Summary
Neonatal hipoksi-iskemi biyokimyasal belirteçler ölçmek için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yaklaşım, yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC) ve Gaz Kromatografisi Kütle Spektrometresi (GC / MS) kullanmaktadır.
Abstract
Neonatal hipoksi iskemi yetersiz kan doku perfüzyon veya sistemik bir oksijen eksikliği ile karakterizedir. Bu durum neden / 1-3 nörolojik bozukluğu da dahil olmak üzere iyi belgelenmiş neonatal bozuklukları şiddetlendirebilir düşünülmektedir. Adenozin trifosfat üretiminin azalması, oksidatif fosforilasyon eksikliği nedeniyle oluşur. Bu enerji, yüksek enerjili fosfat bağının içeren yoksun devlet molekülleri telafi için bozulmuş 2 . Bu ve nihayet ürik asit, hipoksantin, ksantin inozin sonradan bozulmuş adenozin düzeylerinde artışa yol açar. Bu bozulma süreci son iki adımı ksantin oksiredüktaz tarafından yapılmaktadır. Bu enzim, normoksik koşullar altında ksantin dehidrogenaz formu var ancak hipoksi-reperfüzyon koşullar 4, 5 altında ksantin oksidaz (XO) dönüştürülür . Ksantin dehidrogenaz aksine, XO pürin bozulması 4, 6, bir yan ürün olarak hidrojen peroksit oluşturur. Hipoksi sırasında üretilen reaktif oksijen türleri (ROS), ile birlikte bu hidrojen peroksit, ürik asit, allantoin formu oksitler ve malondialdehit (MDA) 7-9 oluşturmak için lipid membranlar ile reaksiyona girer. Memeliler, çoğu insanlar muaf enzim uricase sahip allantoin, ürik asit dönüştürür. İnsanlarda, ancak, allantoin sadece ROS aracılı ürik asit oksidasyonu ile oluşan olabilir. Bu nedenle, allantoin uricase var memeliler insanlarda oksidatif stresin bir belirteci olarak kabul edilir ancak.
Biz neonatal hipoksi iskemi biyokimyasal belirteçler ölçmek için yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC) ve gaz kromatografisi kütle spektrometresi (GCMS) istihdam yöntemleri açıklanmaktadır. İnsan kanı en testleri için kullanılır. Hayvan kan uricase oluşturulan allantoin için potansiyel kabul ederken de kullanılıyor olabilir. Pürin metabolitleri 1963 gibi erken olarak hipoksi ve hipoksantin, ksantin güvenilirliği ile bağlantılı olduğunu ve neonatal hipoksi biyokimyasal göstergeleri olarak ürik asit, bazı araştırmacılar 10-13 tarafından doğrulanmış oldu . Pürin bileşiklerin miktar tayini için kullanılan HPLC yöntemi, hızlı, güvenilir ve tekrarlanabilir. Allantoin, nispeten yeni bir oksidatif stres belirteci ölçümü için kullanılan GC / MS yöntemi, Gruber ve ark 7 uyarlanmıştır. Bu yöntem bazı eserler önler ve düşük miktarda örnek gerektirir. MMDA sentezi için kullanılan yöntemler, başka yerde 14 15 tarif edildi . GC / MS MDA tabanlı kantifikasyon Paroni ve ark uyarlanmıştır. Cighetti ve ark 16, 17. Ksantin oksidaz aktivitesi isoxanthopterin 18 pterin dönüşüm niceleme HPLC ile ölçüldü. Bu yaklaşım yeterince duyarlı ve tekrarlanabilir olduğunu kanıtladı.
Protocol
1. Örnek Toplama ve İşleme
- Buz üzerinde tutulmalıdır 6ml K3E EDTA K3 tüp kan örneği toplayın.
- 2 dakika içinde toplama, 4 örnek santrifüj ° C 1500 g de 10 dk.
- 1.5ml mikrosantrifüj tüp supernatant (plazma) aktarın.
- 18000 g de 30 dakika süreyle 4 ° C'de santrifüjleyin.
- Supernatant alikotları çıkarın ve pürin (200μl), allantoin (50μl), MDA (100μl) ve XO (120μl) analizi için ayrı mikrosantrifüj tüpler içine aktarabilirsiniz. Örnekleri, kırmızı kan hücreleri ile kontamine etmemek için dikkatli olun. Plazma birimleri kullanılabilir plazma toplam hacmi dayalı MDA, XO ve pürin için ayarlamanız gerekebilir.
2. Pürin ve XO Analizi, İç Standart, 2-Aminopurine (2-AP) hazırlanması
- 0.01351g 2-AP tartılır ve 2-5 damla HCl ile asitlendirilmiş, 8 ml su ekleyin. 2-AP çözme değilse, daha fazla asit eklemeleri gerekir. 10ml için son ses seviyesini ayarlayın.
- UV-Vis spektrofotometre, hisse senedi 2-AP çözümü gerçek konsantrasyonunu belirlemek için kullanın. (Λmax 315, ε 4000).
- Stok konsantrasyonu 2-AP çözüm belirlenir, 1x10 -7 mol 2-AP pürin ölçümler için iç standart ve 1x10 -8 mol 2-AP XO ölçümler için iç standart içeren gerekli birimleri hesaplar.
- Ayrı mikrosantrifüj tüpler içine kısım hesaplanan hacim ve bir SpeedVac kuruluk buharlaşması.
Denklem 1: 
Denklem 2: 
3. Pürinler, HPLC Ölçüm
- 1,5 saat süreyle 14000 g Microcon YM-10, 4 santrifüj filtre cihazı ve santrifüj ° C Transfer plazma (200μl).
- Süzüntü çıkarın ve mikrosantrifüj tüp 1x10 -7 mol 2-AP içeren bir transfer. 2-AP içeren mikrosantrifüj tüpüne eklenen süzüntü hacmi kaydetmek için emin olun. 10-20 sn vorteksleyin örnekleri.
- Örnekleri bir HPLC ile analiz edin. Üç 50 ul enjeksiyonları, her bir örnek için kullanılır. Numuneler bir Supelcosil LC-18-S üzerine enjekte edilir, 15 cm x 4,6 mm, 5 mm sütun Supelguard LC-18-S sütun bekçi ile donatılmıştır. Çözücü A-su, solvent B-metanol, solvent C-50mm amonyum format tamponu, pH 5.5: Tablo 1'de açıklanan degrade koşulları yeterli pik ayırma elde etmek için kullanılmalıdır.
| Zaman | Akış (ml / dk) | % A | % B | % C | |
| 1 | 1,00 | 0,0 | 0,0 | 100,0 | |
| 2 | 16,00 | 1,00 | 0,0 | 0,0 | 100,0 |
| 3 | 17,00 | 1,00 | 100,0 | 0,0 | 0,0 |
| 4 | 22,00 | 1,00 | 100,0 | 0,0 | 0,0 |
| 5 | 27,00 | 1,00 | 0,0 | 100,0 | 0,0 |
| 6 | 32,00 | 1,00 | 0,0 | 100,0 | 0,0 |
| 7 | 33,00 | 1,00 | 100,0 | 0,0 | 0,0 |
| 8 | 38,00 | 1,00 | 100,0 | 0,0 | 0,0 |
| 9 | 39,00 | 1,00 | 0,0 | 0,0 | 100,0 |
| 10 | 45,00 | 1,00 | 0,0 | 0,0 | 100,0 |
Pürin bileşiklerin HPLC ölçümleri için Tablo 1 Solvent değişir.
- Örnek pürin konsantrasyonu belirleyin. Tablo 2. 2-AP pik alanını belirleme açıklanan saklama ve dalga boylarında pik alanları elde hipoksantin, ksantin ve ürik asit niceliğini. 2-AP alan hipoksantin, ksantin ve ürik asit oranları, belirlemek ve oranları standart eğrileri kullanılarak μmolar konsantrasyonları dönüştürmek.
| Saklama Süresi * | Gözlenen λ max * | Λ max 19 Bildirilen | Ε max 19 | |
| ÜrikAsit | ~ 3.5 min | 288 | 283 [2] | 11.500 [2] |
| Hipoksantin | ~ 7.0 min | 248 | 248 [1] | 10.800 [1] |
| Ksantin | ~ 9.5 min | 267 | 267 [2] | 10.200 [2] |
| 2-Aminopurine | ~ 12.5 dakika | 305 | 314 [2] | 4.000 [2] |
Tablo 2: Tipik pürin ve iç standart retansiyon zamanları ve λ max . * 1mL/min bir debi ile izokratik 50mm amonyum format tamponu (pH 5.5) kullanılarak HPLC üzerinde kararlı. pH [].
- Üç nüsha halinde tüm numunelerin analiz, ama varyasyon katsayısı% 10'dan daha az ise sadece daha sonraki analiz için değerleri.
4. Allantoin GC / MS Ölçüm
- Ekle 50μl 10μM DL-Allantoin-5-13 C 1 - 15 N (internal standart) 50 ul plazma allantoin testi için numune toplama ve işleme sırasında bir kenara koyun.
- Bu plazma çözümü için 100 ul asetonitril ekleyin.
- Vorteks 10-20 için karışımı saniye sonra 4 ° C 20.000 gr 10 dk santrifüj.
- Süpernatantı, GC / MS flakon yerleştirin ve N 2 altında kuru.
- Kuruduktan sonra, 50 ul ajan piridin içinde N-tert-Butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoroacetamide (MTBSTFA) (1:1 hacim / hacim), şapka şişeleri derivatizing ekleyin ve onları inkübe 50 ° C 2 saat - 15 Kuzey enlemi, 20 1; Bu türevlendirme Allantoin ve DL-allantoin-5-13 C için 398,0 ve 400,0 m / z sürekli olarak ölçülebilir doruklarına verir.
- Agilent Teknolojileri GC 6890N ve MS 5973 analiz örnekleri otomatik örnekleyici ile donatılmıştır. Agilent 122-5532G kapiller kolon (25.7m uzunluğunda, iç çapı 0.25mm) bileşik ayırma gerçekleştirin. 1.5 ml / dk akış hızında helyum taşıyıcı gaz olarak kullanın. Bölünmüş mod (bölünmüş oranı 20:01, split akışı 29.4 ml / dk, toplam akış 33.8 ml / dk) derivatized ürün (1 ul) enjekte edilir. Ilk sütun sıcaklığı ayarlayın 100 ° C ve 180 artırmadan önce 2 dakika süreyle bu ısıda tutun ° C hızında 10 ° C / dak. 4 dakika için sıcaklık tutun ve sonra 260 ° C 20 ° C / dak hızı artırmak. Run sonuna kadar bu sıcaklık koruyun. Her bir numune sonra, hekzan 2 enjeksiyonları ile sütun temizleyin.
- 15 N - 1; 398,0 m / z iyon allantoin ve 400.0 m / z iyon izlerken, DL-allantoin-5-13 C iyon izleme modu seçin kullanarak allantoin niceliğini Allantoin hazırlanmış bir standart eğri kullanılarak mikromolar konsantrasyonları iyon bolluğu oranları allantoin / (ağır allantoin) dönüştürün.
- Tüm numuneler, üç nüsha olarak analiz edilir ama sadece% 10 daha az varyasyon katsayısı değerleri daha fazla analizlerinde kullanılır.
5. İç Standart, Metil malondialdehid (MMDA), MDA Analizi hazırlanması
- 100ml yuvarlak alt şişesi 1477μl 7M NaOH 523μl 3-ethoxymethacrolein ekleyin. Stirbar ekleyin.
- Şişesi koyun bir su banyosunda 45 ° C ve reaksiyonun tamamlanması için gitti kadar karıştırın. Bu, yaklaşık 140 dakika sürer. 10 dakika aralıklarla düzenli olarak sıvı 10μl kısım kaldırarak reaksiyon ilerleme izleyin. 5 10 50 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7) ve UV-Vis absorbans ölçüm bir faktör tarafından toplanan her örnek sulandırınız. Bir kez 275nm absorbans yaklaşık 0.658 reaksiyon tamamlandıktan ulaşır. Reaksiyon ilerledikçe, çözüm sarı sonra turuncu dönecek.
- 15 dakika ek bir ilerleme reaksiyon izin ver.
- Yuvarlak alt balona 5ml, distile deiyonize su ekleyin ve bir ayırma hunisi çözüm aktarmak. 3 ml su ilave bir huni içine balonun içeriği yıkamak için kullanın. Huni için ek bir 2ml su ekleyin.
- 3 kez 5 ml diklorometan ile çözüm ayıklayın. Her bir ekstraksiyondan sonra organik katmanı atın.
- Üçüncü ekstraksiyonu sonra, yuvarlak bir alt balon sulu tabaka transferi ve kuruluk için rotovap.
- 3ml etanol ve bir ön-tartılır 15ml konik tüp transfer ürün süspanse edin. Ek bir 2ml etanol ile şişeyi çalkalayın ve konik tüp durulama ekleyin.
- 5ml benzen ve sıcak su tüp ürünün sonra hemen 10 dakika süreyle buz tüpü eriyene kadar inkübe edin. 15000 g de 5 dakika santrifüj ve süpernatantı kaldırmak.
- Debi 5ml etanol ve 5 ml izopropil eteritant. Çok nazikçe ılık su tüp tüp kuluçka ve periyodik devirme Yağışlı eritin. Çökelti çözülür sonra, 10 dakika süreyle buz tüpü yerleştirin. Bu yeniden kristalleşme etanol ve izopropil eter ile 2 kez daha yapın. Bazı ürün çözünmeyen beyaz parçaları oluşabilir.
- Son yeniden kristalleşme adımdan sonra bir Speedvac ortaya çıkan ürün kuru ve mümkün olduğu kadar supernatant olarak çıkarın. Sentezlenmiş ürün ile konik tüp tartılır.
- Tüp, girdap 5ml su ekleyin ve kalan tüm katılar filtre.
- UV-vis spektrofotometre MMDA son konsantrasyonunu belirlemek için kullanın. MMDA için 50 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7) λmax 29900 M -1 cm -1 14 sönüm katsayısı ile 274 nm.
6. GC / MS MDA Ölçümü
- 0.11 g BTH 9ml etanol ekleme ve son hacim 10ml için ayarlayarak etanol 0.5mm Butillenmiş hidroksil toluen (BTH) bir çözüm hazırlayın. Sonra 990μl etanol Bu konsantre çözüm 10μl ekleyerek bir seyreltme gerçekleştirin.
- 50mm fenil hidrazin, karanlık bir mikrosantrifüj tüp içinde su 995μl fenil hidrazin 4.92μl ekleyerek bir çözüm hazırlayın. Vorteks çözüm.
- 100μl plazma MDA tayini için numune toplama ve işleme sırasında bir kenara 5μl 10μM MMDA ekleyin.
- Sonra 10μl 0.5mm BTH pH 4 200μl 1M sodyum sitrat ilavesi ile takip MMDA / plazma karışıma ekleyin. Bu pH örnek doğru türevlendirme için çok önemlidir. Çarpık MDA düzeyleri daha yüksek veya daha düşük pH neden olacaktır.
- 480μl bir son hacim distile deiyonize su ekleyerek son karışımı sulandırınız.
- 20μl 50mm Fenil hidrazin ekleyerek, şişeleri kapaklama ve orbital çalkalayıcı 30 dakika için 25 çözüm ° C inkübe çözüm Derivatize.
- Hekzan, 1 dakika, 3000 rpm'de 10 dakika süreyle ve santrifüj vorteks 1 ml ekleyin.
- GC / MS flakon organik tabaka transferi ve N 2 akışı 100μl çözüm konsantre.
- Otomatik örnekleyici kullanarak GC / MS analiz örnekleri. Agilent bileşik ayırma gerçekleştirin 122-5532G kapiller kolon (25.7 m uzunluğunda, 0,25 mm iç çapı). 0.6-0.8 ml / dk akış hızında helyum taşıyıcı gaz olarak kullanın. Bölünmüş mod (bölünmüş oranı 20:01, bölünmüş akış 23.0 ml / dk, toplam akış 27.1 ml / dk) derivatized ürün (2 ul) enjekte edilir. Ilk sütun sıcaklığı ayarlayın 110 ° C ve 250 artırmadan önce 1 dakika süreyle bu ısıda tutun ° C hızında 40 ° C / dak. Run sonuna kadar bu sıcaklık koruyun. Her bir numune sonra, hekzan 2 enjeksiyonları ile sütun temizleyin.
- MDA 144.00 m / z MDA ve 158.00 m / MMDA z kullanarak seçin iyon izleme modu kullanarak sayısal olarak. MDA / MMDA iyon bolluğu oranları bir standart eğri kullanılarak mikromolar konsantrasyonları dönüştürün.
- Üç nüsha halinde numune analiz ve sadece% 10'dan daha az bir değişim katsayısı değerleri kullanabilirsiniz.
7. Ksantin oksidaz HPLC Ölçüm
- Ksantin oksidaz fonksiyon algılama yeteneği üzerinde hassasiyetle uygun bir substrat (pterin) yanı sıra ürün (isoxanthopterin) düzeylerini ölçmek için bağımlı. Plazma ya da 0 dakika (kontrol) veya 4 saat substrat ile inkübe edilir ve ürün dönüşüm inkübasyon bağımlı substrat belirlenir.
- 240μl 0.2 M Tris-HCl tamponu (pH 9.0) ve 4.63μl 7.083x10 -3 M pterin her tüp (0 ile 4 saat) ekleyin ve 37 ° preincubate ° C, 5 dk .
- Her tüp plazma 60μl ekleyerek enzim reaksiyonu başlatır.
- Hemen kontrol tüpü (0 dk) HClO 4 300μl% 4 ancak diğer karışım 4 saat önce su verme 300μl 4% HClO 4 ile reaksiyon inkübe izin.
- HClO 4 eklenmesinden sonra, tüp kuvvetlice sallayın ve daha sonra 4 ° C 15000 g de 15 dakika süreyle santrifüj.
- Süpernatant 500μl çıkarın ve K 2 CO 3 5M 20μl ekleyerek tarafından nötralize. Şiddetle tüp sarsıntı ve ardından 4 ° C 15000 g de 15 dakika süreyle santrifüj.
- 1x10 -8 mol 2-AP içeren bir mikrosantrifüj tüp nötralize çözüm 350μl ekleyin.
- Bir tarama floresan dedektör ile donatılmış bir HPLC örnekleri analiz edin. Üç 50 ul enjeksiyonları, her bir örnek için kullanılır. Örnekleri Supelguard LC-18-S sütun bekçi ile donatılmış bir Wacosil 5C-18-200 250 mm x 6.0 mm, 5 mikron sütun üzerine enjekte edilecektir. Bir akış oranı 1ml/min% 95 20mm KPO 4 tamponu (pH 2.2) ve% 5 metanol: Aşağıdaki izokratik koşulları yeterli pik ayırma ve kimlik elde etmek için kullanılan olmalıdır. 345 nm dalgaboyu ve floresan dedektör emisyon dalga ayarlayın410 nm dalga boyunda uzunluğu.
- Pterine oranları ve floresan dedektör spektrum pik alanları elde 2-AP isoxanthopterine belirleyin. Spektrumunda ilk zirve, ~ 5 dakika, 2-AP karşılık gelir. Ikinci ve en büyük zirve pterine olacaktır. Isoxanthopterine tepe son elutes.
- 0 ile 4 saat inkübasyon süresi noktaları arasında isoxanthopterine/2-AP pik alan oranları arasındaki fark alın. XO aktivitesi standart eğrileri hesaplamak için bu değeri kullanın.
- Triplicates örnekleri analiz ama sadece% 10'dan daha az bir değişim katsayısı değerleri kullanmak.
8. Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 1A pürin bileşiklerin HPLC nicelikleme bir örnek gösterilmiştir. Spesifik alıkonma süreleri ve emisyon dalga boylarında hipoksantin, ksantin ve ürik asit, pürin bileşiklerin eşzamanlı kantifikasyon (Tablo 2) izin verir . Testin doğru şekilde çalıştırıldığında, bileşiklerin ayrılması yeterli olacaktır ve pik şekli keskin ve unimodal olacak. Bu doruklarına sonra standart eğrileri kullanımı yoluyla, Tablo 3'te gösterildiği konsantrasyonları, aralıkları dönüştürülür. Bu testi için numune işleme az olduğundan, ortaya çıkabilecek tek örnek temelli sorunları, kırmızı kan hücrelerinin parçalanması olacaktır. Örnekleri santrifüj önce kırmızı kan olmuş akyuvarlar, plazma, kırmızı / turuncu bir renk alacak ve hipoksik iskemi değerlendirmek için kullanılamaz. Pürin ölçüm yaparken ortaya çıkabilecek diğer konularda HPLC sistemi ve kolon (Şekil 1B) içerir. HPLC sistemi hava kabarcıkları varsa tutma kez kayacak ve HPLC basıncı önemli ölçüde dalgalanma olacak. Koruma kartuşunun değiştirilmesi gerekiyor ise, basınç artacak ve doruklarına genişletmek ve iki ya da üç-kalıcı hale gelecektir.
| Hipoksantin (mcM) | Ksantin (mcM) | Ürik Asit (mcM) | Ksantin oksidaz ((nmol ürün) / dk) | Malondialdehit (mcM) | Allantoin (mcM) | |
| Dönem normoksik | 1,13-19,3 (64) | ,02-3,69 (61) | 107,20-726,12 (63) | 2.47x10 -6 - 3.92x10 -3 (20) | 0,44-3,76 (53) | NA |
| Vadeli Solunum Yetmezliği | 1,78-12,59 (27) | ,07-11,8 (24) | 225,40-653,32 (27) | 0 - 1.03x10 -5 (8) | 0,82-2,73 (24) | NA |
| Dönem Hipoksik | ,38-31,80 (13) | 0,11-2,88 (13) | 235,65-1348,13 (13) | 1.20x10 -5 -236,44 (9) | ,95-2,15 (7) | NA |
| Erken normoksik | 1,54-4,39 (9) | ,03-1,77 (9) | 178,92-593,49 (9) | 2.46x10 -5 - 5.44x10 -4 (2) | ,95-2,74 (8) | 2,30-5,26 (67) |
| Erken Solunum sıkıntısı | 3,04-8,04 (2) | NA | 327,56-365,11 (2) | NA | 2,40-3,46 (3) | NA |
Min-Max (n)
Tablo 3 pürin, ksantin oksidaz, malondialdehid ve allantoin Temsilcisi değişmektedir.
Allantoin GC / MS nicelikleme bir örnek Şekil 2'de gösterilmiştir. Derivitized Allantoin ve derivitized ağır allantoin kitle bilinen olduğundan, kitle spec bu bileşiklerin iyon modu tanımlamak için kullanılır olabilir seçin. Testin doğru şekilde yapılmazsa, iki tepe aynı alıkonma zamanında görülecektir. Allantoin için gelen biri (398,00 m / z) ve diğer ağır allantoin (400,00 m / z). Bu doruklarına sonra bir standart eğri kullanımı yoluyla, Tablo 3'te gösterildiği konsantrasyonları, aralıkları dönüştürülür. Yanlış tahlil çalıştırmak ve örnekleri düzgün derivitized değildi, zirveleri mevcut olmayabilir veya kantitatif temsilcisi olmayabilir. Bir kez daha, kırmızı kan hücrelerinin parçalanmış eğer yenidoğan hipoksik iskemi plazma oksidatif stresi değerlendirmek için kullanılabilir değildir.
MDA ölçümü için sonuçlar farklı tutma zamanlarda gözlenen iki tepe olduğunu hariç allantoin benzer. Anda ~ 3.5 dakika saklama süresi, 144.00 m / z MDA tepe ve yaklaşık 4 dakika bekleme süresi, MMDA için 158.00 m / z pik görülmektedir (Şekil 3). Bu doruklarına sonra bir standart eğri kullanımı yoluyla, Tablo 3'te gösterildiği konsantrasyonları, aralıkları dönüştürülür. 144.00m / z ve 158.00m / z simgesine seçerken, yanlış tahlil çalıştırılır, ya da örnekleri düzgün derivitized doruklarına görülebilir Dikkat edilmelidirbolus ağızdan beslenmeye veya intravenöz lipid yönetimi plazma lipid fazlalığı varsa, plazma sütlü bir görünüm alacak ve neonatal hipoksik iskemi oksidatif stresi değerlendirmek için kullanılan olamaz.
Ksantin oksidaz fonksiyon HPLC tabanlı kantifikasyon bir örnek Şekil 4'te gösterilmiştir. Testin doğru çalıştırılırsa, üç doruk, floresan dedektör ile pterin biri için bir tane isoxanthopterin, ve 2-AP için uyulması gerekmektedir. Bu doruklarına sonra bir standart eğri kullanımı yoluyla, Tablo 3'te gösterildiği konsantrasyonları, aralıkları dönüştürülür. Ayrıca isoxanthopterin ve 2-AP PDA dedektör üretilen spektrum üzerinde karşılık gelen bir tepe olmamalıdır. Enzim aktivitesi olmaması durumunda, isoxanthopterin karşılık gelen zirve görülemez. Bu testte enzim fonksiyon ölçümleri için, tekrarlanan örnek donma ve çözülme değiştirebilir.
Şekil 1. Pürin bileşiklerin tespiti için HPLC spektrumu. A). Temsilcisi sonuçları tahlil doğru çalıştırıldı. B). HPLC, kolon, ya da koruma kartuşu ile ilgili bir sorun var eğer temsilcisi sonuçları.
Şekil 2. Allantoin miktarının tayini için GC / MS spektrum iyon 398,00 m / z allantoin tekabül zirve. Iyon 400,00 m / z tepe ağır allantoin karşılık gelir.
Şekil 3. MDA ölçümü için GC / MS spektrum iyon 144.00 m / z tepe MDA karşılık gelir. Iyon 158.00 m / z tepe MMDA karşılık gelir.
Şekil 4. XO aktivitesinin ölçümü için HPLC spektrumu. A) 4 saatlik inkübasyon süresi 0 dakika inkübasyon süresi ve B) temsilcisi sonuçları Temsilcisi sonuçlar. 4 saatlik inkübasyon süresi için yüksek isoxanthopterine tepe (~ 17 dakika) dikkat edin. Floresans spektrumu, 2-AP sonraki ~ ~ 10dk 5min ve pterine elutes ilk elutes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan yöntemler neonatal hipoksi iskemi değerlendirme izin. Bu protokol, varlığı bile genel bir biyokimyasal resim veya hipoksik iskemi derecesi kazanmak için enerji (ATP) yoksunluk, oksidatif stres, oksidatif hasarı ve enzim aktivitesi ölçümleri belirteçleri bir araya getiriyor. Bu yöntemin yararlarına rağmen, potansiyel sınırlamalar vardır. Öncelikle, tüm testleri çalıştırmak için yeterli plazma toplamak için yaklaşık 1-2 ml kan alır. Bu, yetişkin ya da çocuk bir sorun olmaz, ama özellikle yeni doğanlar, prematüre olan edenler ile çalışırken bir sorun haline gelir. Bu soruna deneyleri öncelik ve örnekleri gerekirse bazı seyreltilmesi İkincisi, MMDA sentezlemek için zor olabilir; ancak döteryumlanmış, MDA, bir iç standart olarak MMDA için bir yedek olarak kullanılabilir .
Bu kısıtlamalara rağmen, yöntemleri neonatal hipoksi iskemi yanı sıra dengesiz redoks homeostazı ile ilişkili diğer bozuklukları değerlendirilmesinde yararlı bir araç sağlamak nitelendirdi. Ayrıca, bu belirteçlerin, XO dışında izleme yenidoğanlarda bir non-invaziv anlamına gelir sağlamak, idrarda ölçülen olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık R01 NR011209-03 Enstitüleri tarafından finanse edilmektedir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6ml K3E EDTA K3 tube | Fisher Scientific | 2204061 | |
| 5702R centrifuge | Fisher Scientific | 05413319 | With 13&16MM adaptor |
| 1.5ml microcentrifuge tube | USA Scientific, Inc. | 1615-5599 | |
| 2-Aminopurine | Sigma-Aldrich | A3509 | |
| Varian Cary 100 spectrophotometer | Agilent Technologies | 0010071500 | |
| Savant SpeedVac | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SC210A-115 | |
| Micron centrifugal filter device | Fisher Scientific | UFC501596 | |
| Supelcosil LC-18-S Column | Sigma-Aldrich | 58931 | |
| Supelcosil LC-18-S Supelguard cartridge and holder | Sigma-Aldrich | 59629 | |
| HPLC | Waters | ||
| GCMS Vial | Fisher Scientific | 03376607 | |
| DL-Allantoin-5-13C;1-15N | CDN Isotopes | M-2307 | Lot #L340P9 |
| MTBSTFA | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 48920 | |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | |
| 5973E GC/MSD | Agilent Technologies | G7021A | Part # for 5975E GC/MS |
| 3-Ethoxymethacrolein | Sigma-Aldrich | 232548 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Benzene | Sigma-Aldrich | 401765 | |
| Diisopropyl ether | Sigma-Aldrich | 38270 | |
| BHT | Sigma-Aldrich | B1378 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Phenylhydrazine | Sigma-Aldrich | P26252 |
References
- Harkness, R. A., Whitelaw, A. G., Simmonds, R. J. Intrapartum hypoxia: the association between neurological assessment of damage and abnormal excretion of ATP metabolites. J Clin Pathol. 35, 999-1007 (1982).
- Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant-current concepts. Early Hum Dev. 80, 125-141 (2004).
- Webster, W. S., Abela, D.
- Engerson, T. D., McKelvey, T. G., Rhyne, D. B., Boggio, E. B., Snyder, S. J., Jones, H. P. Conversion of xanthine dehydrogenase to oxidase in ischemic rat tissues. J Clin Invest. 79, 1564-1570 (1987).
- Choi, E. Y., Stockert, A. L., Leimkuhler, S., Hille, R. Studies on the mechanism of action of xanthine oxidase. J Inorg Biochem. 98, 841-848 (2004).
- Godber, B. L., Schwarz, G., Mendel, R. R., Lowe, D. J., Bray, R. C., Eisenthal, R. Molecular characterization of human xanthine oxidoreductase: the enzyme is grossly deficient in molybdenum and substantially deficient in iron-sulphur centres. Biochem J. 388, 501-508 (2005).
- Gruber, J., Tang, S. Y., Jenner, A. M., Mudway, I., Blomberg, A., Behndig, A. Allantoin in human plasma, serum, and nasal-lining fluids as a biomarker of oxidative stress: avoiding artifacts and establishing real in vivo concentrations. Antioxid Redox Signal. 11, 1767-1776 (2009).
- Zitnanova, I., Korytar, P., Aruoma, O. I., Sustrova, M., Garaiova, I., Muchova, J. Uric acid and allantoin levels in Down syndrome: antioxidant and oxidative stress mechanisms? Clin Chim Acta. 341, 139-146 (2004).
- Siciarz, A., Weinberger, B., Witz, G., Hiatt, M., Hegyi, T. Urinary thiobarbituric acid-reacting substances as potential biomarkers of intrauterine hypoxia. Arch Pediatr Adolesc Med. 155, 718-722 (2001).
- Buonocore, G., Perrone, S., Longini, M., Terzuoli, L., Bracci, R. Total hydroperoxide and advanced oxidation protein products in preterm hypoxic babies. Pediatr Res. 47, 221-224 (2000).
- Berne, R. M. Cardiac nucleotides in hypoxia: possible role in regulation of coronary blood flow. Am J Physiol. 204, 317-322 (1963).
- Harkness, R. A., Lund, R. J. Cerebrospinal fluid concentrations of hypoxanthine, xanthine, uridine and inosine: high concentrations of the ATP metabolite, hypoxanthine, after hypoxia. J Clin Pathol. 36, 1-8 (1983).
- Plank, M. S., Boskovic, D. S., Sowers, L. C., Angeles, D. M.
- Cighetti, G., Allevi, P., Anastasia, L., Bortone, L., Paroni, R. Use of methyl malondialdehyde as an internal standard for malondialdehyde detection: validation by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry. Clin Chem. 48, 2266-2269 (2002).
- Paroni, R., Fermo, I., Cighetti, G. Validation of methyl malondialdehyde as internal standard for malondialdehyde detection by capillary electrophoresis. Anal Biochem. 307, 92-98 (2002).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Ciuffreda, P., Allevi, P. Beta-ethoxyacrolein contamination increases malondialdehyde inhibition of milk xanthine oxidase activity. Free Radic Biol Med. 25, 818-825 (1998).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Paroni, R., Allevi, P. Free and total malondialdehyde assessment in biological matrices by gas chromatography-mass spectrometry: what is needed for an accurate detection. Anal Biochem. 266, 222-229 (1999).
- Yamamoto, T., Moriwaki, Y., Takahashi, S., Tsutsumi, Z., Yamakita, J., Nasako, Y. Determination of human plasma xanthine oxidase activity by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Biomed Appl. 681, 395-400 (1996).
- Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. Fasman, G. , 3 ed, CRC Press. Boca Raton. (1988).
- Chen, X. B., Calder, A. G., Prasitkusol, P., Kyle, D. J., Jayasuriya, M. C. Determination of 15N isotopic enrichment and concentrations of allantoin and uric acid in urine by gas chromatography/mass spectrometry. J Mass Spectrom. 33, 130-137 (1998).
