Summary
نظهر تصنيع جهاز ميكروفلويديك البسيطة التي يمكن أن تكون متكاملة مع الاجهزة الكهربية القياسية للكشف عن السطوح الميكروسكيل شريحة الدماغ في الطريقة التي تسيطر عليها بشكل جيد لمختلف الناقلات العصبية.
Abstract
لقد أثبتنا في تصنيع جهاز مستويين ميكروفلويديك التي يمكن دمجها بسهولة مع الاجهزة الكهربية الموجودة. غير ملفقة الجهاز مستويين ميكروفلويديك باستخدام معيار من خطوتين السلبية مقاومة عملية الطباعة الحجرية 1. المستوى الأول يحتوي microchannels مع مدخل ومخرج الموانئ في كل نهاية. المستوى الثاني يحتوي على ثقوب دائرية تقع في منتصف الطريق الميكروسكيل طول القناة ، وتركزت على طول مع عرض القناة. يستخدم الأسلوب السلبي الضخ على ضخ السوائل من مدخل الميناء إلى الميناء منفذا 2. تم دمج جهاز ميكروفلويديك مع الجاهزة للغرف نضح ويسمح التكامل السلس مع الإعداد الكهربية. السوائل التي تم تقديمها في مدخل الموانئ تدفق من خلال microchannels نحو المنافذ منفذ والهروب أيضا من خلال فتحات دائرية تقع في أعلى microchannels في حمام من نضح. ومن ثم لا يمكن أن يتعرض السطح السفلي من شريحة الدماغ وضعت في غرفة وحمام نضح أعلاه مع الجهاز ميكروفلويديك العصبية المختلفة. سمك الميكروسكيل الجهاز ميكروفلويديك وطبيعة شفافة للمواد [الزجاج ساترة وPDMS (polydimethylsiloxane)] تستخدم لجعل الجهاز ميكروفلويديك تسمح المجهري لشريحة الدماغ. الجهاز ميكروفلويديك يسمح تعديل (سواء المكانية والزمانية) من المحفزات الكيميائية التي أدخلت على microenvironments شريحة الدماغ.
Protocol
SU - 8 تصنيع القوالب
إعداد الماجستير
- يتم تحضير الماجستير SU - 8 على ركيزة رقاقة السيليكون باستخدام خطوتين القياسية السلبية مقاومة عملية الطباعة الحجرية.
- تتم إزالة علامات التوافق على رقاقة السيليكون باستخدام شفرة حلاقة وذروة هذه الهياكل (الواقعة على طول المحيط الخارجي للرقاقة) هو أكثر من مجرد هياكل الجهاز الفعلي.
- ثم يتم تنظيف رقاقة السيليكون باستخدام الكحول الآيزوبروبيل والمجففة في تيار من N 2. دعم ركائز مصنوعة من الشريط مع سماكة أقل من أطول هيكل الجهاز استبدال علامات التوافق على أربعة جوانب رقاقة.
ملاحظة : إذا كان ارتفاع أعمدة الدعم هو أكثر من مجرد هياكل أطول الجهاز ، لم يتم تشكيلها من خلال ثقوب في القالب PDMS. - يتم وضع رقاقة السيليكون الرئيسي على صفيحة ساخنة في درجة حرارة الغرفة.
PDMS حل إعداد
- أعد أربعة غرامات من الحل (PDMS) polydimethylsiloxane عن طريق خلط دقيق 10 أجزاء من المطاط الصناعي السيليكون مع 1 جزء من وكيل المعالجة.
ملاحظة : تأكد من أن يتم خلط الحلين موحد للحصول على الخصائص الفيزيائية مماثلة في جميع أنحاء العفن PDMS. - تتم إزالة فقاعات ولدت في حل PDMS أثناء عملية الخلط باستخدام مجفف فراغ.
PDMS الطلاء والتجفيف
- هو الاستغناء ببطء فقاعة خالية حل PDMS على سيد SU - 8 التأكد من أن لا يتم إنشاء فقاعات أثناء عملية توزيع.
- ثم وضعت واحدة من نهاية الفيلم الشفافية في الكتابة على لوحة الساخن ببطء ووضعها على حل PDMS لنشر بالتساوي على PDMS سيد SU - 8. أي فقاعات ولدت أثناء هذه العملية تحتاج إلى إزالته باستخدام التحقيق.
[ملاحظة : لا رفع الشفافية لمنع توليد مزيد من الفقاعات.] - يتم وضع لوح borofloat على أعلى من الشفافية ورقة للضغط موحدة. يتم تطبيق ضغط لطيف على السطح العلوي أطول من هياكل دائرية (الموجود في منتصف الطريق أطوال وتركز القناة على طول عرض القنوات) مثل أن هناك حد أدنى أو PDMS لا تقع بين الشفافية وSU - 8 سطح دائري الهياكل.
- توضع ثلاث بلاطات أكثر borofloat على رأس شطيرة رقاقة السيليكون borofloat بلاطة للضغط المستمر على السطح العلوي للهياكل فتح دائرية قبل وأثناء عملية المعالجة.
- ثم يتم زيادة درجة الحرارة في طبق ساخن الى 75 درجة مئوية غير مملح وPDMS وعند هذه الدرجة لمدة 1 ساعة. وجلبت لوحة الساخن لدرجة حرارة 50 درجة مئوية.
- تتم إزالة ألواح وتتم إزالة بلطف الشفافية تاركة وراءها الرئيسي ورقة رقيقة مطلية PDMS على أعلى من ذلك.
بناء الجهاز ميكروفلويديك
إزالة ورقة PDMS من سيده
- هو محفور على الحدود الخارجية للغرفة نضح بها على ورقة PDMS باستخدام شفرة حلاقة بعد محاذاة المنافذ على غرفة نضح مع الموانئ الرئيسية على SU - 8.
- ومن ثم ورقة PDMS إزالتها بلطف من الربان ، وسحب على طول القنوات لمنع تمزق PDMS. وضعت ورقة على ورقة PDMS الشفافية مع سطح الشبكة ميكروفلويديك التي تواجه صعودا.
- ثم يتم إجراء المنافذ مدخل ومخرج باستخدام حفار الفلين.
الترابط ورقة PDMS ساترة لزجاج
- ثم يتم الربط سطح الورقة PDMS (السطح الذي يحتوي على شبكة ميكروفلويديك) وتنظيف الزجاج ساترة بلطف باستخدام الشريط سكوتش 3M ، وضعت على ورقة وشفافية ، وأخيرا وضعت في غرفة البلازما O 2.
- يتم التعامل مع الأسطح الترابط مع البلازما 165 واط لمدة 10 ثانية. هو الرهينة فورا على سطح البلازما للتعامل ساترة زجاجية على سطح البلازما المعالجة من ورقة PDMS.
ملاحظة : تطبيق ضغط لطيف على سطح الزجاج لإزالة أي فقاعات الهواء المحبوس بين السطوح الترابط. - سماح 5 دقائق للحصول على الروابط الجيدة بين PDMS والزجاج. بعد 5 دقائق إزالة بلطف على الشفافية التي وضعت ورقة PDMS لعملية التسنيد.
- يوضع جهاز ميكروفلويديك في الأكسجين البلازما نظام لجعل القنوات المائية. ويتم العلاج في البلازما 165 لاتس 1 دقيقة.
التكامل بين الجهاز ميكروفلويديك وغرفة نضح
إعداد غرفة نضح
- وأمرت دائرة نضح قبالة الجاهزة للاستخدام ، وحفر مدخل ومخرج المنافذ بحيث عندما مستعبدين الجهاز ميكروفلويديك وغرفة ، ويتم محاذاة المنافذ على الغرفة والجهاز. وهي مغلفة السطح السفلي من الغرفة مع نضح فDMS للحصول على ختم ضيق بين الغرفة والجهاز ميكروفلويديك.
- يتم وضع الكتابة على ورقة الشفافية على طبق ساخن في درجة حرارة الغرفة.
- حل واحد مستعد PDMS غرام في عملية مماثلة لتلك التي سبق وصفها. ومن ثم فقاعة خالية حل PDMS الاستغناء ببطء على الشفافية ورقة تجنب توليد فقاعات.
- ثم يتم وضع غرفة نضح على حل PDMS.
- ثم يتم وضع لوح borofloat على رأس الغرفة موحدة لممارسة الضغط والحصول على طبقة رقيقة من PDMS على السطح السفلي من الغرفة.
- ثم يتم زيادة درجة الحرارة في طبق ساخن الى 75 درجة مئوية غير مملح وPDMS وعند هذه الدرجة لمدة 1 ساعة.
الرابطة الجهاز ميكروفلويديك وغرفة نضح
- تتم إزالة بلاطة ويتم إزالة بلطف الشفافية تاركة وراءها غرفة نضح ورقة مغلفة PDMS رقيقة على سطح القاع. إزالة غير المرغوب فيها باستخدام PDMS شفرة حلاقة وتحقيقا لإزالة الحافة الحادة PDMS من موانئ الوصول.
- ثم يتم السطح PDMS الجهاز ميكروفلويديك والسطح السفلي للغرفة PDMS تنظيفها برفق باستخدام شريط 3M ، وضعت على ورقة وشفافية ، وضعت أخيرا في غرفة الأوكسجين البلازما.
- تعامل مع الأسطح البلازما واتس لمدة 10 ثانية 165 هو الرهينة فورا السطح المطلي PDMS للغرفة على السطح PDMS الجهاز ميكروفلويديك.
ملاحظة : تطبيق ضغط لطيف على سطح الزجاج لإزالة أي فقاعات الهواء المحبوس بين السطوح الترابط. - مباشرة قبل الاستخدام ، يتم وضع الجهاز في الأكسجين البلازما لجعل نظام القنوات المائية. ويتم العلاج في البلازما 165 لاتس 1 دقيقة.
تعريض الدماغ لشرائح المكروية الكيميائية العصبية باستخدام جهاز ميكروفلويديك
- وmicrochannels ماء من (جهاز ميكروفلويديك) -- (غرفة التروية) تمتلئ تركيبة مع ACSF القياسية (السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي) حل.
- الاستغناء عن قطرات صغيرة من حل ACSF في الموانئ ، والسماح للمدخل حل ليكون شرير حتى في القنوات. إزالة أي فقاعات اليسار باستخدام حقنة من الميناء منفذا. الاستغناء عن انخفاض كبير في حل ACSF في الميناء منفذا للسماح السلبي ضخ السوائل من مدخل إلى منافذ مخرج الجهاز ميكروفلويديك.
ملاحظة : يجب الحرص على إزالة كافة الفقاعات من قنوات للسماح تدفق السوائل باستخدام أسلوب ضخ السلبي. - إصلاح (جهاز ميكروفلويديك) -- (غرفة التروية) في منصة السرد العادي وإصلاح النظام الأساسي العادي في محول المجهر.
- ربط مدخل ومخرج القياسية (شفط) أنابيب إلى غرفة نضح لنضح المستمر لشريحة المخ بمحلول ACSF القياسية. يستنشق هو الحل ACSF باستمرار مع 95 ٪ O2 - 5 ٪ CO 2.
ملاحظة : ضبط الموقف من أنابيب شفط للحفاظ على مستوى ثابت من ACSF في الحمام من غرفة الارواء. - بمجرد ملأ الغرفة الارواء بمحلول ACSF ، ضع شريحة الدماغ في غرفة التروية باستخدام قطارة. باستخدام المسبار ، ضع شريحة الدماغ فوق فتحات دائرية في الجهاز ميكروفلويديك. مرة واحدة شريحة الدماغ هو في الموضع المطلوب على فتحات دائرية ، واستخدام مرساة شريحة لشل حركة شريحة الدماغ.
- يمكن الآن أن تستخدم الجهاز ميكروفلويديك لفضح شرائح الدماغ (وضعت في غرفة ونضح على رأس شبكة ميكروفلويديك) لمختلف الناقلات العصبية باستخدام السلبي ضخ السوائل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتقتصر القائمة شريحة غرف الدماغ نضح macroscale الميكروسكيل أو من حيث القرار المكانية التي يقدمونها لفضح شرائح المخ والموصلات العصبية. التكنولوجيا الجهاز ميكروفلويديك تظاهر هنا يتغلب على هذا القيد باستخدام تقنيات بسيطة bioMEMS. ومن المتوقع أن البساطة في تصنيع الجهاز ميكروفلويديك وسهولة في الاندماج مع الاجهزة الكهربية الموجودة سيسمح التطبيق الواسع النطاق لتكنولوجيا أظهر الجهاز. التجارب المثيرة للاهتمام التي لم تكن ممكنة يمكن أن يؤديها في وقت سابق مع الجهاز ميكروفلويديك الحالي. يمكن أن يتعرض microenvironments شريحة مختلفة من الدماغ لمختلف الناقلات العصبية في جداول زمنية مختلفة. النموذج الأولي للجهاز الحالي يضم سوى أربعة قنوات موازية وفتحات دائرية تقع بجوار بعضها البعض. ومع ذلك ، يمكن أن يكون هذا التخطيط الجهاز تغييرها بسهولة من خلال تنفيذ تصاميم مختلفة من شأنه أن يمكن من فتحات مختلفة الأشكال أو الأحجام ، أو يهيم في microchannels بطريقة من شأنها أن تؤدي إلى المواقع من فتحات في microenvironments شرائح مختلفة من الدماغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب مفتوحة للتعاون التي تنطوي على التكنولوجيا أظهرت ميكروفلويديك في مجالات مختلفة في علم الأحياء.
Acknowledgments
وقدم التمويل من 64611 - MH المعاهد الوطنية للصحة وجائزة الباحث الشاب NARSAD. فإن الكتاب أيضا أن نعترف آدم Beagley ، Dikopf مارك ، وسميث بن لمساعدتها التقنية.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| RC-26GPL | Tool | Warner Instruments | W2-64-0236 | Low Profile Large Bath RC-26GLP Recording Chamber |
| SHD-26GH/10 | Tool | Warner Instruments | W2-64-0253 | Stainless steel slice hold-down for RC-26G, 1.0 mm thread spacing |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 | Silicone Elastomer Kit |
| Plasma Preen-II 862 | Tool | Plasmatic Systems, Inc. | Microwave plasma system | |
| Model P-1 | Tool | Warner Instruments | W2-64-0277 | Series 20 Plain Platform, Model P-1 |
| SA-NIK | Tool | Warner Instruments | W2-64-0291 | Adapter for Nikon Diaphot/TE200/TE2000, SA-NIK |
| Oxygenated, heated ACSF (Artificial cerebro-spinal fluid) | Reagent | Exact composition will vary with application |
References
- Blake, A. J., Pearce, T. M., Rao, N. S., Johnson, S. M., Williams, J. C. Multilayer PDMS microfluidic chamber for controlling brain slice microenvironment. Lab on a Chip. 7, 842-849 (2007).
- Walker, G. M., Beebe, D. J. A passive pumping method for microfluidic devices. Lab on a Chip. 2, 131-134 (2002).
