Isolering og karakterisering af RNA-Varer Exosomes

Summary

Dette papir demonstrerer metoder til isolering, oprensning og detektion af exosomes, samt teknikker til analyse af deres molekylære indhold. Disse metoder er tilpasses til exosome isolation fra både cellekulturmedier og biologiske væsker, og kan udover analyse af molekylære indhold også være nyttige i funktionelle studier.

Abstract

Feltet af exosome forskning er hastigt voksende, med en dramatisk stigning i publikationer i de seneste år. Disse små vesikler (30-100 nm) af endocytic oprindelse blev først foreslået at fungere som en måde for retikulocytter at udrydde transferrin receptor, mens modning til erytrocytter ^1, og blev senere opkaldt exosomes. Exosomes er dannet af proceduren for aktiv spirende for sent endosomes, der producerer multivesicular organer (MVBs), og er frigivet i miljøet ved fusion af MVBs med plasmamembranen ^2. Siden den første opdagelse af exosomes, har en bred vifte af celler vist sig at frigive disse blærer. Exosomes er også blevet påvist i flere biologiske væsker, herunder plasma-, næse udskylning væske, spyt og modermælk ^3-6. Desuden er det blevet påvist, at indholdet og funktion exosomes afhænger af oprindelse celle, og de betingelser, hvorunder de er produceret. En række funktioner er blevet dæmonerkoncentreret for exosomes, såsom induktion af tolerance mod allergenet ^7,8, udryddelse af etablerede tumorer hos mus ^9, hæmning og aktivering af naturlige dræberceller ^10-12, fremme differentiering ind i T regulerende celler ^13, stimulering af T-celle proliferation ¹⁴ og induktion af T-celle-apoptose ^15. År 2007 har vi vist, at exosomes frigives fra mastceller indeholder messenger RNA (mRNA) og microRNA (miRNA), og at RNA kan pendlet fra én celle til en anden via exosomes. I modtagerens celler blev mRNA pendlet ved exosomes vist sig at være oversat til protein, hvilket tyder på en regulerende funktion af de overførte RNA ^16. Desuden har vi også vist, at exosomes stammer fra celler dyrket under oxidativt stress kan inducere tolerance mod yderligere stress hos modtageren celler og dermed tyder på en biologisk funktion af exosomal Shuttle ^RNA-17. Cellekulturmedier og biologiske væsker samarbejdentain en blanding af vesikler og skur fragmenter. En høj kvalitet isolation metode til exosomes, efterfulgt af karakterisering og identifikation af exosomes og deres indhold, er derfor afgørende at skelne exosomes fra andre vesikler og partikler. Her præsenteres en metode til isolering af exosomes fra både cellekulturmedium og kropsvæsker. Denne isolation Metoden er baseret på gentagen centrifugering og filtrering skridt, efterfulgt af en endelig ultracentrifugering trin, hvor de exosomes er pelleteret. Vigtige metoder til at identificere exosomes og karakterisere de exosomal morfologi og proteinindhold er fremhævet, herunder elektronmikroskopi, flowcytometri og Western blot. Rensning af den samlede exosomal RNA er baseret på spin søjlekromatografi og exosomal RNA udbytte og størrelsesfordeling analyseres ved hjælp af en Bioanalyzer.

Protocol

1. Exosome isolation

1. Grow celler i medie med exosome-fri serum. Således skal alle serum føjet til cellekulturmedium skal være udtømt for exosomes ved ultracentrifugering ved 120 000 xg natten over ved 4 ° C før brug.
2. Overfør cellesuspension til koniske rør.
3. Centrifuger ved 300 xgi 10 minutter ved 4 ° C til pellet cellerne.
4. Overfør supernatanten til ultracentrifuge rør, og hvis det ikke er helt fyldt tilføje PBS.
5. Centrifugér prøven ved 16 500 xgi 20 minutter ved 4 ° C for yderligere at fjerne celler og celle snavs.
6. Filtrer flydelaget gennem et 0,2 μm filter til at fjerne partikler større end 200 nm.
7. Overfør de filtrerede supernatant til nye ultracentrifuge rør og forsegle rørene før ultracentrifuge ved 120 000 xg for 70 minutter ved 4 ° C til Pelleter exosomes.
8. Supernatanten fjernes.
9. For maksimal exosome hentning, opblande exosome berigeed pellet gentagne gange i et lille volumen (~ 3 x 50 μl) af en passende buffer. Denne buffer afhænger af de efterfølgende eksperimenter planlægges efter exosome isolation. For eksempel er lysisbuffer anvendes til protein-og RNA isolation, er PBS anvendes til elektronmikroskopi og flowcytometri og funktionelle studier medium kan være at foretrække.

Bemærk, exosomes kan også isoleres fra forskellige kropsvæsker, såsom plasma, brug af samme procedure som for cellekulturmedier. For tyktflydende væsker kan det være nødvendigt at fortynde prøven med PBS før centrifugering og filtrering skridt. I forhold til centrifugeringshastighed for punkt 5 ovenfor, kan det øges til 29 500 xg, og det ultracentrifugering i punkt 7, kan forlænges til 90 minuter ^18.

Hvis prøven er behov for yderligere rensede exosome pille kan flyde på en saccharose gradient og exosomes vil primært findes i fraktionen representing en massefylde på 1,13-1,19 g / ml ^2.

2. Exosome identifikation ved elektronmikroskopi

1. For yderligere at eliminere forurening af proteiner, resuspender exosome beriget pellet i PBS og ultracentrifuge ved 120 000 xg for 70 minutter ved 4 ° C til re-Pelleter exosomes.
2. Tag en lille prøve af prøven for protein isolation og total protein måling. Sørg for, at kun en lille del af prøven er lyserede og anvendt til protein måling og holde intakt exosomes, løst i PBS, særskilt på is eller ved -80 ° C til videre eksperimenter.
3. Placer en dråbe, cirka 10 mikrogram exosomal protein af den intakte exosomes resuspenderes i PBS, på en Parafilm. Så med pincet, position forsigtigt en formvar kulstof belagt nikkel gitter på toppen af ​​hver dråbe i 30-60 minutter. Sikre, at nettet er placeret med belægningen side mod drop indeholder exosomes.
4. Placer tre dråber, hver 30 μl af PBS på than Parafilm og vask forsyningsnettet ved fortløbende positionering gitteret på toppen af ​​dråber af PBS, og brug en absorberende papir i mellem. Brug absorberende papir forsigtigt bare ved at holde det tæt til den side af nettet, uden at komme i kontakt med den coatede areal.
5. Fix prøven ved deponering et fald på 2% paraformaldehyd på Parafilm og læg risten oven på faldet i 10 minutter.
6. Gentag vasketrin i punkt 4, før immunfarvning med en passende antistof. Almindeligt anvendte antistoffer er anti-CD63 og anti-MHC klasse II. Elektronmikroskopi kan også udføres uden immunfarvning som exosomes kan identificeres alene baseret på størrelse og morfologi. Vi anbefaler dog, at vurdere størrelsen, morfologi og tilstedeværelsen af ​​en membran protein for en mere overbevisende validering.
7. Overførsel nettet til en 30 μl dråbe af det primære antistof valg og inkuber i 40 minutter. Vask ved at gentage punkt 4, men brug 0,1% bovint serum albumin i PBS i stedet for PBS alene.
8. Gentag punkt 7, men med 10 nm-guld mærket sekundært antistof og vask med PBS alene.
9. Post-fix prøven ved at tilføje et fald på 2,5% glutaraldehyd til Parafilm og inkubér gitteret på toppen af ​​drop i 10 minutter. Gentag vasken i punkt 4, men bruger fem dråber demineraliseret vand i stedet for tre dråber af PBS.
10. Kontrast prøven ved at tilføje et fald på 2% uranyl acetat til Parafilm og inkubér gitteret på toppen af ​​drop i 15 minutter.
11. Integrer prøven ved at tilføje et fald på 0,13% methylcellulose og 0,4% uranyl acetat til Parafilm og inkubér gitteret på toppen af ​​drop i 10 minutter.
12. Fjern overskydende væske ved forsigtigt at bruge en absorberende papir, før du placerer gitteret på et papir med den coatede side opad og lad det lufttørre i 5 minutter.
13. Undersøg forberedelserne med en elektron mikroskop eller gemme gitre i et gitter kasse for det fremtidige arbejde.

3.Exosome karakterisering af flowcytometri

Da exosomes er for små til at blive opdaget af de nuværende flowcytometri udstyr, er det nødvendigt først at binde exosomes til antistof coated perler (Figur 1). Disse perler kan enten købes som en færdig produkt eller fremstillet i laboratoriet med antistoffet af valg. Afhængig af exosomal cellulære oprindelse, kan forskellige antistoffer koblet til perler som kan være enten af ​​magnetiske eller latex karakter. Vi har i øjeblikket bruge anti-MHC klasse II eller anti-CD63 belagt perler for denne analyse.

1. Til brug for "hjemmelavede" antistof-coatede perler, bruger vi 4 μm latex perler belagt med anti-CD63 antistof. Vask 25 μl 4 μm latex perler (30 x 10 ⁶ perler) to gange i 100 μl MES-buffer, 3 000 xgi 15-20 minutter og genopløses pellet i 100 μl MES buffer. Forbered antistof blanding, der indeholder en mængde svarende på 12,5 mikrogram antistof med den samme mængde MES buffer. Tilsætperler til antistoffet blandingen og inkuber under omrøring natten over ved stuetemperatur. Vask antistof coatede perler tre gange med PBS (3 000 xgi 20 minutter) og opløses pellet i 100 μl af oplagring buffer (med en endelig koncentration på 300 000 perler / mikroliter).
2. For hver prøve (hver antistof), fortsætter med en mængde svarende til mindst 30 mikrogram exosomal protein (af den intakte exosomes løst i PBS) pr ~ 100 000 antistof coated perler.
3. Inkuber exosomes og perler, i et totalt volumen på 300 μl PBS, natten over ved 4 ° C under blid bevægelse.
4. Bloker ved at tilsætte 300 μl af 200 mM glycin og inkuber i 30 minutter.
5. Vask exosome-perle komplekser to gange med vaskebuffer (1-3% serum i PBS), 600 xgi 10 minutter.
6. Inkubér exosome-perlen komplekser med 50 μl IgG antistof ved 4 ° C. Vask exosome-perle komplekser to gange i vaskebuffer, som beskrevet i trin 5.
7. Tilsæt 90 μl vaskebuffer og 10 μlantistof valg (ideelt anti-CD9, anti-CD63 eller anti-CD81) til exosome-perle komplekser og inkuber i 40 minutter under blid bevægelse. Vask exosome-perlen komplekser to gange i vaskebuffer, som beskrevet i trin 5.
8. Tilsæt 300 μl vaskebuffer og erhverve data ved hjælp af flowcytometri.

Som nævnt ovenfor, forskellige perler kan bruges, såsom latex perler som beskrevet i protokollen eller magnetiske perler. Hvis magnetiske perler er brugt i stedet, bedes du bemærke, at protokollen er lidt anderledes. Blokeringen trin (punkt 4) er ikke nødvendig, og vask udføres ved at placere røret i en magnetisk stå i stedet for en centrifugering.

Opbevaring buffer bruges til "hjemmelavede" antistof coated perler, indeholder 0,1% glycin og 0,1% natrium azid i PBS, med en pH-værdi på 7,2.

Vigtigere er det, sørg for at bruge exosome udtømt serum for flowcytometri vaskebuffer (1-3% serum i PBS), for at undgå enhverserum exosomes forurener analysen.

Bemærk, når du udfører exosome karakterisering ved hjælp af antistof-koblede perler er det vigtigt at erkende, at det kun er en bestemt delpopulation, der er specifikke for den anvendte antistof, som er isoleret og karakteriseret.

4. Exosome detektion med Western blot-

Western blot er en veletableret metode og vi vil ikke gå i detaljer om selve metoden, men fokuserer på betydningen af ​​et passende protein isolation, før de vestlige skamplet og de forskellige anvendte antistoffer.

1. Opløs exosome pellet i proteinet lysisbuffer valgfrihed og pipettering grundigt, efterfulgt af vortex-blanding. For yderligere at Lysér de exosomes, sonikeres prøven i et vandbad 3 x 5 minutter med vortex-blanding i mellem. Endelig centrifugeres prøven, 13 000 xgi 5 minutter ved stuetemperatur, og overfører supernatanten til et nyt eppendorfrør.
2. Measure det samlede proteinindhold med en metode med valg og belastning 20-50 mikrogram protein per brønd.
3. Separate og overfører proteiner ved gelelektroforese og electroblotting.
4. Block og vask membranen, før du udfører immunfarvning mod proteiner beriget med exosomes.
5. Detektere specifikke protein ved kemiluminescence, digital billedbehandling system og analyse software.

Da der ikke er nogen exosome specifikke markører, proteiner, der er beriget med exosomes, fra alle de forskellige cellulære oprindelse, er almindeligt anvendt til exosome detektion. Disse er proteiner, som tetraspanins (f.eks CD9, CD63 og CD81), cytoskeleton associeret protein (f.eks ezrin) og proteiner involveret i multivesicular biogenese (f.eks Tsg101 og Alix). Andre proteiner, der også ofte fundet i exosomes er Flotillin, Hsc70 og forskellige Rab proteiner osv. Men der er også celle specifikke proteiner som findes i exosomes såsom A33 (intestinale epitelceller), CD3(T celler) og MHC klasse II (antigen præsenterende celler). Således kan afhængigt af, hvad celletype de exosomes er frigivet fra markører for detektion variere.

Som andre rum i cellen også kan producere vesikler, anbefales endvidere at fastslå tilstedeværelsen af ​​proteiner fra disse rum, såsom det endoplasmatiske reticulum (f.eks calnexin og Grp78) og Golgi apparatet (f.eks GM130). Således, mangel på disse proteiner indikerer ingen eller kun ringe forurening af vesikler af andre rum i prøven undersøgt.

5. Isolering af exosomal RNA og RNA-analyse

1. Opløs exosome pellet i RNA lysisbuffer af valg og udføre RNA ekstraktion. Forskellige RNA isolation kits kan anvendes afhængigt af downstream eksperimenter, men kolonnen baserede metoder giver prøver med et bredere spektrum af RNA. Vi er i øjeblikket bruger miRCURY RNA Isolation Kit fra Exiqon, men andre kits kan være egnede afhængigt af SCientific spørgsmålstegn ved hånden.
2. Når du udfører RNA isolation er det vigtigt at arbejde i et RNase-frit miljø. Derfor bruger nukleinsyre og nuklease gratis pipettespidser og tørre både bænk og udstyr fri for forurenende stoffer og RNases.
3. For RNA isolation, ved at bruge miRCURY RNA Isolation Kit opløse exosome pellet i 350 μl af lysering løsning og udføre vortex-blanding i 15 sekunder.
4. Tilsæt 200 μl 95% ethanol og vortex-blanding i 10 sekunder.
5. Placer en kolonne i en samling rør og overføre lyserede exosomes til kolonnen og centrifuger 1 minut ved 14 000 x g.
6. Vask tre gange ved at tilsætte 400 μl vaskeopløsning til den kolonne, der indeholder exosomal RNA og centrifuger i 1 minut ved 14 000 x g.
7. Centrifuger kolonnen i 2 minutter ved 14 000 xg for at sikre, at kolonnen er tørt og placer den tørre kolonne i en RNase-fri eppendorfrør.
8. Tilsæt 50 μl Elution buffer til kolonnen og centrifuger i 2 minutter ved 200 xg, efterfulgt af 1 minut ved 14 000 x g.
9. Fortsæt med den isolerede RNA eller gemme det i -80 ° C.

Til påvisning og analyse af det udvundne totale exosomal RNA, bruge en Agilent 2100 Bioanalyzer med RNA 6000 Nano eller RNA 6000 Pico Kit. Analysen viser exosomal RNA udbytte og størrelsesfordeling.

6. Repræsentative resultater

Exosomes er for små til at blive opdaget af disponible flowcytometri metoder, og er derfor knyttet til antistof-coatede perler, inden der analyseres (figur 1). Som exosome-perle komplekser kan samle flowcytometri punktdiagram kan indeholde forskellige populationer af enkelt-, dobbelt og tredobbelt perler (Figur 2A). Pilen angiver den enkelte perler, der analyseres nærmere. En CD63 positiv enkelt perle-exosome befolkningen i forhold til sin isotype kontrol er vist i figur 2B.

e_content "> På grund af den beskedne størrelse af exosomes, kan de kun være direkte visualiseres med elektronmikroskopi, og ikke ved lysmikroskopi. Typiske morfologiske karakteristika exosomes er rund og 30-100 nm mellemstore membranblærer. I Figur 3, elektronmikroskopi fotografier viser exosomes immunostained (A) med guld-mærket antistof til CD63 (angivet med pil) og ikke-immunostained exosomes (B).

For at bestemme, at den isolerede vesikler er faktisk exosomes og til yderligere at karakterisere exosomal proteiner, er Western blot almindeligt anvendt. Figur 4 viser mangel af calnexin, en endoplasmatiske reticulum markør. Dette indikerer lille forurening af vesikler fra det endoplasmatiske reticulum. Desuden Figur 4 viser tilstedeværelse af CD81 i exosomes, som er en tetraspanin almindeligt beriget i exosomes.

Cellulære RNA primært indeholders ribosomalt RNA (rRNA), der ses som de to prominente toppe for 18S og 28S rRNA underenheder i en Bioanalyzer analyse (figur 5A). Men exosomal RNA adskiller sig i deres profil som exosomes mangler de to rRNA toppe (18S og 28S) og er beriget med korte RNA som mRNA og miRNA (Figur 5B).

Figur 1. På grund af den beskedne størrelse af exosomes (30-100 nm), kan de ikke skelne fra støj og baggrund, når de analyseres med flowcytometri. Derfor er det nødvendigt at vedhæfte dem til antistof coated perler før exosomes analyseres, som derefter kan visualiseres af laser.

Figur 2. Den exosome-perler komplekset kan samlet med hinanden og danner dobbelt og tredobbelt perler (A). Pilen er at demonstrere en enkelt perle-exo nogle befolkningsgrupper, som er indhegnet og bruges til yderligere analyse. Denne population vil være direkte i forhold til en isotype kontrol (fyldt grå peak) til at bestemme tilstedeværelsen af ​​membran molekyler af exosomes. CD63 positive exosomes (sort åben peak) er vist i figur B.

Figur 3. Electron micrographs af exosomes med den typiske morfologi og størrelse (40-80 nm) (A og B). Pilen i figur A angiver den gyldne partikel i det sekundære antistof, verificere, at dette exosome har CD63 på sin membran overfladen.

Figur 4. Western blot resultater, som viser fravær af det endoplasmatiske reticulum protein calnexin men tilstedeværelsen af ​​proteinet almindeligt beriget med exosomes, tetraspanin CD81.

ve_content ">
Figur 5. Bioanalyzer resultater, der viser tilstedeværelsen RNA i celler (A) og exosomes (B). Pile angiver 18S og 28S rRNA subunits til stede i celler. Som exosomal RNA mandig indeholde små RNA ingen eller kun ringe rRNA er identificeret i exosomes.

Discussion

Når man studerer de molekylære indhold og / eller funktion af exosomes, er det afgørende at bruge en høj kvalitet isoleret metode, der giver et passende afkast og den lavest mulige grad af forurening. Den metode, der beskrives i dette papir er en veletableret metode til at isolere exosomes og undersøge deres RNA indhold og biologiske funktion. Desuden er betydningen af ​​karakterisering af de isolerede exosomes, ved en kombination af forskellige metoder, herunder elektronmikroskopi, flowcytometri, og Western blot, fremhævet.

Når isolere exosomes, er det første centrifugering skridt (300 xg), der anvendes til at pellet celler, der kan være til stede i cellen suspension eller studeret biologisk væske. Den anden centrifugering ved 16 500 xg skal være tilstrækkelig stærk til at pellet døde celler, større vragrester, apoptotiske organer og andre organeller. Efter dette centrifugering, omfatter nogle protokoller en nano-filtrering skridt, men nogle investigators har udelukket dette skridt. Men vi understrege vigtigheden af ​​at udrydde fragmenter og blærer større end 200 nm, og derfor kraftigt anbefale, herunder en filtrering skridt. Hvis en strengere isolation er nødvendig, kan 100 nm filtre bruges, men bemærk at hvis tyktflydende væsker anvendes, kan disse filtre let blive blokeret og exosomal materiale er gået tabt. Desuden kan en 100 nm filtrering påvirker morfologi exosomes og desuden hvis exosomes er på større skala, de kan gå tabt. Således er de 200 nm filtre vil være hensigtsmæssigt for exosome isolation. Efter filtrering, er den obligatoriske ultracentrifugering på 120.000 xg bruges til at pille den exosomes. Den exosomes kan yderligere vaskes med PBS, bundet til antistof coatede perler og vasket, eller placeres på et saccharoseindhold gradient til at fjerne forurening proteiner. Men dette kan være en meget ressourcekrævende proces, som vi argumenterer ikke at være nødvendig, især hvis prøvens volumen er lille og / eller RNA indhold of de exosomes er lav, som ekstra trin i væsentlig grad vil mindske materialet yderligere. Men igen, skal arten af ​​den isolerede vesikler bevises ved tilstedeværelse og fravær af bestemte proteiner.

Til dato har ingen helt unik protein markør for exosomes blevet identificeret til at kontrollere, at prøven indeholder exosomes og intet andet. Som et resultat er en kombination af metoder, der kræves til at karakterisere exosomes, herunder fastsættelse af størrelse og morfologi exosomes ved elektronmikroskopi. Desuden kan renheden af ​​prøven bestemmes ved elektronmikroskopi, som denne metode kan give et overblik over omfanget af forurening af prøven, for eksempel med større blærer, som mikropartikler, apoptotiske organer eller celler vragrester. Desuden kan proteinindholdet i de exosomes bestemmes ved flowcytometri og Western blot, og kombinationen af ​​disse to metoder resulterer i en analyse af både membran bundet (f.eks CD63 ogCD81) og internaliseret proteiner (f.eks Tsg101 og Alix) af exosomes. Påvisning af proteiner beriget med exosomes, som CD63, Tsg101 og Alix, og fraværet af proteiner som det endoplasmatiske reticulum protein calnexin, er en indikation af, at exosome beriget pellet er faktisk exosomes og ikke forurener vesikler fra andre rum i cellen.

Profilen af ​​RNA, som er påvist i exosomes er fundamentalt anderledes end for RNA findes i intakte celler. Således exosomal RNA analyseret af Bioanalyzer eller i gel-baserede RNA analyse tilgange mangler to toppe for 18S og 28S rRNA subunits, som er fremtrædende i analysen af ​​cellulære RNA. Vi har derfor hævde, at påvisning af væsentlige mængder af rRNA i en prøve viser, at den samlede ekstraherede RNA ikke er af exosomal oprindelse alene, og således at den isolation metode skal forbedres og kvalitetssikres.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Optima L-90K Ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.	65670
Quick-seal ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter Inc.		Depending on the rotor used different tubes are needed. Ti70 (342414), Ti45 (345776)
Quick-Seal Cordless Tube Topper kit	Beckman Coulter Inc.	358312
Filtropur Syringe Filter, 0.20μm	Sarstedt Ltd	83.1826.001	For viscose fluids and/or large volumes, a Vacuum filtration system, 0.2 μm, from VWR International can be used instead (514-0600).
Formvar/carbon coated nickel grids	Ted Pella, Inc.	1GN200
Mouse-anti-human CD63	BD Biosciences	556019	Final conc: 0.05μg/μl
Isotype control; IgG1κ (MOPC 21)	Sigma-Aldrich	M9269	Final conc: 0.05μg/μl
Anti-Mouse IgG Gold Conjugate, 10 nm	Sigma-Aldrich	G7777	Final conc: 1%
LEO 912AB Omega Electron microscope	Carl Zeiss, Inc.		Or equivalent equipment.
4μm aldehyd/sulphate latex beads	Interfacial Dynamics	12-4000
Antibody for coating of the latex beads			For example anti-CD63 from BD Bioscience (556019)
Intelli-Mixer RM-2L	ELMI		Or equivalent equipment.
IgG from human serum	Sigma-Aldrich	I4506
Antibodies for detection	BD Biosciences		For example: PE anti-CD63 (556020)PE anti-CD9 (555372)PE anti-CD81 (555676) Isotype control (555749)
BD FACSAria	BD Biosciences
Transsonic T 490 DH	ELMA		Or equivalent equipment.
miRCURY RNA Isolation Kit	Exiqon A/S	300110
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939A