer ze op 50 ° C gedurende 2 uur Dit derivatisering levert consequent kwantificeerbare m / z pieken van 398,0 en 400,0 voor allantoïne en DL-allantoïne-5-13 C, 1 - 15 N, respectievelijk 20.
- Analyseer monsters op de Agilent Technologies GC 6890N en de MS 5973 voorzien van een automatische sampler. Voer compound scheiding op een Agilent 122-5532G capillaire kolom (25.7m lengte, 0,25 mm inwendige diameter). Gebruik helium als draaggas met een debiet van 1,5 ml / min. Injecteren gederivatiseerde product (1 pi) in split-modus (split-verhouding 20:1, split stroom 29,4 ml / min, de totale stroom 33,8 ml / min). Stel de eerste kolom temperatuur van 100 ° C en bij die temperatuur te houden gedurende 2 minuten voordat verhogen naar 180 ° C met een snelheid van 10 ° C / min. Houd de temperatuur voor de 4 min en vervolgens verhogen tot 260 ° C met een snelheid van 20 ° C / min. Handhaaf deze temperatuur tot het einde van de run. Na elk monster, het reinigen van de kolom met 2 injecties van hexaan.
- Kwantificeren allantoïne gebruikt te selecteren ion monitoring mode, terwijl het toezicht op de 398,0 m / z-ion voor allantoïne en de 400,0 m / z-ion voor de DL-allantoïne-5-13 C, 1 - 15 n. Zet de ion overvloed verhoudingen van allantoïne / (zware allantoïne) om micromolaire concentraties van allantoïne met behulp van een voorbereide standaard curve.
- Alle monsters worden geanalyseerd in drievoud, maar alleen waarden met een variatiecoëfficiënt van minder dan 10% worden gebruikt in verdere analyses.
5. Voorbereiden interne standaard, Methyl malondialdehyde (MMDA), voor MDA Analyse
- Voeg 523μl 3-ethoxymethacrolein naar 1477μl 7M NaOH in een 100 ml rondbodemkolf. Voeg een stirbar.
- Plaats de kolf in een waterbad bij 45 ° C en roer tot de reactie is gegaan naar de voltooiing. Dit duurt ongeveer 140 minuten. De voortgang van de reactie door het verwijderen van een 10μl hoeveelheid van de vloeistof regelmatig op 10 min. intervallen. Verdunnen elk monster verzameld door een factor van 10 5 met 50 mM kaliumfosfaatbuffer (pH 7) en het meten van de absorptie met het UV-Vis. Zodra de absorptie bij 275nm bereikt ongeveer 0.658 van de reactie is voltooid. Naarmate de reactie vordert, zal de oplossing geel dan oranje.
- Laat de reactie op vooruitgang voor een extra 15 minuten.
- Voeg 5 ml gedestilleerd gedemineraliseerd water aan de kolf met ronde bodem en breng de oplossing om een schei-trechter. Gebruik een extra 3 ml water aan de inhoud van de kolf te wassen in de trechter. Voeg een extra 2 ml water aan de trechter.
- Pak de oplossing 3 keer met 5 ml dichloormethaan. Verwijder na elke extractie van de organische laag.
- Na de derde extractie, de overdracht van de waterige laag om een kolf met ronde bodem en rotovap tot droog.
- Resuspendeer het product in 3 ml ethanol en overbrengen in een vooraf gewogen 15 ml conische buis. Spoel de kolf met een extra 2ml ethanol en voeg de spoel aan de conische buis.
- Voeg 5 ml benzeen en incubeer de buis in warm water totdat het product lost dan meteen de buis plaats op ijs gedurende 10 minuten. Centrifugeer het voor 5 min bij 15.000 g en verwijder het supernatant.
- Voeg 5 ml ethanol en 5 ml isopropyl ether om de neerslagitant. Los van de neerslag door het incuberen van de buis in warm water en periodiek het kantelen van de buis heel voorzichtig. Zodra neerslag wordt opgelost, plaats de buis op ijs gedurende 10 minuten. Voer deze herkristallisatie twee keer met ethanol en isopropyl ether. Sommige onoplosbare witte brokken van het product kan worden gevormd.
- Na de laatste stap herkristallisatie te verwijderen zoveel als mogelijk supernatant en droog het resulterende product in een Speedvac. Weeg de conische buis met de gesynthetiseerde product.
- Voeg 5 ml water aan de buis, vortex en filter deze op eventuele resterende vaste stoffen.
- Gebruik maken van de UV-vis spectrofotometer om de uiteindelijke concentratie van MMDA te bepalen. De λmax voor MMDA in 50 mM kaliumfosfaatbuffer (pH 7) is 274 nm met de extinctiecoëfficiënt van 29.900 m -1 cm -1 14.
6. GC / MS Meting van MDA
- Bereid een oplossing van 0,5 mm gebutyleerd hydroxyl tolueen (BTH) in ethanol door de toevoeging van 0,11 g BTH te 9ml ethanol en het aanpassen van het uiteindelijke volume op 10 ml. Voer vervolgens een verwatering door het toevoegen van 10μl van deze geconcentreerde oplossing te 990μl ethanol.
- Bereid een oplossing van 50mm fenyl hydrazine door het toevoegen van 4.92μl van fenyl hydrazine aan 995μl van water in een donkere microcentrifugebuis. Vortex de oplossing.
- Voeg 5μl 10μM MMDA aan de 100μl plasma gereserveerd voor de MDA test tijdens het verzamelen en verwerken.
- Dan 10μl 0.5mm BTH toe te voegen aan de MMDA / plasma mengsel, gevolgd door de toevoeging van 200μl 1M natriumcitraat bij pH 4. Deze pH is van cruciaal belang voor een correcte derivatisering van het monster. Een hogere of lagere pH-waarde zal resulteren in scheve MDA niveaus.
- Verdun de uiteindelijke mengsel door het toevoegen van gedestilleerd gedemineraliseerd water tot een eindvolume van 480μl.
- Derivatize de oplossing door het toevoegen van 20μl 50 mM fenyl hydrazine, aftopping van de flesjes en het incuberen van de oplossing bij 25 ° C gedurende 30 minuten op een rondschudapparaat.
- Voeg 1 ml hexaan, vortex gedurende 1 minuut, en centrifugeer bij 3000 rpm gedurende 10 minuten.
- Breng de organische laag tot een GC / MS flacon en concentratie van de oplossing voor 100μl door N 2 stroom.
- Analyseer monsters op een GC / MS met behulp van de automatische sampler. Voer compound scheiding op een Agilent 122-5532G capillaire kolom (25,7 m lengte, 0,25 mm inwendige diameter). Gebruik helium als draaggas met een debiet van 0,6-0,8 ml / min. Injecteren gederivatiseerde product (2 pi) in split-modus (split-verhouding 20:1, split stroom 23,0 ml / min, de totale stroom 27,1 ml / min). Stel de eerste kolom temperatuur van 110 ° C en bij die temperatuur te houden gedurende 1 min. voor en het tot 250 ° C met een snelheid van 40 ° C / min. Handhaaf deze temperatuur tot het einde van de run. Na elk monster, het reinigen van de kolom met 2 injecties van hexaan.
- Kwantificeren MDA gebruikt te selecteren ion monitoring modus met de 144,00 m / z voor MDA en de 158,00 m / z voor MMDA. Zet de MDA / MMDA ion overvloed verhoudingen om micromolaire concentraties met behulp van een standaard curve.
- Analyseren van monsters in drievoud en alleen waarden te gebruiken met een variatiecoëfficiënt van minder dan 10%.
7. HPLC Meting van xanthine-oxidase
- De detectie van xanthine-oxidase functie is afhankelijk van het vermogen om gevoelig meten van de niveaus van een geschikt substraat (pterine), evenals de product (isoxanthopterin). Plasma is geïncubeerd met de ondergrond zowel voor 0 min (controle) of voor 4 uur, en de incubatie-afhankelijke substraat product conversie wordt bepaald.
- Voeg 240μl 0,2 M Tris-HCl buffer (pH 9,0) en 4.63μl 7.083x10 -3 M pterine aan elke buis (0 en 4 uur) en preincubate ze op 37 ° C gedurende 5 minuten.
- Start de enzymreactie door het toevoegen van 60μl van plasma aan elke buis.
- Onmiddellijk toevoegen 300μl 4% HClO 4 tot en met de controle-buis (0 min), maar laat de andere mengsel gedurende 4 uur incuberen voor quenching van de reactie met 300μl 4% HClO 4.
- Na de toevoeging van HClO 4, schud de buis en centrifugeer bij 4 ° C bij 15.000 g gedurende 15 minuten.
- Verwijder 500μl van supernatant en te neutraliseren door het toevoegen van 20μl van 5M K 2 CO 3. Schud de buis en centrifugeer bij 4 ° C bij 15.000 g gedurende 15 minuten.
- Voeg 350μl van de geneutraliseerde oplossing van een microcentrifugebuis met 1x10 -8 mol 2-AP.
- Analyseren monsters op een HPLC uitgerust met een scanning fluorescentie detector. Drie 50 ul injecties worden gebruikt voor elk monster. Monsters worden geïnjecteerd op een Wacosil 5C-18-200 250 mm x 6,0 mm, 5 um kolom uitgerust met een Supelguard LC-18-S-kolom te bewaken. De volgende isocratische voorwaarden moet worden gebruikt om adequate piek scheiding en identificatie te verkrijgen: 95% 20 mm KPO 4 buffer (pH 2,2) en 5% methanol bij een debiet 1ml/min. Stel de golflengte van de fluorescentie detector op 345 nm en de emissie-golflengte bij 410 nm.
- Bepaal de verhoudingen van pterine en isoxanthopterine tot 2-AP door het verkrijgen van piek gebieden uit de fluorescentiedetector spectrum. De eerste piek in het spectrum, ~ 5 minuten, komt overeen met 2-AP. De tweede en grootste piek zal worden pterine. Isoxanthopterine piek elueert duren.
- Verkrijgen van het verschil in de isoxanthopterine/2-AP piekoppervlak verhoudingen tussen de 0 en de 4 uur incubatie tijd punten. Deze waarde gebruiken om de XO activiteit te berekenen van de standaard bochten.
- Analyseren van monsters in triplo, maar gebruik alleen waarden met een variatiecoëfficiënt van minder dan 10%.
8. Representatieve resultaten:
Een voorbeeld van de HPLC-kwantificering van purine-verbindingen wordt weergegeven in figuur 1A. De specifieke retentietijden en de emissie golflengtes van hypoxanthine, xanthine, en urinezuur toestaan dat de gelijktijdige kwantificering van purine verbindingen (tabel 2). Als de test goed wordt uitgevoerd, zal de verbindingen goed zijn afgescheiden en de piek vorm wordt scherp en unimodale. Deze pieken worden vervolgens omgezet in concentraties, bereik weergegeven in tabel 3, door het gebruik van standaard curves. Omdat de steekproef verwerking voor deze test is minimaal, zou de enige steekproef op basis van problemen die zich kunnen voordoen zijn het lyseren van de rode bloedcellen. Als de rode bloedcellen lyseren voordat de monsters worden gecentrifugeerd, zal het plasma te nemen op een oranje / rode kleur en kunnen niet worden gebruikt voor het evalueren van hypoxische ischemie. De andere problemen die zich kunnen voordoen bij het meten van purines heeft betrekking op de HPLC-systeem en de kolom (figuur 1B). Als er luchtbellen in het HPLC-systeem de retentietijden zal verschuiven en de HPLC druk zal enorm fluctueren. Als de bewaker cartridge moet worden vervangen, zal de druk toenemen en de pieken zullen verbreden en wordt bi-of tri-modale.
| Hypoxanthine (uM) | Xanthine (uM) | Urinezuur (uM) | Xanthine-oxidase ((nmol product) / min) | Malondialdehyde (uM) | Allantoïne (uM) | |
| Term Normoxic | 1.13-19.3 (64) | 0.02-3.69 (61) | 107.20-726.12 (63) | 2.47x10 -6 - 3.92x10 -3 (20) | 0.44-3.76 (53) | NA |
| Term Respiratory Distress | 1.78-12.59 (27) | 0.07-11.8 (24) | 225.40-653.32 (27) | 0 - 1.03x10 -5 (8) | 0.82-2.73 (24) | NA |
| Term Hypoxische | 0.38-31.80 (13) | 0.11-2.88 (13) | 235.65-1348.13 (13) | 1.20x10 -5 -236,44 (9) | 0.95-2.15 (7) | NA |
| Premature Normoxic | 1.54-4.39 (9) | 0.03-1.77 (9) | 178.92-593.49 (9) | 2.46x10 -5 - 5.44x10 -4 (2) | 0.95-2.74 (8) | 2.30-5.26 (67) |
| Premature Respiratory Distress | 3.04-8.04 (2) | NA | 327.56-365.11 (2) | NA | 2.40-3.46 (3) | NA |
Min-Max (n)
Tabel 3. Vertegenwoordiger bereiken voor purines, xanthine-oxidase, malondialdehyde, en allantoïne.
Een voorbeeld van de GC / MS kwantificering van Allantoïne is weergegeven in figuur 2. Omdat de massa van derivitized allantoïne en derivitized zware allantoïne bekend is, selecteer ion modus kan worden gebruikt om deze verbindingen op de massa-spec te identificeren. Als de test is dit juist gebeurt, zal twee pieken worden waargenomen op dezelfde retentietijd. Die overeenkomt met allantoïne (398,00 m / z) en de andere om zware allantoïne (400,00 m / z). Deze pieken worden vervolgens omgezet in concentraties, bereik weergegeven in tabel 3, door het gebruik van een standaard curve. Als de test is niet goed uitgevoerd, en de monsters waren niet goed derivitized, kan het pieken niet aanwezig of niet kwantitatief representatief zijn. Nogmaals, als de rode bloedcellen gelyseerd het plasma kan niet worden gebruikt om oxidatieve stress te evalueren in neonatale hypoxische ischemie.
De resultaten voor de kwantificering van de MDA zijn vergelijkbaar met die voor allantoïne met de uitzondering dat de twee pieken worden waargenomen bij de verschillende retentietijden. Op ~ 3,5 minuten retentietijd, een 144,00 m / z piek voor MDA en op ~ 4 minuten retentietijd, een 158,00 m / z piek voor MMDA is waargenomen (Figuur 3). Deze pieken worden vervolgens omgezet in concentraties, bereik weergegeven in tabel 3, door het gebruik van een standaard curve. Als de test is verkeerd uitgevoerd, of de monsterneming niet correct derivitized mag geen pieken worden waargenomen bij de selectie voor 144.00m / z en 158.00m / z. Opgemerkt moet worden datals er een overmaat aan lipiden in het plasma van de bolus oraal of intraveneuze voedingen lipide toediening, de plasma nemen op een melkachtig uiterlijk en kan niet worden gebruikt om oxidatieve stress te evalueren in neonatale hypoxische ischemie.
Een voorbeeld van de HPLC-kwantificering van xanthine-oxidase functie wordt weergegeven in figuur 4. Als de test goed is uitgevoerd, moeten drie pieken worden waargenomen met de tl-detector, een voor pterine, een voor isoxanthopterin, en een voor 2-AP. Deze pieken worden vervolgens omgezet in concentraties, bereik weergegeven in tabel 3, door het gebruik van een standaard curve. Er moet ook een piek die overeenkomt met isoxanthopterin en 2-AP op het spectrum gegenereerd uit de PDA detector. Als de enzymactiviteit afwezig is, zal de piek van isoxanthopterin niet te zien. Omdat deze test meet werking van enzymen, herhaald invriezen en ontdooien van de steekproef kan een andere.
Figuur 1. HPLC spectrum voor de identificatie van purine verbindingen. A). Representatieve resultaten als de test werd correct uitgevoerd. B). representatieve resultaten als er een probleem met de HPLC, kolom of guard cartridge.
Figuur 2. GC / MS spectrum voor de kwantificering van allantoïne. De piek bij ion 398,00 m / z komt overeen met allantoïne. De piek bij ion 400,00 m / z komt overeen met zware allantoïne.
Figuur 3. GC / MS spectrum voor de kwantificering van MDA. De piek bij ion 144,00 m / z komt overeen met MDA. De piek bij ion 158,00 m / z komt overeen met MMDA.
Figuur 4. HPLC spectrum voor het meten van de XO-activiteit. A) Representatieve resultaten voor de 0 min incubatietijd en B) representatieve resultaten voor de 4 uur incubatie tijd. Let op de hogere isoxanthopterine piek (op ~ 17 min) voor de 4 uur incubatie tijd. In de fluorescentie spectrum, 2-AP elueert eerst op ~ 5min en pterine elueert volgende aan ~ 10min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methoden die hier beschreven staat de evaluatie van de neonatale hypoxie ischemie. Dit protocol combineert de metingen van markers van energie (ATP) deprivatie, oxidatieve stress, oxidatieve schade, en de enzymactiviteit te verkrijgen een algemene biochemische beeld van de aanwezigheid of zelfs de mate van hypoxische ischemie. Ondanks het nut van deze methode, zijn er mogelijke beperkingen. Ten eerste duurt het ongeveer 1-2 ml bloed om genoeg plasma te verzamelen om alle testen uit te voeren. Dit zal geen probleem zijn bij volwassenen of kinderen, maar het wordt een punt van zorg bij het werken met pasgeborenen, in het bijzonder degenen die voorbarig. We werken dit probleem omzeilen door voorrang te geven assays en verdunnen van een deel van de monsters, indien nodig Ten tweede, het kan moeilijk zijn om MMDA synthetiseren;. Maar, gedeutereerde MDA kan worden gebruikt als een substituut voor MMDA als een interne standaard.
Ondanks deze beperkingen, de beschreven methoden bieden een nuttig instrument bij het evalueren van neonatale hypoxie ischemie en andere aandoeningen geassocieerd met onevenwichtige redox homeostase. Bovendien kunnen al deze markers, met uitzondering van de XO, worden gemeten in de urine, het verstrekken van een niet-invasieve wijze van controle pasgeborenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk wordt gefinancierd door National Institutes of Health R01 NR011209-03
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6ml K3E EDTA K3 tube | Fisher Scientific | 2204061 | |
| 5702R centrifuge | Fisher Scientific | 05413319 | With 13&16MM adaptor |
| 1.5ml microcentrifuge tube | USA Scientific, Inc. | 1615-5599 | |
| 2-Aminopurine | Sigma-Aldrich | A3509 | |
| Varian Cary 100 spectrophotometer | Agilent Technologies | 0010071500 | |
| Savant SpeedVac | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SC210A-115 | |
| Micron centrifugal filter device | Fisher Scientific | UFC501596 | |
| Supelcosil LC-18-S Column | Sigma-Aldrich | 58931 | |
| Supelcosil LC-18-S Supelguard cartridge and holder | Sigma-Aldrich | 59629 | |
| HPLC | Waters | ||
| GCMS Vial | Fisher Scientific | 03376607 | |
| DL-Allantoin-5-13C;1-15N | CDN Isotopes | M-2307 | Lot #L340P9 |
| MTBSTFA | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 48920 | |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | |
| 5973E GC/MSD | Agilent Technologies | G7021A | Part # for 5975E GC/MS |
| 3-Ethoxymethacrolein | Sigma-Aldrich | 232548 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Benzene | Sigma-Aldrich | 401765 | |
| Diisopropyl ether | Sigma-Aldrich | 38270 | |
| BHT | Sigma-Aldrich | B1378 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Phenylhydrazine | Sigma-Aldrich | P26252 |
References
- Harkness, R. A., Whitelaw, A. G., Simmonds, R. J. Intrapartum hypoxia: the association between neurological assessment of damage and abnormal excretion of ATP metabolites. J Clin Pathol. 35, 999-1007 (1982).
- Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant-current concepts. Early Hum Dev. 80, 125-141 (2004).
- Webster, W. S., Abela, D.
- Engerson, T. D., McKelvey, T. G., Rhyne, D. B., Boggio, E. B., Snyder, S. J., Jones, H. P. Conversion of xanthine dehydrogenase to oxidase in ischemic rat tissues. J Clin Invest. 79, 1564-1570 (1987).
- Choi, E. Y., Stockert, A. L., Leimkuhler, S., Hille, R. Studies on the mechanism of action of xanthine oxidase. J Inorg Biochem. 98, 841-848 (2004).
- Godber, B. L., Schwarz, G., Mendel, R. R., Lowe, D. J., Bray, R. C., Eisenthal, R. Molecular characterization of human xanthine oxidoreductase: the enzyme is grossly deficient in molybdenum and substantially deficient in iron-sulphur centres. Biochem J. 388, 501-508 (2005).
- Gruber, J., Tang, S. Y., Jenner, A. M., Mudway, I., Blomberg, A., Behndig, A. Allantoin in human plasma, serum, and nasal-lining fluids as a biomarker of oxidative stress: avoiding artifacts and establishing real in vivo concentrations. Antioxid Redox Signal. 11, 1767-1776 (2009).
- Zitnanova, I., Korytar, P., Aruoma, O. I., Sustrova, M., Garaiova, I., Muchova, J. Uric acid and allantoin levels in Down syndrome: antioxidant and oxidative stress mechanisms? Clin Chim Acta. 341, 139-146 (2004).
- Siciarz, A., Weinberger, B., Witz, G., Hiatt, M., Hegyi, T. Urinary thiobarbituric acid-reacting substances as potential biomarkers of intrauterine hypoxia. Arch Pediatr Adolesc Med. 155, 718-722 (2001).
- Buonocore, G., Perrone, S., Longini, M., Terzuoli, L., Bracci, R. Total hydroperoxide and advanced oxidation protein products in preterm hypoxic babies. Pediatr Res. 47, 221-224 (2000).
- Berne, R. M. Cardiac nucleotides in hypoxia: possible role in regulation of coronary blood flow. Am J Physiol. 204, 317-322 (1963).
- Harkness, R. A., Lund, R. J. Cerebrospinal fluid concentrations of hypoxanthine, xanthine, uridine and inosine: high concentrations of the ATP metabolite, hypoxanthine, after hypoxia. J Clin Pathol. 36, 1-8 (1983).
- Plank, M. S., Boskovic, D. S., Sowers, L. C., Angeles, D. M.
- Cighetti, G., Allevi, P., Anastasia, L., Bortone, L., Paroni, R. Use of methyl malondialdehyde as an internal standard for malondialdehyde detection: validation by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry. Clin Chem. 48, 2266-2269 (2002).
- Paroni, R., Fermo, I., Cighetti, G. Validation of methyl malondialdehyde as internal standard for malondialdehyde detection by capillary electrophoresis. Anal Biochem. 307, 92-98 (2002).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Ciuffreda, P., Allevi, P. Beta-ethoxyacrolein contamination increases malondialdehyde inhibition of milk xanthine oxidase activity. Free Radic Biol Med. 25, 818-825 (1998).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Paroni, R., Allevi, P. Free and total malondialdehyde assessment in biological matrices by gas chromatography-mass spectrometry: what is needed for an accurate detection. Anal Biochem. 266, 222-229 (1999).
- Yamamoto, T., Moriwaki, Y., Takahashi, S., Tsutsumi, Z., Yamakita, J., Nasako, Y. Determination of human plasma xanthine oxidase activity by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Biomed Appl. 681, 395-400 (1996).
- Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. Fasman, G. , 3 ed, CRC Press. Boca Raton. (1988).
- Chen, X. B., Calder, A. G., Prasitkusol, P., Kyle, D. J., Jayasuriya, M. C. Determination of 15N isotopic enrichment and concentrations of allantoin and uric acid in urine by gas chromatography/mass spectrometry. J Mass Spectrom. 33, 130-137 (1998).
