Summary
इस कागज अलगाव, और शुद्धि exosomes का पता लगाने के, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उनके आणविक सामग्री के विश्लेषण के लिए तकनीक के लिए तरीकों को दर्शाता है. इन विधियों दोनों सेल संस्कृति मीडिया और जैविक तरल पदार्थ से exosome अलगाव के लिए अनुकूलनीय रहे हैं, और आणविक सामग्री के विश्लेषण से परे भी कार्यात्मक अध्ययन में उपयोगी हो सकता है.
Protocol
1. Exosome अलगाव
- मध्यम में exosome मुक्त सीरम के साथ कोशिकाओं को विकसित. इस प्रकार, किसी भी सीरम सेल संस्कृति माध्यम से जोड़ा ultracentrifugation द्वारा exosomes के समाप्त किया जाना चाहिए 4 बजे रात से अधिक 120 000 XG डिग्री सेल्सियस उपयोग करने के लिए पहले.
- शंक्वाकार ट्यूबों सेल निलंबन स्थानांतरण.
- 4 में 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र ° सी गोली कोशिकाओं.
- स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला ट्यूबों ultracentrifuge और नहीं तो पूरी तरह से पूर्ण जोड़ने के पीबीएस.
- 4 में 20 मिनट के लिए 16 500 XG नमूना अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस आगे कोशिकाओं और सेल मलबे को हटाने के लिए.
- एक 0.2 सुक्ष्ममापी 200 एनएम से अधिक बड़े कणों को दूर करने के लिए फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर.
- नए ultracentrifuge ट्यूबों के लिए सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर स्थानांतरण और ultracentrifuge पहले ट्यूबों 120 000 XG पर 70 मिनट के लिए 4 ° मुहर गोली exosomes सी.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- अधिक से अधिक exosome पुनर्प्राप्ति के लिए, exosome resuspend समृद्धएड बार - बार गोली एक उचित बफर (3 ~ x 50 μl) की एक छोटी मात्रा में. यह बफर बहाव exosome अलगाव के बाद की योजना बनाई प्रयोगों पर निर्भर करता है है. उदाहरण के लिए, lysis बफर प्रोटीन और शाही सेना के अलगाव के लिए प्रयोग किया जाता है, Pbs इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और प्रवाह cytometry के लिए और कार्यात्मक अध्ययन मध्यम पसंद किया जा सकता है के लिए प्रयोग किया जाता है.
नोट; exosomes भी प्लाज्मा जैसे विभिन्न शरीर के तरल पदार्थ, सेल संस्कृति मीडिया के लिए के रूप में एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर से अलग किया जा सकता है. चिपचिपा तरल पदार्थ के लिए यह पीबीएस के साथ नमूना centrifugation और छानने का काम कदम से पहले पतला करने के लिए आवश्यक हो सकता है. ऊपर 5 बिंदु के लिए centrifugation की गति के संबंध में, यह 29 500 XG के लिए वृद्धि हुई किया जा सकता है, और 7 बिंदु में ultracentrifugation 90 18 मिनट के लिए बढ़ाया जा सकता है है.
यदि नमूना करने के लिए आगे शुद्ध जरूरत exosome गोली एक sucrose के ढाल पर जारी किया जा सकता है और exosomes मुख्य रूप से अंश represe में पाया जाएगा1.13-1.19 ग्राम / 2 मिलीलीटर के घनत्व nting.
2. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा Exosome पहचान
- आगे contaminating प्रोटीन को खत्म करने के लिए, 120 4 में 70 मिनट के लिए 000 XG डिग्री सेल्सियस फिर से गोली exosomes में पीबीएस में exosome समृद्ध गोली और ultracentrifuge resuspend.
- प्रोटीन अलगाव और कुल प्रोटीन माप के लिए नमूने के एक छोटे से विभाज्य ले लो. यकीन है कि नमूने का केवल एक छोटा सा हिस्सा lysed है और प्रोटीन माप के लिए इस्तेमाल किया और बरकरार exosomes, पीबीएस में हल, बर्फ पर अलग - अलग या -80 डिग्री सेल्सियस आगे के प्रयोगों के लिए रखना.
- एक बूंद Parafilm पर बरकरार पीबीएस में resuspended exosomes exosomal प्रोटीन की लगभग 10 μg, प्लेस. फिर, संदंश के साथ, धीरे 30-60 मिनट के लिए प्रत्येक बूंद के शीर्ष पर एक formvar कार्बन लेपित निकल ग्रिड की स्थिति. विश्वास दिलाता हूं कि ग्रिड कोटिंग exosomes युक्त ड्रॉप का सामना करना पड़ पक्ष के साथ तैनात किया गया है.
- प्लेस बूँदें तीन, प्रत्येक 30 μl टी पर, PbsParafilm वह और sequentially पीबीएस की बूंदों के शीर्ष पर ग्रिड स्थिति से ग्रिड धो लें, और बीच में एक अवशोषित कागज का उपयोग करें. धीरे बस इसे बारीकी से पकड़ लेपित क्षेत्र के साथ संपर्क बनाने के बिना ग्रिड के पक्ष में अवशोषित कागज का उपयोग करें.
- जमा द्वारा नमूना फिक्स Parafilm पर 2% paraformaldehyde की एक बूंद और 10 मिनट के लिए छोड़ के शीर्ष पर ग्रिड जगह.
- 4 अंक में धोने कदम से पहले एक उपयुक्त एंटीबॉडी के साथ immunostaining, दोहराएँ. आमतौर पर इस्तेमाल किया एंटीबॉडी विरोधी CD63 और विरोधी MHC वर्ग द्वितीय रहे हैं. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी भी immunostaining के रूप में exosomes केवल आकार और आकृति विज्ञान के आधार पर पहचाना जा सकता है है बिना प्रदर्शन किया जा सकता है. हालांकि, हम आकार आकारिकी, और एक अधिक निर्णायक सत्यापन के लिए एक झिल्ली प्रोटीन की उपस्थिति का मूल्यांकन करने की सलाह देते हैं.
- पसंद की प्राथमिक एंटीबॉडी के एक 30 μl ड्रॉप करने के लिए ग्रिड स्थानांतरण और 40 मिनट के लिए सेते हैं. 4 अंक दोहरा करके धो, लेकिन 0.1% गोजातीय सीरम पंजाब में albumin का उपयोगपीबीएस अकेले के बजाय एस.
- बिंदु 7 दोहराएँ, लेकिन 10 एनएम सोने लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी और पीबीएस अकेले के साथ धोने के साथ.
- 2.5% glutaraldehyde Parafilm के लिए ड्रॉप जोड़कर नमूना पोस्ट को ठीक करने के लिए और 10 मिनट के लिए छोड़ के शीर्ष पर ग्रिड सेते हैं. 4 अंक में धो दोहराएँ, लेकिन विआयनीकृत पानी के पांच बूंदों के बजाय पीबीएस के तीन बूंदों का उपयोग करें.
- Parafilm 2% uranyl एसीटेट की एक बूंद को जोड़ने और 15 मिनट के लिए छोड़ के शीर्ष पर ग्रिड सेते नमूना कंट्रास्ट.
- Parafilm 0.13% मिथाइल सेलूलोज़ और 0.4% uranyl एसीटेट की एक बूंद जोड़कर नमूना एम्बेड और 10 मिनट के लिए छोड़ के शीर्ष पर ग्रिड सेते हैं.
- धीरे अवशोषित कागज का उपयोग करके अतिरिक्त तरल निकालें, पहले एक कागज पर लेपित पक्ष के साथ ग्रिड स्थिति और इसे 5 मिनट के लिए सूखी हवा.
- एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ तैयारी की जांच करने के लिए या भविष्य के काम के लिए एक ग्रिड बॉक्स में ग्रिड की दुकान है.
3.प्रवाह cytometry के द्वारा लक्षण वर्णन Exosome
के रूप में exosomes भी वर्तमान प्रवाह cytometry उपकरणों से पता लगाया जा छोटे हैं, यह आवश्यक है पहले एंटीबॉडी लेपित मोती (चित्रा 1) exosomes बाँध. ये मोती या तो एक तैयार बनाया उत्पाद के रूप में खरीदा जा सकता है या पसंद के एंटीबॉडी के साथ प्रयोगशाला में किए गए. Exosomal सेलुलर मूल पर निर्भर करता है, विभिन्न एंटीबॉडी मोती है जो या तो चुंबकीय या लाटेकस चरित्र के किया जा सकता है युग्मित किया जा सकता है. वर्तमान में हम इस विश्लेषण के लिए विरोधी MHC वर्ग द्वितीय या विरोधी CD63 लिपटे मोतियों का उपयोग करें.
- "घर का बना" एंटीबॉडी लिपटे मोतियों के उपयोग के लिए, हम 4 सुक्ष्ममापी लेटेक्स विरोधी CD63 एंटीबॉडी के साथ लिपटे मोतियों का उपयोग करें. 25 μl सुक्ष्ममापी 4 लेटेक्स (x 30 10 6 मोती) 100 μl एमईएस बफर में दो बार मोती, 3 15-20 मिनट के लिए 000 XG धो और 100 μl एमईएस बफर में गोली redissolve . एंटीबॉडी एमईएस बफर के समान मात्रा के साथ एक 12.5 μg एंटीबॉडी के बराबर मात्रा युक्त मिश्रण तैयार करें. जोड़नाएंटीबॉडी मिश्रण और आंदोलन के तहत रात खत्म कमरे के तापमान पर सेते मोती. एंटीबॉडी लेपित मोती पीबीएस (3 20 मिनट के लिए 000 XG) के साथ तीन बार धो और भंडारण बफर के 100 μl में गोली भंग (300 000 मनकों / μl के अंतिम एकाग्रता के साथ).
- प्रत्येक नमूने के लिए (प्रत्येक एंटीबॉडी), exosomal प्रोटीन का 30 μg की एक प्रति ~ 100 000 एंटीबॉडी लेपित मोती (पीबीएस में हल बरकरार exosomes के) न्यूनतम के बराबर मात्रा के साथ जारी है.
- Exosomes और मोती सेते हैं, 300 μl पीबीएस की कुल मात्रा में, 4 पर रात खत्म ° सी कोमल आंदोलन के तहत.
- 30 मिनट के लिए 200 मिमी ग्लाइसिन और सेते 300 μl जोड़कर ब्लॉक.
- दो बार धोने बफर में exosome मनका परिसरों (पीबीएस में 1-3% सीरम), 10 मिनट के लिए 600 XG धो लें.
- 4 में exosome मनका 50 μl आईजीजी एंटीबॉडी के साथ परिसरों डिग्री सेल्सियस सेते Exosome-मनका परिसरों में दो बार धोने बफर में चरण 5 में वर्णित के रूप में धो.
- 90 μl धो बफर और 10 μl जोड़ेंपसंद के एंटीबॉडी exosome-मनका कोमल आंदोलन के तहत 40 मिनट के लिए और परिसरों सेते (आदर्श विरोधी CD9, विरोधी CD63 या विरोधी CD81). धो धो बफर में exosome मनका परिसरों दो बार के रूप में चरण 5 में वर्णित है.
- 300 μl धो बफर जोड़ें और प्रवाह cytometry का उपयोग कर डेटा हासिल है.
के रूप में चर्चा ऊपर, विभिन्न मोती लेटेक्स के रूप में प्रोटोकॉल या चुंबकीय मोतियों में वर्णित के मनकों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि चुंबकीय मोतियों के बजाय इस्तेमाल कर रहे हैं, तो कृपया ध्यान दें, कि प्रोटोकॉल थोड़ा अलग है. अवरुद्ध कदम (4 अंक) की आवश्यकता नहीं धोने एक centrifugation के बजाय एक चुंबकीय स्टैंड में ट्यूब में रखकर किया जाता है.
भंडारण बफर "घर का बना" एंटीबॉडी लिपटे मोतियों के लिए इस्तेमाल किया, 0.1% ग्लाइसिन और 0.1% पीबीएस में 7.2 का एक pH के साथ, azid सोडियम होते हैं.
महत्वपूर्ण बात है, प्रवाह cytometry धोने बफर (पीबीएस में 1-3% सीरम) के लिए exosome समाप्त सीरम का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि किसी भी से बचनेसीरम विश्लेषण contaminating exosomes.
ध्यान दें, जब एंटीबॉडी मिलकर मोती का उपयोग करके exosome लक्षण वर्णन प्रदर्शन यह महत्वपूर्ण है स्वीकार करते हैं कि यह केवल एक विशेष subpopulation, इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के लिए विशिष्ट है कि अलग है और विशेषता है.
4. वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा Exosome पता लगाने
पश्चिमी धब्बा एक विधि अच्छी तरह से स्थापित है और हम विधि ही है के बारे में विस्तार में नहीं जाना है, लेकिन पश्चिमी धब्बा और विभिन्न इस्तेमाल किया एंटीबॉडी से पहले एक उपयुक्त प्रोटीन अलगाव के महत्व पर ध्यान केंद्रित.
- पसंद के प्रोटीन lysis बफर में exosome गोली भंग और अच्छी तरह से pipetting, भंवर मिश्रण द्वारा पीछा किया. आगे exosomes lyse करने के लिए, एक पानी के स्नान में 3 नमूना sonicate एक्स 5 मिनट भंवर के बीच में मिश्रण के साथ. अंत में अपकेंद्रित्र नमूना, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 13 000 XG, और एक नया Eppendorf ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला.
- Measuफिर पसंद की एक विधि द्वारा कुल प्रोटीन और प्रोटीन की 20-50 μg प्रति अच्छी तरह से लोड.
- जेल वैद्युतकणसंचलन और electroblotting द्वारा प्रोटीन को अलग और हस्तांतरण.
- ब्लॉक और exosomes में समृद्ध प्रोटीन के खिलाफ immunostaining प्रदर्शन से पहले झिल्ली धोने.
- Chemiluminescence, डिजिटल इमेजिंग प्रणाली और विश्लेषण सॉफ्टवेयर के द्वारा विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने.
के रूप में वहाँ नहीं exosome विशिष्ट मार्करों, सभी अलग सेलुलर मूल से प्रोटीन है कि exosomes में समृद्ध कर रहे हैं, कर रहे हैं, सामान्यतः exosome पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है. (CD9 जैसे, CD63 और CD81) tetraspanins, cytoskeleton जुड़े प्रोटीन (जैसे एज़रिन) और multivesicular जीवजनन (Tsg101 जैसे और Alix) में शामिल प्रोटीन जैसे प्रोटीन होते हैं. अन्य प्रोटीन भी है कि आमतौर पर exosomes में पाया Flotillin, Hsc70 और विभिन्न Rab प्रोटीन आदि कर रहे हैं हालांकि, वहाँ भी हैं कक्ष A33 (आंतों उपकला कोशिकाओं) के रूप में ऐसे exosomes में पाया विशिष्ट प्रोटीन, CD3(टी कोशिकाओं) और MHC वर्ग द्वितीय (प्रतिजन कोशिकाओं). इस प्रकार, पर क्या कोशिका प्रकार exosomes का पता लगाने के लिए मार्कर से जारी कर रहे हैं से निर्भर करते हुए भिन्न हो सकते हैं.
के रूप में सेल के अन्य डिब्बों को भी vesicles का उत्पादन कर सकते हैं, यह आगे endoplasmic (जैसे calnexin और Grp78) जालिका और Golgi उपकरण (GM130 उदाहरण के लिए) के रूप में इन डिब्बों से प्रोटीन की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए सिफारिश की है. इस प्रकार, इन प्रोटीनों की कमी नहीं है या थोड़ा नमूने में अन्य डिब्बों के vesicles के संदूषण का अध्ययन इंगित करता है.
5. Exosomal शाही सेना और शाही सेना विश्लेषण के अलगाव
- पसंद की शाही सेना lysis बफर में exosome गोली भंग और आरएनए निष्कर्षण प्रदर्शन. विभिन्न आरएनए अलगाव किट बहाव के प्रयोगों के आधार पर किया जा सकता है, लेकिन स्तंभ आधारित विधियों शाही सेना के एक व्यापक स्पेक्ट्रम के साथ नमूने प्रदान करता है. वर्तमान में हम Exiqon द्वारा हैं miRCURY आरएनए अलगाव किट का उपयोग कर, लेकिन अन्य किट उपयुक्त हो सकता है सुप्रीम कोर्ट पर निर्भर करता है हो सकता हैहाथ में ientific सवाल.
- जब शाही सेना अलगाव प्रदर्शन RNase मुक्त वातावरण में काम करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसलिए न्यूक्लिक एसिड और nuclease मुक्त विंदुक युक्तियाँ का उपयोग करें और दोनों बेंच और contaminants और RNases से मुक्त उपकरण पोंछ.
- शाही सेना के अलगाव के लिए, miRCURY आरएनए अलगाव किट का उपयोग करके, lysis समाधान के 350 μl में exosome गोली को भंग करने और 15 सेकंड के लिए भंवर मिश्रण प्रदर्शन.
- 95% इथेनॉल और 10 सेकंड के लिए भंवर मिश्रण के 200 μl जोड़ें.
- एक संग्रह ट्यूब में एक स्तंभ प्लेस और स्तंभ lysed exosomes हस्तांतरण और 14 000 x जी पर 1 मिनट अपकेंद्रित्र
- स्तंभ धो समाधान के 400 μl जोड़ने exosomal 14 000 x जी में 1 मिनट के लिए शाही सेना और अपकेंद्रित्र युक्त तीन बार धो
- सुनिश्चित करें कि स्तंभ सूखा है और एक RNase मुक्त Eppendorf ट्यूब में सूखी स्तंभ जगह बनाने के लिए XG 14 000 2 मिनट के लिए स्तंभ अपकेंद्रित्र.
- स्तंभ और 2 के लिए अपकेंद्रित्र 50 μl क्षालन बफर जोड़ें XG पर 200 मिनट, 14 000 x जी में 1 मिनट के द्वारा पीछा किया
- पृथक शाही सेना के साथ जारी रखें या -80 में दुकान डिग्री सेल्सियस
निकाले कुल exosomal आरएनए का पता लगाने और विश्लेषण के लिए, शाही सेना 6000 नैनो या शाही सेना 6000 पिको किट के साथ एक Agilent Bioanalyzer 2100 का उपयोग करें. विश्लेषण exosomal शाही सेना उपज और आकार के वितरण से पता चलता है.
6. प्रतिनिधि परिणाम
Exosomes भी उपलब्ध प्रवाह cytometry तरीकों से पता लगाया जा छोटे हैं, और इसलिए कर रहे हैं विश्लेषण किया जा रहा से पहले एंटीबॉडी में लिपटे मोतियों के लिए संलग्न (चित्रा 1 ). के रूप में exosome-मनका परिसरों कुल प्रवाह cytometry तितर बितर साजिश सिंगल, डबल और ट्रिपल मोती (2A चित्रा) के विभिन्न आबादी शामिल कर सकते हैं. तीर एकल मोती है कि आगे का विश्लेषण कर रहे हैं इंगित करता है. एक CD63 सकारात्मक एकल मनका इसके निर्धारण को नियंत्रित करने के लिए तुलना में exosome जनसंख्या चित्रा 2B में दिखाया गया है .
चित्रा 3, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में e_content "> exosomes के छोटे आकार के कारण, वे केवल सीधे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ कल्पना कर सकते हैं और नहीं प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा exosomes की विशिष्ट morphological विशेषताओं दौर आकार और 30-100 आकार झिल्ली vesicles एनएम हैं . तस्वीरें दिखाने exosomes सोने लेबल CD63 के लिए एंटीबॉडी (तीर द्वारा संकेत) और गैर immunostained exosomes (बी) के साथ immunostained (ए).तय है कि पृथक vesicles वास्तव में exosomes कर रहे हैं और आगे exosomal प्रोटीन विशेषताएँ करने के लिए, पश्चिमी धब्बा आमतौर पर इस्तेमाल किया चित्रा 4 calnexin, एक endoplasmic जालिका मार्कर के अभाव से पता चलता है. इस endoplasmic जालिका से vesicles के छोटे संदूषण इंगित करता है. इसके अलावा, चित्रा 4 exosomes में CD81 की मौजूदगी है, जो एक सामान्य exosomes में समृद्ध tetraspanin है दिखाता है.
सेलुलर शाही सेना मुख्य रूप से शामिलएस ribosomal शाही सेना (rRNA), Bioanalyzer विश्लेषण (चित्रा 5A) में और 18s 28S rRNA सब यूनिटों के लिए दो प्रमुख चोटियों के रूप में देखा. हालांकि, exosomal शाही सेना उनके प्रोफ़ाइल में अलग रूप में exosomes दो rRNA चोटियों (18s और 28S) की कमी है और mRNA और miRNA (चित्रा 5 ब) जैसे लघु शाही सेना में समृद्ध कर रहे हैं.
चित्रा 1. Exosomes (3-10 एनएम) के छोटे आकार के कारण, वे शोर और पृष्ठभूमि से भेद नहीं जब प्रवाह cytometry के साथ विश्लेषण कर सकते हैं. इसलिए, यह आवश्यक है कि उन्हें एंटीबॉडी लेपित मोती पहले exosomes विश्लेषण कर रहे हैं, जो तब लेजर के द्वारा visualized किया जा सकता देते हैं.
चित्रा 2. exosome मोती परिसर में एक दूसरे को और फार्म डबल और ट्रिपल मोतियों के साथ कुल कर सकते हैं (एक). तीर एकल मनका - exo प्रदर्शन कुछ आबादी है जो gated और आगे के विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है. यह आबादी सीधे एक निर्धारण नियंत्रण (भरा ग्रे शिखर) exosomes की झिल्ली अणुओं की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए की तुलना में किया जाएगा. CD63 सकारात्मक exosomes (काले खुला चोटी) आंकड़ा बी में दिखाए जाते हैं.
चित्रा 3. ठेठ आकारिकी और आकार (40-80 एनएम) (ए और बी) के साथ exosomes की इलेक्ट्रॉन micrographs . तीर आकृति में एक माध्यमिक एंटीबॉडी के सुनहरे कण इंगित करता है, पुष्टि है कि इस exosome अपनी झिल्ली सतह पर CD63 है.
चित्रा 4. वेस्टर्न ब्लॉट endoplasmic जालिका प्रोटीन calnexin के अभाव लेकिन सामान्यतः exosomes, CD81 tetraspanin में समृद्ध प्रोटीन की उपस्थिति दिखाने का परिणाम है.
चित्रा 5. Bioanalyzer कोशिकाओं (ए) और (बी) exosomes में उपस्थिति शाही सेना दिखाने का परिणाम है. तीर 18s इंगित करता है और 28S rRNA सब यूनिटों कोशिकाओं में मौजूद है. Exosomal आरएनए मर्दाना के रूप में छोटे आरएनए होते नहीं या थोड़ा rRNA exosomes में पहचान की है.
Discussion
जब आणविक सामग्री और / या exosomes के समारोह का अध्ययन, यह एक उच्च गुणवत्ता अलगाव तरीका है कि एक उपयुक्त उपज और संदूषण के न्यूनतम संभव डिग्री प्रदान करता है का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस पत्र में वर्णित पद्धति exosomes अलग और उनके आरएनए सामग्री और जैविक समारोह का अध्ययन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित दृष्टिकोण है. इसके अलावा, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, प्रवाह cytometry, और पश्चिमी धब्बा सहित विभिन्न तरीकों, का एक संयोजन द्वारा पृथक exosomes के लक्षण वर्णन के महत्व पर प्रकाश डाला है.
जब exosomes अलग है, पहली centrifugation कदम (300 XG) गोली कोशिकाओं है कि सेल निलंबन या अध्ययन जैविक तरल पदार्थ में मौजूद हो सकता है प्रयोग किया जाता है. 16 500 XG की जरूरत पर दूसरे centrifugation गोली मृत कोशिकाओं को बड़ा मलबे, apoptotic निकायों और अन्य organelles के लिए पर्याप्त मजबूत हो. इस centrifugation के बाद, कुछ प्रोटोकॉल एक कदम नैनो छानने का काम है, लेकिन कुछ निवेश संबंधी निर्णय शामिल हैंestigators इस कदम को बाहर कर दिया है. हालांकि, हम टुकड़े और 200 एनएम से भी बड़ा है और इसलिए दृढ़ता से एक निस्पंदन कदम सहित सिफारिश vesicles के उन्मूलन के महत्व पर जोर दिया. यदि एक अधिक कड़े अलगाव की जरूरत है, 100 एनएम फिल्टर, प्रयोग किया जा सकता है, लेकिन कृपया ध्यान दें कि अगर चिपचिपा तरल पदार्थ का उपयोग किया जाता है, इन फिल्टर को आसानी से अवरुद्ध और exosomal सामग्री खो दिया है बन सकता है. इसके अलावा, एक 100 एनएम निस्पंदन exosomes की आकारिकी प्रभावित करते हैं और इसके अलावा अगर exosomes बड़े पैमाने पर कर रहे हैं वे खो दिया जा सकता है हो सकता है. इस प्रकार, 200 एनएम फिल्टर exosome अलगाव के लिए उपयुक्त लगता है. निस्पंदन के बाद, 120.000 XG पर अनिवार्य ultracentrifugation गोली exosomes के लिए प्रयोग किया जाता है. exosomes आगे पीबीएस के साथ धोया जा सकता है, एंटीबॉडी लिपटे मोतियों के लिए बाध्य है और धोया, या संदूषण प्रोटीन को हटाने के लिए एक sucrose के ढाल पर रखा. बहरहाल, यह एक बहुत ही संसाधन लेने वाली प्रक्रिया है कि हम नहीं होना आवश्यक तर्क है, खासकर अगर शुरू नमूना मात्रा छोटे और / या शाही सेना सामग्री ओ हैच exosomes कम है, के रूप में अतिरिक्त कदम काफी आगे सामग्री में कमी होगी. लेकिन, फिर से, पृथक vesicles की प्रकृति और कुछ प्रोटीन की उपस्थिति या अनुपस्थिति से साबित किया जाना चाहिए.
तिथि करने के लिए, कोई exosomes के लिए बिल्कुल अनोखा प्रोटीन मार्कर के लिए सत्यापित करें कि नमूना exosomes और कुछ नहीं होता है की पहचान की गई है. एक परिणाम के रूप में, तरीकों का एक संयोजन exosomes, आकार और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा exosomes की आकारिकी का निर्धारण सहित विशेषताएँ करने के लिए आवश्यक हैं. इसके अलावा, नमूने की पवित्रता इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित किया जा सकता है है, इस पद्धति के रूप में microparticles, apoptotic निकायों या सेल मलबे के रूप में बड़ा vesicles, के साथ उदाहरण के लिए, नमूना के संदूषण के स्तर के एक अवलोकन प्रदान कर सकते हैं. इसके अलावा, exosomes के प्रोटीन सामग्री प्रवाह cytometry और वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, और दोनों झिल्ली के एक विश्लेषण में इन दो तरीकों के परिणाम के संयोजन (जैसे CD63 बाध्य औरExosomes की CD81) और भली भाँति प्रोटीन (जैसे Tsg101 और Alix). Exosomes, जैसे CD63, Tsg101 और Alix, और endoplasmic जालिका प्रोटीन calnexin जैसे प्रोटीन के अभाव में समृद्ध प्रोटीन की जांच, एक संकेत है कि exosome समृद्ध गोली वास्तव में exosomes और सेल के अन्य डिब्बों से नहीं vesicles contaminating है.
शाही सेना के प्रोफ़ाइल है कि exosomes में पता चला है मौलिक बरकरार कोशिकाओं में पाया कि शाही सेना के लिए अलग है. इस प्रकार, exosomal Bioanalyzer द्वारा या जेल आधारित शाही सेना विश्लेषण दृष्टिकोण में विश्लेषण शाही सेना 18s और 28S rRNA सब यूनिटों है, जो सेलुलर शाही सेना के विश्लेषण में प्रमुख हैं के लिए दो चोटियों की कमी है. इसलिए हम तर्क है कि rRNA के एक नमूने में किसी भी महत्वपूर्ण मात्रा का पता लगाने के संकेत करता है कि कुल निकाले शाही सेना exosomal मूल के अकेले नहीं है, और इस तरह है कि अलगाव की विधि में सुधार और गुणवत्ता आश्वासन जरूरत है.
Disclosures
जीएल एक शाही सेना की कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए वैक्टर के रूप में exosomes का उपयोग करने के लिए संबंधित पेटेंट के सह मालिक है.
Acknowledgments
इस अध्ययन स्वीडिश अनुसंधान परिषद (676-01-3 K2008-57X-20) द्वारा वित्त पोषण किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 65670 | |
| Quick-seal ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | Depending on the rotor used different tubes are needed. Ti70 (342414), Ti45 (345776) | |
| Quick-Seal Cordless Tube Topper kit | Beckman Coulter Inc. | 358312 | |
| Filtropur Syringe Filter, 0.20μm | Sarstedt Ltd | 83.1826.001 | For viscose fluids and/or large volumes, a Vacuum filtration system, 0.2 μm, from VWR International can be used instead (514-0600). |
| Formvar/carbon coated nickel grids | Ted Pella, Inc. | 1GN200 | |
| Mouse-anti-human CD63 | BD Biosciences | 556019 | Final conc: 0.05μg/μl |
| Isotype control; IgG1κ (MOPC 21) | Sigma-Aldrich | M9269 | Final conc: 0.05μg/μl |
| Anti-Mouse IgG Gold Conjugate, 10 nm | Sigma-Aldrich | G7777 | Final conc: 1% |
| LEO 912AB Omega Electron microscope | Carl Zeiss, Inc. | Or equivalent equipment. | |
| 4μm aldehyd/sulphate latex beads | Interfacial Dynamics | 12-4000 | |
| Antibody for coating of the latex beads | For example anti-CD63 from BD Bioscience (556019) | ||
| Intelli-Mixer RM-2L | ELMI | Or equivalent equipment. | |
| IgG from human serum | Sigma-Aldrich | I4506 | |
| Antibodies for detection | BD Biosciences | For example: PE anti-CD63 (556020)PE anti-CD9 (555372)PE anti-CD81 (555676) Isotype control (555749) | |
| BD FACSAria | BD Biosciences | ||
| Transsonic T 490 DH | ELMA | Or equivalent equipment. | |
| miRCURY RNA Isolation Kit | Exiqon A/S | 300110 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939A |
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