Isolering og karakterisering av RNA som inneholder Exosomes

Summary

Dette papiret demonstrerer metoder for isolering, rensing og påvisning av exosomes, samt teknikker for analyse av deres molekylære innhold. Disse metodene er tilpasningsdyktige for exosome isolert fra både cellekultur media og biologiske væsker, og kan utover analyser av molekylære innholdet også være nyttig i funksjonelle studier.

Abstract

Feltet av exosome forskning er raskt voksende, med en dramatisk økning i publikasjoner de siste årene. Disse små blærer (30-100 nm) av endocytic opprinnelse ble først foreslått å fungere som en måte for retikulocytter å utrydde transferrin reseptor mens modning i erytrocytter ^1, og ble senere kalt exosomes. Exosomes er dannet av indre spirende sen endosomes, produsere multivesicular organer (MVBs), og slippes ut i miljøet ved sammensmeltingen av MVBs med plasma membran ^2. Siden den første oppdagelsen av exosomes, har et bredt spekter av celler er vist å frigjøre disse blemmer. Exosomes har også blitt påvist i flere biologiske væsker, inkludert plasma, nasal lavage fluid, spytt og brystmelk ^3-6. Videre har det vært vist at innhold og funksjon exosomes avhenger av opprinnelse celle og under hvilke forhold de er produsert. En rekke funksjoner har blitt demonerkonsentrert for exosomes, slik som induksjon av toleranse mot allergen ^7,8, utrydding av etablerte svulster i ⁹ mus, hemming og aktivering av naturlige drepeceller ^10-12, fremming av differensiering inn i T regulatoriske celler ^13, stimulering av T-celle spredning ¹⁴ og induksjon av T-celle apoptose ^15. År 2007 har vi vist at exosomes frigjøres fra mast celler inneholder messenger RNA (mRNA) og mikroRNA (miRNA), og at RNA kan skytteltrafikk fra en celle til en annen via exosomes. I mottakeren cellene ble mRNA skytteltrafikk ved exosomes vist seg å være oversatt til protein, tyder på en regulerende funksjon av de overførte RNA ^16. Videre har vi også vist at exosomes avledet fra celler dyrket under oksidativt stress kan indusere toleranse mot ytterligere stress i mottakerens celler og dermed foreslå en biologisk funksjon av exosomal shuttle RNA ^17. Cellekultur media og biologiske væsker contain en blanding av vesikler og kaste fragmenter. En høy kvalitet isolasjon metode for exosomes, etterfulgt av karakterisering og identifisering av exosomes og deres innhold, er derfor avgjørende å skille exosomes fra andre vesikler og partikler. Her presenterer vi en metode for isolering av exosomes fra både cellekultur medium og kroppsvæsker. Denne isolasjonen metoden er basert på gjentatte sentrifugering og filtrering trinn, etterfulgt av en endelig ultracentrifugation trinn der de exosomes er pelleterte. Viktige metoder for å identifisere exosomes og karakterisere exosomal morfologi og proteininnhold er fremhevet, blant annet elektron mikroskopi, flow cytometri og Western blot. Rensing av den totale exosomal RNA er basert på spin kolonne kromatografi og exosomal RNA yield og størrelse distribusjon er analysert ved hjelp av en Bioanalyzer.

Protocol

1. Exosome isolasjon

1. Grow cellene i medium med exosome-free serum. Dermed eventuelle serum lagt til cellekultur medium bør være tømt for exosomes ved ultracentrifugation på 120 000 xg over natten ved 4 ° C før bruk.
2. Overfør cellesuspensjon til koniske rør.
3. Sentrifuger ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C til pellet cellene.
4. Overfør supernatanten til Ultrasentrifuger rør og hvis ikke helt full legge PBS.
5. Sentrifuger prøven på 16 500 xg i 20 minutter ved 4 ° C til videre fjerne celler og celle rusk.
6. Filter supernatanten gjennom et 0,2 mikrometer filter for å fjerne partikler større enn 200 nm.
7. Overfør filtrert supernatanten til nye Ultrasentrifuger rør og forsegle rørene før Ultrasentrifuger på 120 000 xgi 70 minutter ved 4 ° C til pellet den exosomes.
8. Kast supernatanten.
9. For maksimal exosome henting, Resuspender exosome berikeed pellet gjentatte ganger i et lite volum (~ 3 x 50 mL) av en egnet buffer. Denne bufferen er avhengig av nedstrøms eksperimenter planlagt etter exosome isolasjon. For eksempel er lysis buffer brukes for protein og RNA isolering, er PBS brukes for elektron mikroskopi og flowcytometri og for funksjonelle studier medium kan bli foretrukket.

Merk; exosomes kan også isoleres fra ulike kroppsvæsker, som for eksempel plasma, med samme prosedyre som for cellekultur media. For viskøse væsker kan det være nødvendig å fortynne prøven med PBS før sentrifugering og filtrering trinn. I forhold til sentrifugering hastighet for punkt 5 ovenfor, kan det økes til 29 500 xg, og ultracentrifugation i nr. 7 kan utvides til 90 minutter ^18.

Hvis prøven må videre renset exosome pellets kan fløt på en sukrose gradient og exosomes vil primært bli funnet i brøken representing en tetthet på 1.13 til 1.19 g / ml ^2.

2. Exosome identifisering av elektronmikroskopi

1. For ytterligere å eliminere forurensende proteiner, Resuspender exosome beriket pellet i PBS og Ultrasentrifuger på 120 000 xgi 70 minutter ved 4 ° C til re-pellet den exosomes.
2. Ta en liten delmengde av prøven for protein isolasjon og total protein måling. Sørg for at bare en liten del av prøven løses opp og brukes for protein måling og holde intakt exosomes, løst i PBS, separat på is eller ved -80 ° C for videre eksperimenter.
3. Legg en dråpe, ca 10 mikrogram exosomal protein av intakt exosomes resuspendert i PBS, på en Parafilm. Så, med tang, forsiktig plassere en formvar karbon belagt nikkel rutenett på toppen av hver dråpe i 30-60 minutter. Sikre at rutenettet er posisjonert med belegget vendt dråpen inneholder exosomes.
4. Plasser tre dråper, hver 30 mL av PBS på than Parafilm og vaske rutenettet ved sekvensielt posisjonering rutenettet på toppen av dråper av PBS, og bruke et absorberende papir i mellom. Bruk absorberende papir forsiktig bare ved å holde den tett til side av nettet, uten å ta kontakt med den belagte området.
5. Fix prøven ved å deponere en dråpe på 2% Paraformaldehyde på Parafilm og plasser risten på toppen av fallet i 10 minutter.
6. Gjenta vasketrinn i punkt 4, før farging med en passende antistoff. Vanlig brukte antistoffer er anti-CD63 og anti-MHC klasse II. Elektron mikroskopi kan også utføres uten farging som exosomes kan identifiseres utelukkende basert på størrelse og morfologi. Vi anbefaler imidlertid å vurdere størrelse, morfologi og tilstedeværelsen av en membran protein for en mer avgjørende validering.
7. Overfør rutenett til en 30 mL dråpe av den primære antistoffet av valg og inkuberes i 40 minutter. Vask ved å gjenta punkt 4, men bruker 0,1% bovint serum albumin i PBS istedenfor PBS alene.
8. Gjenta punkt 7, men med 10 nm-gull merket sekundære antistoff og vask med PBS alene.
9. Post-fix prøven ved å legge et fall på 2,5% glutaraldehyd til Parafilm og inkuber rutenettet på toppen av fallet i 10 minutter. Gjenta vask i punkt 4, men bruke fem dråper av avionisert vann i stedet for tre dråper av PBS.
10. Kontrast prøven ved å legge et fall på 2% uranyl acetate til Parafilm og inkuber rutenettet på toppen av fallet i 15 minutter.
11. Bygg prøven ved å legge et fall på 0,13% metyl cellulose og 0,4% uranyl acetate til Parafilm og inkuber rutenettet på toppen av fallet i 10 minutter.
12. Fjern overflødig væske ved å forsiktig bruke en absorberende papir, før du plasserer rutenettet på et papir med den bestrøkne siden opp og la det lufttørke i 5 minutter.
13. Undersøk forberedelsene med et elektronmikroskop eller oppbevar nett i et rutenett boks for framtidig arbeid.

3.Exosome karakterisering av flowcytometri

Som exosomes er for små til å bli oppdaget av nåværende flowcytometri utstyr, er det nødvendig å først binde exosomes til antistoff belagt perler (Figur 1). Disse perlene kan enten kjøpes som et ferdig produkt eller gjort i laboratorium med antistoff av valget. Avhengig av exosomal cellular opprinnelse, kan ulike antistoffer kobles til perler som kan være enten av magnetiske eller latex karakter. Vi har for tiden bruker anti-MHC klasse II eller anti-CD63 belagt perler for denne analysen.

1. For bruk av "hjemmelaget" antistoff belagt perler, bruker vi fire mikrometer latex perler belagt med anti-CD63 antistoff. Vask 25 mL 4 mikrometer latex perler (30 x 10 ⁶ perler) to ganger i 100 mL MES buffer, 3 000 xg i 15-20 minutter og oppløses igjen pelleten i 100 mL MES buffer. Klargjør antistoffet blandingen inneholder et volum lik på 12,5 mikrogram antistoff med samme volum av MES buffer. Legg tilperler til antistoffet blandingen og inkuber henhold agitasjon over natten i romtemperatur. Vask antistoff belagt perler tre ganger med PBS (3 000 xgi 20 minutter) og løser opp pellet i 100 mL lagring buffer (med en endelig konsentrasjon på 300 000 perler / mikroliter).
2. For hver prøve (hver antistoff), fortsetter med et volum tilsvarende minst 30 mikrogram exosomal protein (av intakt exosomes løst i PBS) per ~ 100 000 antistoff belagt perler.
3. Inkuber exosomes og perler, i et totalt volum på 300 mL PBS, over natten ved 4 ° C under forsiktig bevegelse.
4. Block ved å tilsette 300 mL av 200 mM glysin og inkuberes i 30 minutter.
5. Vask exosome-perle komplekser to ganger i vaskebuffer (1-3% serum i PBS), 600 xgi 10 minutter.
6. Inkuber exosome-perle komplekser med 50 mL IgG antistoffer ved 4 ° C. Vask exosome-perle komplekser to ganger i vaskebuffer som beskrevet i trinn 5.
7. Legg til 90 mL vaskebuffer og 10 mLantistoff av valget (ideelt anti-CD9, anti-CD63 eller anti-CD81) til exosome-perle komplekser og inkuberes i 40 minutter under forsiktig bevegelse. Vask exosome-perle komplekser to ganger i vaskebuffer som beskrevet i trinn 5.
8. Legg til 300 mL vaskebuffer og skaffe data ved hjelp av flowcytometri.

Som omtalt ovenfor, forskjellige perler kan brukes, for eksempel lateks perler som beskrevet i protokollen eller magnetiske perler. Hvis magnetiske kuler brukes i stedet, så vær oppmerksom på at protokollen er litt annerledes. Blokkering trinn (punkt 4) er ikke nødvendig og vask utføres ved å plassere røret i en magnetisk stå i stedet for en sentrifugering.

Lagring buffer som brukes for "hjemmelaget" antistoff belagt perler, inneholder 0,1% glysin og 0,1% natrium azid i PBS, med en pH på 7,2.

Viktigere, sørg for å bruke exosome utarmet serum for flowcytometri vaskebuffer (1-3% serum i PBS), for å unngåserum exosomes forurensende analysen.

Notat, når du utfører exosome karakterisering ved hjelp av antistoff kombinert perler det er viktig å erkjenne at det bare er en bestemt undergruppe, spesifikt for antistoff brukt, som er isolert og karakterisert.

Fire. Exosome deteksjon av Western blot

Western blot er en veletablert metode og vi vil ikke gå i detalj om selve metoden, men fokuserer på viktigheten av et egnet protein isolasjon før Western blot og ulike antistoffer brukes.

1. Oppløs exosome pellet i protein lysis buffer av valg og pipettere grundig, etterfulgt av Vortex-blanding. For ytterligere å lyse den exosomes, sonicate prøven i et vannbad 3 x 5 minutter med vortex-miksing i mellom. Endelig sentrifuge prøven, 13 000 xg i 5 minutter ved romtemperatur, og overfør supernatanten til en ny Eppendorf rør.
2. Målesre den totale protein ved en metode for valg og last 20-50 mikrogram protein per brønn.
3. Separate og overføre proteiner ved gel elektroforese og electroblotting.
4. Blokker og vask membranen før du utfører farging mot proteiner beriket i exosomes.
5. Påvise spesifikke protein ved chemiluminescence, digital imaging system og analyse programvare.

Så det er ingen exosome spesifikke markører, proteiner som er beriket med exosomes, fra alle forskjellige cellular opprinnelse, blir ofte brukt for exosome deteksjon. Dette er proteiner som tetraspanins (f.eks CD9, CD63 og CD81), cytoskjelettet assosiert protein (f.eks ezrin) og proteiner involvert i multivesicular biogenesis (f.eks Tsg101 og Alix). Andre proteiner som også ofte oppdages i exosomes er Flotillin, Hsc70 og ulike Rab proteiner osv. Men det er også celle spesifikke proteiner som finnes i exosomes som A33 (intestinal epitelceller), CD3(T celler) og MHC klasse II (antigenpresenterende celler). Dermed kan avhengig av hvilken celletype de exosomes er frigjort fra markører for deteksjon variere.

Som andre avdelinger av cellen kan også produsere vesikler, er det videre anbefalt å bestemme tilstedeværelsen av proteiner fra disse avdelingene som endoplasmatiske retikulum (f.eks calnexin og Grp78) og Golgi-apparatet (f.eks GM130). Dermed indikerer mangel på disse proteinene ingen eller lite forurensing av vesikler av andre avdelinger i prøven studert.

5. Isolering av exosomal RNA og RNA-analyse

1. Oppløs exosome pellet i RNA lysis buffer av valg og utføre RNA ekstraksjon. Ulike RNA isolering kits kan benyttes avhengig av nedstrøms eksperimenter, men kolonne baserte metoder gir prøver med et bredere spekter av RNA. Vi er for tiden bruker miRCURY RNA Isolation Kit av Exiqon, men andre kits kan være egnet, avhengig av scientific spørsmål på hånden.
2. Når du utfører RNA isolering det er viktig å jobbe i et RNase-fritt miljø. Derfor bruker nukleinsyre og nukleasefritt gratis pipette tips og tørk både benk og utstyr fri fra forurensninger og RNases.
3. For RNA isolering, ved å bruke miRCURY RNA Isolation Kit, oppløse exosome pellet i 350 mL av lysis løsning og utføre vortex-miksing i 15 sekunder.
4. Tilsett 200 mL av 95% etanol og vortex-miksing i 10 sekunder.
5. Plasser en kolonne i en samling rør og overføre lyseres exosomes til kolonnen og sentrifuger 1 minutt på 14 000 x g.
6. Vask tre ganger ved å tilsette 400 mL av Wash Solution til kolonnen inneholder exosomal RNA og sentrifuger i 1 minutt ved 14 000 x g.
7. Sentrifuger kolonnen for 2 minutter på 14 000 xg å sørge for at kolonnen er tørt og plasser den tørre kolonne i en RNase-frie Eppendorf rør.
8. Tilsett 50 mL eluering buffer til kolonnen og sentrifuger for 2 minutter ved 200 xg, etterfulgt av 1 minutt på 14 000 x g.
9. Fortsett med isolert RNA eller lagre den i -80 ° C.

For deteksjon og analyse av ekstrahert total exosomal RNA, bruker en Agilent 2100 Bioanalyzer med RNA 6000 Nano eller RNA 6000 Pico Kit. Analysen viser exosomal RNA avkastning og størrelse distribusjon.

Seks. Representant Resultater

Exosomes er for små til å bli oppdaget av tilgjengelig flowcytometri metoder, og er derfor knyttet til antistoff-belagte perler før de analyseres (figur 1). Som exosome-perle komplekser kan aggregere flowcytometri spredningsdiagram kan inneholde ulike bestander av enkeltrom, dobbeltrom og tremannsrom perler (Figur 2A). Pilen viser den enkle perler som er nærmere analysert. En CD63 positive enkelt perle-exosome befolkningen i forhold til sine isotype kontroll er vist i figur 2B.

e_content "> På grunn av den lille størrelsen på exosomes, kan de bare være direkte visualisert med elektronmikroskopi, og ikke ved lysmikroskopi. Typiske morfologiske kjennetegn exosomes er runde og 30-100 nm sized membran blemmer. I Figur 3, elektronmikroskopi fotografiene viser exosomes immunostained (A) med gull-merket antistoff for CD63 (indikert av pil) og ikke-immunostained exosomes (B).

Å fastslå at den isolerte vesikler er faktisk exosomes og ytterligere karakterisere exosomal proteiner, er Western blot brukte. Figur 4 viser fravær av calnexin, en endoplasmatiske retikulum markør. Dette indikerer lite forurensing av vesikler fra det endoplasmatiske retikulum. Videre viser Figur 4 forekomster av CD81 i exosomes, som er en tetraspanin ofte beriket i exosomes.

Cellular RNA hovedsak inneholdee ribosomalt RNA (rRNA), sett på som de to fremtredende topper for 18S og 28S rRNA subenheter i en Bioanalyzer analyse (Figur 5A). Men exosomal RNA varierer i profilen sin som exosomes mangler de to rRNA toppene (18S og 28S) og er beriket i korte RNA som mRNA og miRNA (Figur 5B).

Figur 1. På grunn av den lille størrelsen på exosomes (30-100 nm), kan de ikke skille fra støy og bakgrunnen når analyseres med flow-cytometri. Derfor er det nødvendig å feste dem til antistoff belagt perler før exosomes analyseres, som deretter kan visualiseres ved laser.

Figur 2. Den exosome-perler kompleks kan aggregere med hverandre og danner doble og triple perler (A). Pilen viser fram én perle-exo Noen befolkningen som er inngjerdet og brukes for videre analyse. Denne populasjonen vil være direkte i forhold til en isotype kontroll (fylt grå topp) for å fastslå tilstedeværelsen av membran molekyler av exosomes. CD63 positive exosomes (svart åpen peak) er vist i figur B.

Figur 3. Electron mikrografer av exosomes med typisk morfologi og størrelse (40-80 nm) (A og B). Pilen i figur A viser den gylne partikkel av sekundære antistoff, verifisere at dette exosome har CD63 på sin membran overflate.

Figur 4. Western blot resultater som viser fravær av det endoplasmatiske retikulum protein calnexin men tilstedeværelsen av proteinet ofte beriket i exosomes, CD81 tetraspanin.

ve_content ">
Figur 5. Bioanalyzer resultater som viser tilstedeværelse RNA i cellene (A) og exosomes (B). Piler indikerer 18S og 28S rRNA subenheter stede i celler. Som exosomal RNA mandig inneholde små RNA ingen eller liten rRNA er identifisert i exosomes.

Discussion

Når studerer molekylær innhold og / eller funksjon exosomes, er det avgjørende å bruke en høy kvalitet isolasjon metode som gir en passende avkastning og lavest mulig grad av forurensning. Metodikken er beskrevet i denne artikkelen er en veletablert metode for å isolere exosomes og å studere deres RNA innhold og biologisk funksjon. Videre er betydningen av karakterisering av isolerte exosomes, ved en kombinasjon av ulike metoder, herunder elektron mikroskopi, flow cytometri, og Western blot, uthevet.

Når isolere exosomes, er det første sentrifugering trinnet (300 xg) som brukes til pellets celler som kan være til stede i cellen suspensjon eller studert biologiske væske. Den andre sentrifugering på 16 500 xg må være sterkt nok til å pellet døde celler, større rusk, apoptotiske legemer og andre organeller. Etter dette sentrifugering, noen protokoller inkluderer en nano-filtrering skritt, men noen investigators har ekskludert dette trinnet. Men, understreker vi viktigheten av å utrydde fragmenter og vesikler større enn 200 nm og er derfor sterkt anbefale inkludert en filtrering trinn. Hvis en strengere isolasjon er nødvendig, kan 100 nm filtre brukes, men merk at hvis viskøse væsker benyttes, kan disse filtrene lett kan bli blokkert og exosomal materiale går tapt. Dessuten kan en 100 nm filtrering påvirke morfologi av exosomes og videre hvis exosomes er på større skala de kan være tapt. Dermed blir 200 nm filtre synes hensiktsmessig for exosome isolasjon. Etter filtrering, er det obligatorisk ultracentrifugation på 120000 xg brukes til å pellet på exosomes. Den exosomes kan bli ytterligere vasket med PBS, bundet til antistoff belagt perler og vasket, eller plassert på et sukrose gradient for å fjerne forurensning proteiner. Men dette kan være en svært ressurskrevende prosess som vi argumenterer for ikke å være nødvendig, særlig hvis start prøvevolum er liten og / eller RNA innhold of exosomes er lav, som ekstra trinn vil vesentlig redusere materialet videre. Men igjen, bør arten av de isolerte vesikler være bevist ved tilstedeværelse og fravær av visse proteiner.

Til dags dato har ingen absolutt unikt protein markør for exosomes blitt identifisert for å bekrefte at prøven inneholder exosomes og ingenting annet. Som et resultat, er en kombinasjon av metoder som kreves for å karakterisere exosomes, herunder fastsettelse av størrelse og morfologi av exosomes ved elektronmikroskopi. Dessuten kan renheten i prøven bestemmes av elektronmikroskopi, da denne metoden kan gi en oversikt over nivået av forurensning av prøven, for eksempel med større blemmer, som mikropartikler, apoptotiske legemer eller celleavfall. Videre kan proteininnholdet av exosomes bestemmes av flowcytometri og Western blot, og kombinasjonen av disse to metodene resulterer i en analyse av både membran bundet (f.eks CD63 ogCD81) og internalisert proteiner (f.eks Tsg101 og Alix) av exosomes. Påvisning av proteiner beriket i exosomes som CD63, Tsg101 og Alix, og fraværet av proteiner som det endoplasmatiske retikulum protein calnexin, er en indikasjon på at exosome beriket pellet er faktisk exosomes og ikke forurenser vesikler fra andre avdelinger i cellen.

Profilen av RNA som er oppdaget i exosomes er fundamentalt annerledes enn det som av RNA som finnes i intakte celler. Dermed exosomal RNA analysert av Bioanalyzer eller gel-baserte RNA analyse tilnærminger mangler to topper for 18S og 28S rRNA subenheter, som er fremtredende i analyse av cellulære RNA. Vi vil derfor argumentere for at påvisning av eventuelle vesentlige mengder rRNA i en prøve indikerer at den totale RNA ekstrahert ikke er av exosomal opprinnelse alene, og dermed at isolering metoden må forbedres og kvalitetssikres.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Optima L-90K Ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.	65670
Quick-seal ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter Inc.		Depending on the rotor used different tubes are needed. Ti70 (342414), Ti45 (345776)
Quick-Seal Cordless Tube Topper kit	Beckman Coulter Inc.	358312
Filtropur Syringe Filter, 0.20μm	Sarstedt Ltd	83.1826.001	For viscose fluids and/or large volumes, a Vacuum filtration system, 0.2 μm, from VWR International can be used instead (514-0600).
Formvar/carbon coated nickel grids	Ted Pella, Inc.	1GN200
Mouse-anti-human CD63	BD Biosciences	556019	Final conc: 0.05μg/μl
Isotype control; IgG1κ (MOPC 21)	Sigma-Aldrich	M9269	Final conc: 0.05μg/μl
Anti-Mouse IgG Gold Conjugate, 10 nm	Sigma-Aldrich	G7777	Final conc: 1%
LEO 912AB Omega Electron microscope	Carl Zeiss, Inc.		Or equivalent equipment.
4μm aldehyd/sulphate latex beads	Interfacial Dynamics	12-4000
Antibody for coating of the latex beads			For example anti-CD63 from BD Bioscience (556019)
Intelli-Mixer RM-2L	ELMI		Or equivalent equipment.
IgG from human serum	Sigma-Aldrich	I4506
Antibodies for detection	BD Biosciences		For example: PE anti-CD63 (556020)PE anti-CD9 (555372)PE anti-CD81 (555676) Isotype control (555749)
BD FACSAria	BD Biosciences
Transsonic T 490 DH	ELMA		Or equivalent equipment.
miRCURY RNA Isolation Kit	Exiqon A/S	300110
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939A