Summary
초음파 타겟 Microbubble의 파괴 (UTMD)가 같은 마음으로 간 초음파 검사에 액세스할 수 기관을 대상으로, 치료 유전자를 포함 bioactive 분자의 특정 사이트 게재를 직접하는 데 사용할 수 있습니다
Abstract
이러한 관심의 유전자를 인코딩 부정 청구 플라스미드 DNA를 벡터로 UTMD, bioactive 분자에서, 지질 microbubble 대비 요원 7-9의 양이온 포탄에 추가됩니다. 생쥐에서 이러한 벡터 운반 microbubbles는 심장의 좌심실 자에게하거나 직접 관리하실 수 있습니다. 큰 동물에 그들은 또한 카테터를 통해 주입 intracoronary 수 있습니다. 순환에서 대상 기관에 대한 후속 배달 microbubbles의 공진 주파수에서 음향 캐비테이션에 의해 발생합니다. 그것은 기계적 에너지 또는 대상 지역 10 microvasculature의 내피 세포 사이의 과도 기공 형성에 microbubble 파괴 결과에 의해 생성되는 가능성이 보인다. 이 sonoporation 효과의 결과로로와 내피 세포에 걸쳐 transfection 효율이 향상되며, transgene 인코딩 벡터는 주변 조직으로 입금됩니다. 순환에 남아 플라스미드 DNA는 신속하게 추가로 이외의 sonicated 조직에 전달 가능성을 감소하고 매우 구체적인 목표 - 장기 transfection로 연결 혈액에 nucleases로 저하됩니다.
Protocol
1. Microbubble 주식 준비
- 10 PBS의 MLS는 1g의 포도당 200 MG 1,2 - dipalmitoyl - SN - glycero - 3 - phosphatidylcholine 50 MG 1,2 - dipalmitoyl - SN - glycero - 3 - phosphatidylethanolamine를 섞는다.
- 피펫은 5 분마다 혼합, 끓는 물 목욕 20~30분의 혼합물을 가열.
- 솔루션은 최대 6 개월까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
2. Microbubble 준비
- 40 준비 microbubble 재고 솔루션과 부화 ° 15 분 C의 250 μl를 가져가라.
- 미리 예열 microbubble 솔루션은 다음 글리세롤의 50 μl를 포함하는 1.5 ML의 microtube로 전송됩니다.
- 표현이 관심의 유전자 (4mg/ml의 최적 농도로 Qiagen 내독소 무료 MegaPrep 키트, Qiagen, 제르, MD에 의해이 예제에서 정화)에 대한 건설 인코딩 플라스미드 DNA를 정화 1-2 MG. 2.4) 인산 버퍼 호수 500 μl의 최종 볼륨에 추가됩니다. 내독소 무료 Qiagen의 maxipreps은 불임을 보장하기 위해서뿐만 아니라 멸균 PBS로 사용됩니다.
- microtube에있는 공기는 다음 Octafluoropropane 가스로 대체됩니다.
- microtube 그 다음 20 초 동안 치과 amalgamator에 적극적으로 흥분 상태입니다.
- microbubbles에 바인딩되지 않은 subnatant 포함된 잔류 DNA와 버퍼는 다음 조심스럽게 제거하고 microbubble 계층은 무소속의 DNA를 제거하기 위해 멸균 PBS로 세 번 씻어, 각 씻어주기 사이에 얼음에 위치합니다. 우리는 일반적으로 30-40%의 결합 효율을 얻을 수 있습니다. 모든 시약은 살균하고주의 오염을 최소화하기 위해 만들어졌다.
- 플라스미드 DNA - 바운드 microbubbles 그런 다음 사용 때까지 서로 다른 두 시간 동안 얼음에 게재됩니다.
- 혼합 및 PBS 세척 후 microtube에서 제거 subnatant는 사용 260nm의 파장에서이 솔루션의 광학 밀도를 측정하여 언바운드 DNA의 농도와 마찬가지로 알려진 초기 농도에 따라 바운드 금액을 결정하는 데 사용할 수 있습니다 분광 광도계.
3. 장비 보정
- 처음 사용하기 전에, 1 MHz의 캐비테이션 변환기는 적절한 기계 색인 및 펄스 반복 수 있도록 조정해야합니다. submergible 1 MHz 이상, 13mm, 산만 변환기는 전력 증폭기를 통해 20 MHz의 기능 / 임의 파형 발생기에 연결됩니다.
- 변환기는 무료 증폭기를 통해 500 MHz의 오실로 스코프에 연결되었습니다 수중 처음기에서 직접 겨냥한 물로 가득 찬 플라스틱 용기에 배치됩니다.
- 파형, 주파수, 진폭, 버스트주기 및 전원 증폭은 모든 적절한 듀티 사이클 및 microbubbles을 cavitate하기 위해 최적의 기계적 인덱스를 얻기 위해 수정할 수 있습니다. 이 특정 실험을 위해, 우리는 1 MHz 이상에서 ~ 1.3에 상응하는 기계 색인 시스템을 보정합니다.
4. Microbubble 배송 & UTMD
- 이전 microbubble 전달 및 UTMD에, C57BL / 6 마우스는 IP 분사를 통해 마취제와 5mg/kg xylazine을 100mg/kg로 anesthetized되었습니다.
- Microbubble 배달은 심장의 좌심실로 또는 꼬리 정맥 catheterization 통해 직접 분사를 통해 정맥 투여했다. 직접 심장 주사, 최대 플라스미드 DNA - 로드된 microbubble 솔루션을 100 μl에 볼륨이 심장의 좌심실에 초음파 시각화 아래 앞쪽에 4 번째 늑간 공간에서 삽입 30 게이지 바늘을 통해 주입합니다.
- 왼쪽 interventricular 주입으로 인한 microbubble 솔루션 볼러스은 Vevo 2100 이미징 시스템 비주얼 Sonics 'VisualSonics 사용하여 긴 축에보기에서 마우스의 흉부에 고정 위치에 배치 38 MHz의 고주파 초음파 변환기'를 사용하여 시각입니다. 모든 주사기와 바늘이 주사 가능한 가장 멸균 환경을 할려고, 멸균 수 있습니다.
- 즉시 주사 다음, microbubble 파괴는 두 번째, 작은 크기의 낮은 주파수 1.0 MHz의 변환기를 사용하여 ~ 5 분이 지역에 파괴를 대상으로, 원하는 기관을 통해 직접적인 개최를 위해 수행됩니다. 이 예제에서는 초음파는 기계 약 1.3-1.5 색인에 상응하고, 매 20 사이클 100 MS의 펄스 반복 기간, 1.0 MHz의의 펄스 반복 주파수에서 간장을 실시했다. 또는 펄스 초음파 3 프레임마다 4-6 심장 사이클의 버스트에 (이 실험에 표시되지 않음) 마우스의 ECG에 문이 수 있습니다. 우리는 초음파의 파열 사이의 거품과 함께 리필에 모세관 침대를 허용 프로토콜과 transfection의 효율성을 구하십시오.
5. 대체 납품 방법
우리는 절차의 복잡으로 인해 interventricular 주사를 강조하기 위해 선택하지만, 이러한 microbubbles의 장기간 주입에 꼬리 정맥으로 많은 경우에jection이 선호하는 방법입니다. microbubble 배달의 꼬리 - 정맥 방법은 마우스 동일한 방법 anesthetized 수 있습니다. 플라스미드 DNA - 바운드 microbubbles를 포함하는 주사기는 27 게이지 바늘 / 꼬리 정맥 카테터에 연결됩니다. 꼬리 정맥 카테터는 그 마우스의 꼬리를 따라하거나 오른쪽 또는 왼쪽 측면 정맥의 말초 세번째에 삽입됩니다. microbubbles를 포함하는 주사기는 자동으로 시간이 미리 설정된 기간 동안 솔루션의 유니폼을 미리 볼륨을 관리 주입 펌프에 배치됩니다. 우리는 일반적으로 3ml/hour의 속도로 200 300μl를 달이다.
동물을 사용
모든 동물은 관련 국가 및 / 또는 현지 동물 복지 기관에 의해 정의된 좋은 동물 관행에 따라 처리되었고, 모든 동물의 작업은 (하와이 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 대학 승인 번호 07-100 해당위원회에 의해 승인되었다 -3). 적절한 마취 (케타민을 / zylazine)을 사용하고 진통제 (Bupivicaine 및 Buprenorphine)이 필요하지만, 사용할 수 있었어요.
6. 대표 결과 :
UTMD - 중재 플라스미드 DNA 전달의 효율성은 구성 등로 인코딩된 유전자에 따라 다양한 방법을 통해 평가하며 이에 제한되지 않음 수 있으며 생체내 이미징, B - 여자 예 생체내의 얼룩 및 / 또는 루시페라제 immunohistology. 특히, 생체내 bioluminescence 이미징의 하나가 플라스미드 인코딩 발광 생물 리포터 유전자 (루시페라제)와 transfected 생쥐에서 순차적으로 유전자 발현의 존재와 시간을 모니터할 수 있습니다. VIVO 이미징 시스템 (IVIS)에서 Xenogen는 (칼리퍼 생명 과학, 홉킨튼, MA) 발광 생물 이미징에 사용됩니다. 이미지는 일반적으로 모든 마우스 UTMD 중재 transfection 후 첫날 찍은되고 발광 생물 유전자 발현이 더 이상 시스템 (그림 1)를 통해 시각적으로 감지할 수 없습니다 때까지 모든 3-4일 반복됩니다. 발광 생물 이미징을 위해 마우스를 준비하려면, 마우스 먼저 프로브 D - luciferin (칼리퍼 생명 과학)와 그때 anesthetized 아르 ~ 3 분 후 루시페라제 기자의 IP 주사를 받게됩니다. D - luciferin 기판의 Biodistribution는 동물 IVIS 이미징 챔버에 배치되고 몸 전체에 이미지 검색이 촬영되기 전에 ~ 10 분 동안 진행하는 허용됩니다. 인수 동안 반딧불 루시페라제 / D - luciferin 광화학 반응에서 방출 광자는 측정됩니다. 그림 1은 UTMD 다음 간을 유사한 IVIS 발광 생물 이미징을 설명하고, 그림 2는 안티 루시페라제 차 항체 (시그마 - 알드리치)과 AlexFluor - 568 복합 이차 항체 (Invitrogen)를 사용하여 transfected 간을 epifluorescence (100X) 이미지입니다 . 그것은 UTMD 중재 간 transfection은 내피 세포뿐만 아니라 영향을 것을보고 분명하지만 hepatocyes뿐.
그림 1 심장의 Xenogen / IVIS 영상은 치료 쥐를 UTMD (A) 대조군 마우스 :.. 플라스미드 + PBS 심장 감독 UTMD 다음, (B) 트리 트먼트 마우스 : 플라스미드 + 심장 다음 Microbubbles가 UTMD 감독, 그리고 (C) 치료 마우스 : 간 다음 플라스미드 이상 Microbubbles는 UTMD 감독.
그림없이 UTMD 2. 간 UTMD의 Immunohistochemistry (빨간색으로 반 루시페라제.) (A) 플라스미드 및 UTMD와 (B) 플라스미드. 공촛점 이미지 (100X), 핵은 DAPI 얼룩 푸른 있습니다.
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Discussion
UTMD은 유전자 전달에 대한 새로운 접근 방식을 나타냅니다. 플랫폼 기술로 그것은 조직 특이성의 높은 수준을 원하는 것입니다 bioactive 분자의 무수한를 제공하기 위해, 많은 잠재적인 유전자 치료 전략의 결합 수 있습니다. 기술의 주요 생물 학적 한계는 transfection의 낮은 효율성이다. 또 다른 중요한 고려 사항은 현저하게 뼈 또는 공기를 개입 감소 수있는 초음파 검사로 대상 기관의 접근이다. 기술은 조직 손상을 11 증가 효율성을 제한, 대상 조직 11 기반 기술의 최적화뿐만 아니라 음향의 기본적인 이해를 필요로합니다. 그러나, 그것은 조직을 특정 transgene 표현의 효과를 평가하기 위해, 저렴한 신속하고, 반복적인 접근 방식을 제공하며, transgene 표현의 낮은 수준 도움이 될 수있는 질환에 대한 효과적인 치료를 제공합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
그랜트 지원 NHLBI HL080532, NHLBI HL073449, NCRR RR16453, 그리고 그랜트 -에 도움이 수상 (RVS)를 AHA 국가를 포함하고 있습니다. 특별 감사는 비디오 제작과 함께 자신의 지원 거리 코스 설계 및 컨설팅 (DCDC) 그룹 dcdcgroup.org,하고 DCDC를 설립 교육 부여 번호 P336C050047 미국 이민국에 연장됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine | Sigma-Aldrich | P-5911 | component of the microbubble lipid shell |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine | Sigma-Aldrich | P-3275 | component of the microbubble lipid shell |
| glucose | Sigma-Aldrich | G5400 | thought to stabilize the microbubbles |
| phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | believed to prevent microbubbles from coalescing |
| Octafluoropropane gas | Airgas | N/A | inert gas used in clinical applications |
| VialMix dental amalgamator | Bristol-Myers Squibb | N/A | |
| 1 MHz, 13mm, unfocused transducer | Olympus Corporation | A303S-SU | |
| 20 MHz Function/Arbitrary Waveform Generator | Agilent Technologies | 33220A | |
| Power Amplifier | Krohn-Hite Co. | Model 7500 | |
| Hydrophone | Bruel and Kjaer | Type 1803 | |
| Charge Amplifier | Bruel and Kjaer | Type 2634 | |
| 500 MHz Oscilloscope | LeCroy | 9354L | |
| VisualSonics’ Vevo 2100 Imaging System with 34 MHz transducer | VisualSonics, inc. | 2100 | |
| 27G one inch tail vein catheters | VisualSonics, inc. | N/A | |
| Genie Plus infusion pump | Kent Scientific | GENIE |
References
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