Summary
Inositol pyrophosphates spelar en viktig roll i mänskliga sjukdomar såsom cancer, diabetes och fetma, men det är den exakta verkningsmekanismen en tvistefråga. Bristen på kommersiellt tillgängliga inositol pyrophosphates gör detaljerade studier problematiska. Här beskriver vi ett enkelt protokoll för att producera och isolera milligram inositol pyrophosphates.
Abstract
Myo-inositol är närvarande i naturen antingen oförändrade eller i mer fosforylerade komplexa derivat. Av de senaste, de två mest förekommande i eukaryota celler inositol pentakisphosphate (IP 5) och inositol hexakisphosphate (fytinsyra eller IP 6). IP-5 och IP 6 är föregångare till inositol pyrofosfat molekyler som innehåller en eller flera pyrofosfat obligationer 1. Fosforylering av IP 6 genererar diphoshoinositolpentakisphosphate (IP-7 eller PP-IP 5) och bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP-8 eller (PP) 2-IP 4). Inositol pyrophosphates har isolerats från alla eukaryota organismer hittills studerat. Dessutom är de två olika klasser av enzymer som ansvarar för inositol pyrofosfat syntes mycket bevarad genom evolutionen 2-4.
IP-6-kinaser (IP 6 KS) besitter en enorm katalytisk flexibilitet, konvertera IP 5 och IP 6 till PP-IP 4 och IP respektive 7 och därefter, genom att använda dessa produkter som substrat, främja uppkomsten av mer komplexa molekyler 5,6 . Nyligen var en andra klass av pyrofosfat generera enzymer identifierats i form av jästen protein VIP-1 (även kallat PP-IP 5 K), som kan konvertera IP 6 till IP 7 och IP 8 7,8.
Inositol pyrophosphates reglera många olika cellulära processer såsom insulinutsöndring 9, telomerlängd 10,11, kemotaxi 12, vesikulär människohandel 13, fosfat homeostas 14 och HIV-1 gag släpper 15. Två mekanismer åtgärder har föreslagits för denna klass av molekyler. De kan påverka cellulära funktion genom allosterically interagera med specifika proteiner som AKT 16. Alternativt kan pyrofosfat gruppen donera en fosfat i förväg fosforylerade proteiner 17. Den enorma potential detta forskningsområde är hämmas av avsaknaden av en kommersiell källa inositol pyrophosphates, som hindrar många forskare från att studera dessa molekyler och denna nya post-translationell modifiering. De metoder som för närvarande finns att isolera inositol pyrophosphates kräver avancerade kromatografiska apparater 18,19. Dessa förfaranden använder sura förhållanden som kan leda till inositol pyrofosfat nedbrytning 20 och därmed dålig återhämtning. Dessutom besvärliga efter kolumnen avsaltning förfaranden begränsa deras användning till specialiserade laboratorier.
I denna studie beskriver vi en krävande metod för generering, isolering och rening av produkter för IP 6-kinas och PP-IP 5-kinaser reaktioner. Denna metod var möjligt genom förmåga polyakrylamidgelelektrofores (SIDA) för att lösa mycket fosforyleras inositol polyfosfater 20. Efter IP 6 K1 och PP-IP 5 K enzymatiska reaktioner med hjälp av IP 6 som substrat, var PAGE används för att separera genererade inositol pyrophosphates som därefter elueras i vatten.
Protocol
1. Enzymatiska reaktionen - dag 1 (1 timme på eftermiddagen)
- Det första steget är att förbereda 10-20 oberoende enzymatiska reaktioner som IP 6 K1 eller VIP1 konvertera IP 6 till pyrophosphorylated isoformer.
- Vi använder oss av Hans-IP 6 K1 och GST-Vip1 enzymer som renats från E. coli Enligt protokollet beskrivits tidigare 17,18.
- Förbered 50 mikroliter reaktioner som innehåller 1X reaktion buffert (30 mm Hepes pH 6,8, 50 mM NaCl, 6 mm MgSO 4, 1 mm DTT), 6 mm phosphocreatine (PCR), 25 U / mL CreatinePhosphoKinase (CK), 5 mm ATP (Mg salt), 0,3 mM IP6, 0,05-0,1 mikrogram Hans-IP 6 K1 eller GST-Vip1. Justera volymen med MiliQ DDH 2 O.
- Kortfattat snurra reaktion och inkubera vid 37 ° C över natten med rotation.
2. Polyakrylamidgelen gjutning och lastning - dag 2 (4 timmar på eftermiddagen)
- Den Polyakrylamidgelen är beredd att använda 24 cm lång, 18 cm bred glasplåtar och 1,5 mm breda distanser. Vanligtvis en 16 körfält eller en förberedande enda körfält kam används.
- Förbered en blandning (50 ml / gel) som innehåller följande: 35,5% (w / v) Akrylamid: Bis-Akrylamid 19:01, 1X Tris / Borat / EDTA (TBE), 0,05% (w / v) ammonium persulfate (APS ), Temed 0,05% (w / v). Häll blandningen mellan den gjutna före glasplåtar, sätt in kammen och låt polymerisera i 30-60 minuter vid RT.
- När gelen har polymeriserade, överföring apparaten till kylrummet och pre-run i 1X TBE i ca 30-60 minuter på 200-300 volt.
- Lägg 1X av OrangeG färgämne (10 mM Tris-HCl pH7.0, 1 mM EDTA, 30% glycerol, 0,1% OrangeG) till varje reaktion. Bered ett prov innehållande 2 nmol av IP 6 att ladda som en vanlig kontroll.
- Tvätta varje brunn noggrant med löpande buffert med hjälp av en spruta och en 21G nål för att ta bort eventuell fällning, sedan ladda gelen. Undvik belastning på sidan brunnar.
- Kör gelen övernattning på 450-550 volt (7 MAMP / gel), tills OrangeG dye bandet under de senaste 10 cm från botten av gelen.
3. Isolering av IP 7 - dag 3 (4 timmar) och dag 4 (6-7 timmars SpeedVac torkningen)
- Demontera gelen apparater och dra försiktigt bort en glasskiva lämnar gel på den andra. Skär en liten del av gelen från strax ovanför OrangeG färgämnet bandet till botten med IP-6 standard och ett prov körfält, som visas i figur 1.
- Färga den skurna delen av gelen med toluidinblått (0,1% (w / v) toluidinblått, 20% (w / v) metanol, 2% (w / v) glycerol) under några minuter (1-3 min) eller tills inositol pyrofosfat bandet visas. Sätt glasskivan tidigare borttagna tillbaka på toppen av gelen för att förhindra att ofärgade gelen från att torka.
IP 7-bandet ska vara synlig eftersom det går något långsammare än IP-6-standarden. ATP, som går snabbare än IP 6, bör också vara synlig (Figur 1). Överför färgade delen av gel i en de-färglösningen (20% (w / v) metanol) i några minuter, tvätta bort eventuellt överskott av toluidinblått och placera gelen med ofärgade gel.
Om visualisering av högre pyrophosphorylated inositol isoformer (IP 8 och IP 9) krävs, färga gelen med toluidinblått färglösningen i 20 minuter i rumstemperatur. Därefter tvätta bort toluidinblått med de-färglösningen i ca 15 minuter.
- Med ett rakblad skär IP 7 bandet på ofärgade delen av gelen använder som referens IP 7 flyttar positionen bestämmas med färgade gel (Figur 1).
- Sätt IP 7 band som klipptes från gelen på ett 15 ml rör och tillsätt 10 ml MilliQ DDH 2 O. Lägg rören i rotation i 10 minuter vid rumstemperatur. Kasta vätskan för att avlägsna överskott av TBE och mikroskopiska akrylamid partiklar.
- Därefter utför två uttorkning vätskeersättning cykler. Tillsätt 5 ml 50% (w / v) metanol till röret med gel som innehåller IP-7 och rotera i rumstemperatur i 2 timmar. Överför gelen slice till ett nytt 15 ml rör som innehåller 5 ml MilliQ DDH 2 O och roterar i rumstemperatur i 2 timmar. Kasta inte bort metanol och MilliQ H 2 O från rören. Upprepa uttorkning vätskeersättning cykeln igen genom att åter överföra polyakrylamidgel i 15 mL rör som tidigare använts. En av de tvättar kan utföras över en natt.
- Att koncentrera elueras IP-7, torr 10 ml tillsammans (5 ml MilliQddH 2 O och 5 ml 50% (w / v) metanol) med en SpeedVac uppvärmd vid 60 ° C.
- När proverna är nästan torr, överföra den återstående vätskan (300-600 l) för att A1.5 ml centrifugrör och centrifugera i 2 minuter vid 5000 rpm.
- Samla supernatanten och överför till en ny 1,5 ml centrifugrör, låtner från 20 till 30 mikroliter eftersom det kan innehålla akrylamid partiklar.
- Om det är nödvändigt att fortsätta torkningen med en ouppvärmd SpeedVac. Återhämtningen av IP 7 dramatiskt minskar om proverna torka helt, därför avsluta torkningen när proverna når volymen 100-300 mikroliter.
4. Fastställande av IP 7 koncentration och renhet.
- Använd 2-5 mikroliter av det återvunna IP 7 prov att köra på ett SIDA gel, i likhet med § § 2,2-2,5. Fyll på flera spädningar av IP-6 (dvs 0,5, 1, 2, 4 nmol) som koncentration standard och 4 nmol av poly-P markör. Efter att ha kört gelen, visualisera inositol pyrofosfat isoformerna genom färgning och de-färgning hela gelen med toluidinblått lösning, enligt det förfarande som beskrivs i avsnitt 3.2 (Figur 2A).
- Efter Toluidine färgning kan bestämmas genom scanning gelen och jämföra skillnader i intensitet mellan IP 6 och IP-7, med hjälp av bildbehandlingsprogram som Bild-J, som visas i figur 2B.
5. Representativa resultat:
Den förberedande enzymatisk omvandling av IP 6 till IP 7 med hjälp av IP 6 K1 och VIP1 enzymer kan enkelt lösas med hjälp av PAGE analys (Figur 1). Lastning av IP 6 som en storlek kontroll tillsammans med toluidinblått gel färgning möjliggör identifiering av pyrophosphorylated derivat, eftersom de kör långsammare beroende på antalet fosfatgrupper finns på inositol ringen. Det förfarande som beskrivs ovan möjliggör enkel rening av IP 7. Analysen av det renade inositol pyrofosfat för sida visade renheten i våra IP-7 (Figur 2A). Intressant nog vandrar 1/3PP-IP 5 isomeren av IP 7 produkt av VIP1 något långsammare än 5PP-IP 5 isomer av IP 7 som genereras av IP 6 K1. Användning av IP 6 standarder möjliggöra en enkel kvantifiering av koncentrationen av det renade IP 7 (Figur 2B). Innan du använder IP-7 för ytterligare experiment, kan dess biologiska aktivitet ska bedömas
(Figur 3). 5PP-IP 5 inkuberas med VIP1 och med IP-7 fosfatas DDP1 (diphosphoinositol polyfosfat phosphohydrolase). Rutinmässigt, är det renade IP 7 omvandlas till IP 8 av VIP1 och IP 6 med DDP1 (Figur 3).
Figur 1:. Toluidine färgning av SIDA och isolering av IP 7 bandet Den del av gel som innehåller standarden (IP 6) skars och färgas med en toluidinblått lösning. De tre banden representerar (uppifrån och ner) IP 7, IP 6 och ATP. Den färgade delen av gelen var då i linje med resten av gelen. Detta gör att lokaliseringen av den del av gel som innehåller IP-7, som sedan kan skäras och renas (streckad ruta).
Figur 2: PAGE analys av IP 6 K1 och VIP1 reaktionsprodukter. A) Analys av IP 6 (4, 2, 1, 0,5 nmol) genom toluidinblått färgning användes för att fastställa IP 7 koncentrationen renas från både IP 6 K1 (5PP-IP 5) och VIP1 (1/3PP-IP 5) reaktioner. B) Scatter plot analys för att fastställa koncentrationen av det renade IP 7. Koncentrationerna bestämdes av de band intensitet, beräknas med ImageJ mjukvara, jämfört med förutbestämda mängder av IP 6. X-axeln representerar intensitet, Y-axeln visar koncentrationen uttryckt i nmol.
Figur 3:. Analys av IP 7 biologisk aktivitet för att bestämma kvaliteten på det renade IP 7 vi inkuberas 5PP-IP 5 (IP 6 K1 genererade IP-7) med VIP1 eller med IP-7 fosfatas DDP1 och sedan beslöt reaktionen på sidan. Den DAPI och Toluidine färgning visade förväntade produktionen av IP 8 av VIP1 och omvandlingen av IP 7 till IP 6 av DDP1.
Discussion
Användningen av inositol pyrofosfat i biokemi är starkt begränsad av den kommersiella avsaknad av sådana föreningar och de fattiga känslighet befintliga detektionsmetoder. Kombinationen av SIDA, som möjliggör separation av molekyler som har olika antal fosfatgrupper och toluidinblått (figur 1), en metakromatisk färgämne som binder till fosfatgrupper, möjliggör enkel detektion av inositol pyrophoshate isoformer öppna nya vägar för forskning 20.
Den beskrivna användningen av SIDA-teknik för att rena inositol pyrofosfat produkter av den enzymatiska reaktionen sker outby antingen IP 6 K1 eller VIP1 är en enkel, ekonomisk och tillförlitlig metod som möjliggör för produktion av stora mängder av hög kvalitet IP 7. Metoden som beskrivs ovan är inte begränsat till den enkla rening av IP 7 men mindre ändringar av de beskrivna protokollet kan tillåta rening av olika utbud av inositol pyrophosphates. Högre fosforyleras inositol pyrofosfat isoformer, som innehåller mer än åtta fosfatgrupper kan detekteras med hjälp av IP 7 eller olika mängder av IP 6 som substrat 20,6. Dessa inositol pyrophosphates kan upptäckas genom att öka längden på färgningsproceduren och därefter renas (avsnitt 3.2). Dessutom skulle användningen av IP 5 som substrat för den enzymatiska reaktionen möjliggör rening av PP-IP-5 och andra inositol pyrophosphates som innehåller en hydroxylgrupp på inositol ringen.
Sammanfattningsvis ger detta anspråkslösa metoden för tillförlitlig rening av milligram mängder inositol pyrophosphates med allmänt tillgängliga instrument, vilket öppnar nya vägar för detta spännande forskningsområde.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar A. Riccio för hjälpsamma kommentarer och för att läsa manuskriptet. Detta arbete stöddes av Medical Research Council (MRC) finansiering till Cell Biology Unit och en Human Frontier Science Program Grant (RGP0048/2009-C).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phytic Acid (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 | |
| Poly-P (sodium hexametaphosphate) | Sigma-Aldrich | P8510 | |
| ATP-Mg2+ salt | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 | |
| PhosphoCreatine (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| CreatinePhospho Kinase (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 | |
| His-Ddp1 | Available in lab | Available in lab | |
| Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 | |
| Temed | VWR | 43083G | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 198161 | |
| SpeedVac | Christ | 100218 | |
| Gel apparatus | Hoeffer Scientific Instruments | SE600 | |
| Vacuum manifold | Christ | Alpha 2-4 | |
| Vacuum pump | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |
References
- Bennett, M., Onnebo, S. M., Azevedo, C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates: metabolism and signaling. Cell Mol Life Sci. 63, 552-564 (2006).
- Burton, A., Hu, X., Saiardi, A. Are inositol pyrophosphates signalling molecules? J Cell Physiol. 220, 8-15 (2009).
- Barker, C. J., Illies, C., Gaboardi, G. C., Berggren, P. O. Inositol pyrophosphates: structure, enzymology and function. Cell Mol Life Sci. 66, 3851-3871 (2009).
- Shears, S. B.
- Saiardi, A., Erdjument-Bromage, H., Snowman, A. M., Tempst, P., Snyder, S. H. Synthesis of diphosphoinositol pentakisphosphate by a newly identified family of higher inositol polyphosphate kinases. Curr Biol. 9, 1323-1326 (1999).
- Draskovic, P. Inositol hexakisphosphate kinase products contain diphosphate and triphosphate groups. Chem Biol. 15, 274-286 (2008).
- Mulugu, S. A conserved family of enzymes that phosphorylate inositol hexakisphosphate. Science. 316, 106-109 (2007).
- Fridy, P. C., Otto, J. C., Dollins, D. E., York, J. D. Cloning and characterization of two human VIP1-like inositol hexakisphosphate and diphosphoinositol pentakisphosphate kinases. J Biol Chem. 282, 30754-30762 (2007).
- Illies, C. Requirement of inositol pyrophosphates for full exocytotic capacity in pancreatic beta cells. Science. 318, 1299-1302 (2007).
- Saiardi, A., Resnick, A. C., Snowman, A. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate cell death and telomere length through phosphoinositide 3-kinase-related protein kinases. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1911-1914 (2005).
- York, S. J., Armbruster, B. N., Greenwell, P., Petes, T. D., York, J. D. Inositol diphosphate signaling regulates telomere length. J Biol Chem. 280, 4264-4269 (2005).
- Luo, H. R. Inositol pyrophosphates mediate chemotaxis in Dictyostelium via pleckstrin homology domain-PtdIns(3,4,5)P3 interactions. Cell. 114, 559-572 (2003).
- Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14206-14211 (2002).
- Auesukaree, C., Tochio, H., Shirakawa, M., Kaneko, Y., Harashima, S. Plc1p, Arg82p, and Kcs1p, enzymes involved in inositol pyrophosphate synthesis, are essential for phosphate regulation and polyphosphate accumulation in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280, 25127-25133 (2005).
- Azevedo, C., Burton, A., Ruiz-Mateos, E., Marsh, M., Saiardi, A. Inositol pyrophosphate mediated pyrophosphorylation of AP3B1 regulates HIV-1 Gag release. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 21161-21166 (2009).
- Bhandari, R. Protein pyrophosphorylation by inositol pyrophosphates is a posttranslational event. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15305-15310 (2007).
- Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M., Saiardi, A. Synthesis of InsP7 by the Inositol Hexakisphosphate Kinase 1 (IP6K1). Methods Mol Biol. 645, 73-85 (2010).
- Otto, J. C. Biochemical analysis of inositol phosphate kinases. Methods Enzymol. 434, 171-185 (2007).
- Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis. PLoS One. 4, e5580-e5580 (2009).
