Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

भेषज और कार्यात्मक जेनेटिक Assays Planarian की पुनर्जनन में हेरफेर करने के लिए बिही Dugesia Published: August 31, 2011 doi: 10.3791/3058
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pharmacology and The Stem Cell Institute, University of Minnesota Medical School

Summary

एक जीवित जानवर के भीतर स्टेम सेल भेदभाव के अध्ययन के लिए एक आकर्षक मॉडल planarian flatworm है. पुनर्जनन सरल विच्छेदन प्रयोगों है कि आसानी से एक बुनियादी प्रयोगशाला में प्रदर्शन कर रहे हैं के द्वारा अध्ययन किया है और (औषधीय और आनुवंशिक उत्तरदायी हैं

Protocol

1. ट्रंक टुकड़ा उत्थान परख

  1. पुनर्योजी परख से पहले कम से कम 5 दिनों के लिए कीड़े की एक पलटन खिला जानवरों बेकार और किया जाता भोजन (~ 30 बरकरार कीड़े, प्रत्येक कीड़ा ~ 8-10 मिमी लंबे पोस्ट - भुखमरी) के लिए स्वतंत्र हैं सुनिश्चित करना बंद करो.
  2. परख के दिन पर, एक पूर्व जमी समतल पानी के साथ बर्फ पकवान कुल्ला और प्लास्टिक की चादर के साथ फ्लैट ठंडी सतह को कवर. संदंश का प्रयोग, प्लास्टिक की चादर पर एक फिल्टर पेपर जगह.
  3. वसंत पानी की कुछ बूंदों के साथ फिल्टर पेपर गीला. Planarians फिल्टर (<फिल्टर प्रति 20 कीड़े) एक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग कर पर स्थानांतरण. कीड़े फिल्टर पर repositioned किया जा सकता है है यदि आवश्यक हो, अधिक वसंत पानी के साथ repipetting द्वारा. अतिरिक्त तरल पदार्थ निकालें.
  4. एक स्केलपेल का उपयोग करना, एक एकल जानवर के पूर्वकाल सर्वोच्च और ग्रसनी (चित्रा 1 ए) के पूर्वकाल अंत के बीच लगभग आधे रास्ते बना कटौती से सिर काटना .
  5. एक स्केलपेल का उपयोग करना, एक एकल लगभग जानवर की पूंछ के अंत और ग्रसनी (चित्रा 1 ए) के पीछे के अंत के बीच आधे रास्ते बनाया कटौती से पूंछ क्षेत्र काटना. स्केलपेल पर एक कागज काटने के बाद 70% इथेनॉल के साथ सिक्त तौलिया का उपयोग कर अधिक बलगम निकालें. स्केलपेल से अधिक इथेनॉल पोछो.
  6. वसंत पानी युक्त एक पेट्री डिश (100 x 25mm गहराई) में संदंश के माध्यम से फिल्टर स्थानांतरण. ~ 3 मिनट रुको (घाव बंद करने के लिए, एक और घाव के बन्द रखो darkening द्वारा नमूदार).
  7. फिल्टर पेपर से पुनर्योजी परख और हस्तांतरण thermostatted इनक्यूबेटर के लिए (24 डिग्री सेल्सियस) के लिए वांछित मध्यम युक्त पेट्री डिश में ट्रंक टुकड़े कुल्ला.
  8. कुल ~ 1 सप्ताह के बाद पुनर्योजी phenotype, जब पुनर्जीवित संरचनाओं से पहचाने जाने योग्य (चित्रा 1 ए).

2. उत्थान के भेषज हेरफेर: ध्रुव Praziquantel द्वारा प्रेरित

  1. DMSO में solubilizing दवा (200mm शेयर के लिए 1ml में 62.4mg PZQ) द्वारा Praziquantel शेयर (PZQ) तैयार करें. उसी दिन पर प्रयोग करें.
  2. 50ml बफर Montjuch लवण में दवा युक्त समाधान (90 सुक्ष्ममापी PZQ) के बनाओ. ~ 1 फैलाव सुनिश्चित मिनट के लिए भंवर.
  3. # 1], ट्रंक टुकड़े के अंतिम चरण [1.7] PZQ करने के लिए काउहोट उजागर [प्रोटोकॉल के ऊपर विस्तृत रूप में ट्रंक टुकड़ा पुनर्योजी परख प्रदर्शन.
  4. 24-48 घंटे के बाद, मुद्रा PZQ युक्त वसंत पानी के लिए मीडिया, कीड़े कई बार धोने (3>).
  5. इनक्यूबेटर करने के लिए कीड़े लौटें. कुल (दो सिर, चित्रा 1 बी) ध्रुव काटने के बाद एक सप्ताह.

3. उत्थान के आनुवंशिक हेरफेर: vivo आरएनएआई खिला प्रोटोकॉल में

  1. परख के लिए पहले, चिकन यकृत homogenate तैयार. Foodstock से फैटी, पीले रंग वर्गों, और शेष जिगर प्यूरी त्यागें. जाली झरनी और भंडारण के लिए विभाज्य निलंबन (1.5mL ट्यूबों, -20 डिग्री सेल्सियस) के माध्यम से फ़िल्टर प्यूरी.
  2. पहले परख के लिए, 1ml नमूने में आपूर्ति aliquoting, -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत गोजातीय लाल रक्त कोशिकाओं (RBCs) तैयार
  3. आरएनएआई के लिए कीड़े का चयन करें. और नकारात्मक नियंत्रण (कोई आरएनएआई phenotype के साथ जीन भी पछाड़ना प्रयोगात्मक पलटन की तुलना में स्तरों के आकलन के लिए उपयोगी), ब्याज की जीन, सकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 1C, डी और ई ज्ञात आरएनएआई phenotype साथ जीन): तीन साथियों उपयोग किया जाता है. प्रत्येक काउहोट के लिए, ~ 250 कीड़े (~ 8-10 मिमी कम से कम 5 दिनों के लिए भूख से मर के बाद लंबे समय) का उपयोग करें. प्लास्टिक के टब में वसंत पानी में स्टोर.
  4. प्रत्येक आरएनएआई काउहोट, ई. कोलाई व्यक्त dsRNA ब्याज की लक्ष्यीकरण जीन के पिघलना शेयर के लिए [8], साथ चिकन यकृत homogenate की एक ट्यूब के साथ [3.1] और लाल रक्त कोशिकाओं की एक ट्यूब [3.2].
  5. गोली बैक्टीरिया (13,000 जी, 1 मिनट). निकालें सतह पर तैरनेवाला और 2xYT मीडिया (700μl ~) में resuspend गोली. Recentrifuge, पर बर्फ सतह पर तैरनेवाला, जगह गोली त्यागें.
  6. एक बड़े बोर P200 विंदुक टिप टिप के अंत में कटौती करके बनाएँ. चिकन यकृत (150 μL) homogenate और लाल रक्त कोशिकाओं (50 μL) के एक मिश्रण करने के लिए आरएनएआई खिला मिश्रण बनाने में अच्छी तरह से बैक्टीरिया गोली resuspend. Centrifugation द्वारा हवाई बुलबुले निकालें.
  7. खिलाने के लिए, प्लास्टिक कीड़े युक्त टब से पानी के बहुमत को दूर (~ 1 इंच गहराई छोड़). भंवर टब कीड़े इस कंटेनर के केंद्र पर ध्यान केंद्रित करने के लिए, और एक कीड़े corralling सर्कल में पिपेट आरएनएआई खिला मिश्रण. एक हस्तांतरण विंदुक प्रयोग को ध्यान से escapees अन्य diners के perturbing बिना वापस आरएनएआई खिला मिश्रण पर मनाना!
  8. (~ 1 घंटा) खिलाने के बाद, planarians कि अच्छी तरह से खिलाया की पहचान. ये कीड़े किया जाता लाल रक्त कोशिकाओं से एक गहरे लाल रंगाई दिखा. दूसरों को त्यागें.
  9. ध्यान ताजा वसंत पानी के साथ समाधान खिला, अशांति कम से कम भोजन की egestion को रोकने की जगह. ऐसा करने के लिए, धीरे कीड़े स्थानीयकरण एक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग कर ट्यूब के एक तरफ करने के लिए बाहर turbid पानी डालना, और ध्यान से ताजा पानी के साथ प्रतिस्थापित नीचे टब के विपरीत दीवार डाला. Resubmerge planarians जल्दी से हवा करने के लिए लंबे समय तक निवेश के रूप में भी भोजन egestion में परिणाम है.
  10. शिथिल सेअल कंटेनर ढक्कन और इनक्यूबेटर करने के लिए वापसी (24 डिग्री सेल्सियस)
  11. आरएनएआई कई चक्र पर खिला प्रोटोकॉल (~ 2-3 दिनों के अलावा), पुनर्योजी [# 1 प्रोटोकॉल] आरएनएआई phenotypes के लिए स्क्रीन के चक्र के साथ interspersed दोहराएँ. खिलाने और कई जीनों के लिए प्रभावी उत्थान के लिए एक मानक प्रोटोकॉल चित्रा 2 है, जो कुल अवधि में ~ 1 महीने लगते में दिखाया गया है.

विभिन्न जीनों के लिए इस योजना को संशोधित करें, के रूप में इष्टतम प्रोटोकॉल mRNA स्थिरता, ऊतक स्थानीयकरण, प्रोटीन perdurance, या एक phenotype कि उत्थान के बाद कई खिला चक्र precludes के विकास जैसे कारकों पर निर्भर करेगा. बस phenotype के penetrance के लिए स्क्रीनिंग (यदि स्पष्ट हो), या qPCR दृष्टिकोण से नकारात्मक नियंत्रण काउहोट साथ लक्षित mRNA स्तर की तुलना द्वारा पछाड़ना स्तर का आकलन करें.

4. प्रतिनिधि परिणाम:

ट्रंक टुकड़ा उत्थान परख ऐसी है कि सभी कीड़े सामान्य पूर्वकाल पीछे (पूंछ को सिर) polarity के साथ पुनर्जन्म चाहिए मजबूत है. इस के रूप में काटने के बाद पांच दिनों, पूर्वकाल eyespots (asterixed, चित्रा 1A) के उद्भव के द्वारा सुविधा के रूप में जल्द ही रन किया जा सकता है. हालांकि, खो संरचनाओं के पूरा रूपात्मक बहाली एक सप्ताह के बाद होता है. PZQ द्वारा ट्रंक टुकड़ा उत्थान के भेषज हेरफेर करने के लिए दो सिरों वाले कीड़े उपज (चित्रा 1 बी) भी मजबूत है (ईसी 50 87 = (-) 11% द्विध्रुवी टुकड़े, 48 20 घंटे के लिए 70μM PZQ) . ध्रुव एक एकल पुनर्योजी चक्र से अधिक होता है. इन assays में निचले प्रभावकारिता की संभावना दवा विलेयता और / या भंडारण, या एक अलग flatworm प्रजातियों जहां PZQ अप्रभावी है का उपयोग के साथ मुद्दों से संबंधित है. कम penetrance के साथ दवाओं के लिए, एक anteriorization सूचकांक अक्सर मध्यवर्ती phenotypes पूरा ध्रुव से 22 अलग स्कोर के लिए प्रयोग किया जाता है. आरएनएआई से सकारात्मक नियंत्रण constructs के परिणामस्वरूप phenotypes चित्र 1 में दिखाया जाता है: Dugesia के आरएनएआई बिही छह 1 (डी जम्मू - छह 1) एक अंधा 23 phenotype (चित्र 1C), Dugesia बिही PC2 के आरएनएआई (डीजे-PC2) में परिणाम प्रकाश घृणा 24 प्रतिक्रिया (चित्रा 1D) और आरएनएआई के नुकसान में परिणाम Dugesia बिही βcatenin 1 (डीजे - βcatenin 1) एक दो सिरों वाले ट्रंक टुकड़े (चित्र 1E) से 16-19, phenotype 21 में परिणाम. इन phenotypes निम्नलिखित सरल आरएनएआई प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है: डीजे छह - एक (FFxFx), डीजे-PC2 (FFFx), डीजे-βcatenin 1 (FFxFx), जहां F = खिला चक्र और एक्स क्रमशः = पुनर्योजी चक्र.

चित्रा 1
चित्रा 1:... ठीक है, ट्रंक टुकड़ा उत्थान परख एक वामपंथी planarian (ऊपर) और योजनाबद्ध (मध्य) की छवि excised ट्रंक टुकड़ा के स्थान को दिखाने के ट्रंक टुकड़ा उत्थान के timecourse regenerating टुकड़ा (दिन) के संकेत समय पर उपस्थिति दिखा बी दो सिरों PZQ जोखिम द्वारा उत्पादित. planarian की छवि सी द्वारा उत्पादित डीजे छह - एक स्थिर डीजे-PC2 आरएनएआई कीड़े (दाग लाल) में प्रकाश घृणा प्रतिक्रिया की आरएनएआई डी हानि, मोबाइल नियंत्रण कीड़ा की तुलना में (. दाग 'अंधा' कीड़ा हरे). ई द्विध्रुवी planarian डीजे - βcatenin-1 आरएनएआई द्वारा उत्पादित. BE में, आरएनएआई कीड़े के मूल पूर्वकाल अंत बाईं ओर उन्मुख है.

चित्रा 2
चित्रा 2: भोजन और ठेठ आरएनएआई कई feedings शामिल प्रोटोकॉल (एफ), और पुनर्योजी चक्र (x) है कि डी में कई जीनों के पछाड़ना के लिए प्रभावी है के लिए चक्र को काटने के अनुक्रम बिही. व्यक्तिगत जीनों के लिए इस प्रोटोकॉल के संशोधन करने के लिए इष्टतम परिणाम का उपयोग कर उदाहरण के लिए, की जरूरत हो सकती कम कोष्ठकों () या खिलाने और पुनर्योजी चक्र की एक बड़ी संख्या है.

Discussion

प्रोटोकॉल यहाँ planarian Dugesia के उत्थान बिही के लिए अध्ययन और छेड़खानी विस्तार assays का वर्णन. वे सरल कर रहे हैं और विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है जैसे कि वे आसानी से प्रयोगशाला या कक्षा में किया जा सकता नहीं है. Assays व्यक्तिगत प्रदर्शन किया जा सकता है है, या संयुक्त (vivo में दवा efficacies की रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीनिंग के लिए) और उम्मीदवार जीन स्तर पर निष्पादित किया जा सकता है, या निष्पक्ष, उच्च throughput 8 स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलनीय रहे हैं. चाहे अपने ही अधिकार में planarians की साज़िश जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए, या ऊतक उत्थान के अध्ययन के लिए एक वैकल्पिक मॉडल में स्तनधारी homologues के vivo समारोह में आकलन करने के लिए, इन तरीकों के शोधकर्ताओं की एक विविध रेंज से ब्याज उत्प्रेरित करना चाहिए.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

प्रयोगशाला में कार्य (MCB0919933) NSF और NIH (GM088790) द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spring water Kandiyohi. Premium Waters Inc. Minneapolis, MN n/a Other forms of spring water work well also. Trial first in viability assays.
1 x buffered Montjuïch salts: NaCl (1.6mM), CaCl2 (1mM), MgSO4 (1mM), MgCl2 (0.1mM), KCl (0.1mM), NaHCO3 (1.2mM), HEPES (1.5mM). pH 7.4 at 24°C. Multiple Suppliers n/a Artificial water for drug treatments during regenerative assays to ensure pH buffering. 5/8 Holtfreter’s solution is an alternative.
2xYT Broth Fisher Scientific BP2467-500 Media = 31 g/L . Autoclaved.
Petri Dish (100x25mm) Fisher Scientific 08-757-11 Housing worms during regeneration cycles
Square Dish (100x100x15mm) Fisher Scientific 08-757-11A Fill with water, freeze for ice tray used as worm cutting surface
Plastic tub: Ziploc Twist ’n Loc (16oz). Various n/a Convenient water tight containers for RNAi cohorts
Chicken Liver Commercial grocery n/a Bias towards organic supplies, owing to avoidance of antibiotics.
Hand Blender Any Supplier n/a Use for making chicken liver puree
Wire 1mm Mesh strainer Any Supplier n/a Use for straining chicken liver puree
Bovine red blood cells Lampire Biological Laboratories 7240807 100% Washed and pooled RBC suspension
Circular filter papers Whatman, GE Healthcare 1003 055
Transfer Pipette Fisher Scientific 13-711-41
Sterile, surgical blades Multiple Suppliers n/a
±Praziquantel Sigma-Aldrich P4668 Store powder aliquots in the dark at 4°C. Desiccate.
Dj-six-1 GenBank AJ557022.1 RNAi positive control for “eye-less” phenotype23
Dj-βcatenin-1 GenBank AB181913.1 RNAi positive control for two-headed phenotype17
Dj-PC2 RNAi positive control for loss of light aversion phenotype24

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morgan, T. H. Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata. Arch Entwm Org. 7, 364-397 Forthcoming.
  2. Robb, S. M., Ross, E., Sánchez Alvarado, A. SmedGD: the Schmidtea mediterranea genome database. Nucleic Acids Res. 36, 599-606 (2008).
  3. Forsthoefel, D. J., Newmark, P. A. Emerging patterns in planarian regeneration. Curr Opin Genet Dev. 19, 412-4120 (2009).
  4. Adell, T., Cebrià, F., Saló, E. Gradients in Planarian Regeneration and Homeostasis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
  5. Agata, K., Watanabe, K. Molecular and cellular aspects of planarian regeneration. Semin Cell Dev Biol. 10, 377-383 (1999).
  6. Newmark, P. A. &, Sánchez-Alvarado, A. Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics. Nat Rev Genet. 3, 210-219 (2002).
  7. Reddien, P. W., Sánchez-Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Ann Rev Cell Dev Biol. 20, 725-757 (2004).
  8. Reddien, P. W., Bermange, A. L., Murfitt, K. J., Jennings, J. R., Sánchez-Alvarado, A. Identification of genes needed for regeneration, stem cell function, and tissue homeostasis by systematic gene perturbation in planaria. Dev Cell. 8, 635-649 (2005).
  9. Newmark, P. A., Reddien, P. W., Cebria, F. &, Sánchez-Alvarado, A. Ingestion of bacterially expressed double-stranded RNA inhibits gene expression in planarians. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 11861-11865 (2003).
  10. Collins, J. J. Genome-Wide Analyses Reveal a Role for Peptide Hormones in Planarian Germline Development. PLoS Biology. 8, e10000509-e10000509 (2010).
  11. Cebrià, F. Regenerating the central nervous system: how easy for planarians! Dev Genes Evol. , 733-748 (2007).
  12. Mineta, K. Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7666-7671 (2003).
  13. Oviedo, N. J., Nicolas, C. L., Adams, D. S., Levin, M. Emerging Model Organisms. A Laboratory Manual Chapter. 8, (2009).
  14. Buttarelli, F. R., Pellicano, C., Pontieri, F. E. Neuropharmacology and behavior in planarians: translations to mammals. Comp Biochem Physiol. 147, 399-408 (2008).
  15. Sánchez-Alvarado, A., Newmark, P. A. Double-stranded RNA specifically disrupts gene expression during planarian regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 5049-5054 (1999).
  16. Gurley, K. A., Rink, J. C., Sánchez-Alvarado, A. Beta-catenin defines head versus tail identity during planarian regeneration and homeostasis. Science. 319, 323-327 (2008).
  17. Yazawa, S., Umesono, Y., Hayashi, T., Tarui, H., Agata, K. Planarian Hedgehog/Patched establishes anterior-posterior polarity by regulating Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 22329-22334 (2009).
  18. Petersen, C. P., Reddien, P. W. Smed-betacatenin-1 is required for anteroposterior blastema polarity in planarian regeneration. Science. 319, 327-330 (2008).
  19. Iglesias, M., Gomez-Skarmeta, J. L., Saló, E., Adell, T. Silencing of Smed-betacatenin1 generates radial-like hypercephalized planarians. Development. 135, 1215-1221 (2008).
  20. Nogi, T., Zhang, D., Chan, J. D., Marchant, J. S., S, J. A novel biological activity of praziquantel requiring voltage-operated Ca2+ channel beta subunits: subversion of flatworm regenerative polarity. PLoS Negl Trop Dis. 3, e464-e464 (2009).
  21. Oviedo, N. J. Long-range neural and gap junction protein-mediated cues control polarity during planarian regeneration. Dev Biol. 339, 188-199 (2010).
  22. Nogi, T., Levin, M. Characterization of innexin gene expression and functional roles of gap-junctional communication in planarian regeneration. Dev Biol. 287, 314-335 (2005).
  23. Mannini, L. Djeyes absent (Djeya) controls prototypic planarian eye regeneration by cooperating with the transcription factor Djsix-1. Dev Biol. 269, 346-359 (2004).
  24. Agata, K. Structure of the planarian central nervous system (CNS) revealed by neuronal cell markers. Zoolog Sci. 15, 433-440 (1998).

Tags

विकास जीवविज्ञान 54 अंक स्टेम सेल पुनर्जनन Planarian Flatworm Dugesia बिही
भेषज और कार्यात्मक जेनेटिक Assays Planarian की पुनर्जनन में हेरफेर करने के लिए<em> बिही Dugesia</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chan, J. D., Marchant, J. S.… More

Chan, J. D., Marchant, J. S. Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica. J. Vis. Exp. (54), e3058, doi:10.3791/3058 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter