Summary
Den enkla tillgänglighet embryot har gjort för experiment för att kartlägga cell öden med hjälp av flera metoder, bland annat brud vaktel chimärer och fokala färg märkning. I denna artikel visar vi en metod ägg beredningen som har optimerats för lång överlevnadstid.
Abstract
Studien av utvecklingen har varit mycket hjälp av användningen av kycklingembryo som en experimentell modell. Den enkla tillgänglighet embryot har gjort för experiment för att kartlägga cell öden med hjälp av flera metoder, bland annat brud vaktel chimärer och fokala färg märkning. Dessutom möjliggör det molekylära störningar av flera slag, inklusive placering av protein-belagda pärlor och införande av plasmid DNA med i ovo elektroporation. Dessa experiment har givit viktiga data om utvecklingen av det centrala och perifera nervsystemet. För många av dessa studier är det nödvändigt att öppna äggskal och återförsluta utan störande embryots tillväxt. Embryot kan undersökas vid på varandra följande utvecklingsstadier genom att återuppta äggskal. Medan det finns flera utmärkta metoder för att öppna hönsägg, i denna artikel visar vi en metod som har optimerats för lång överlevnadstid. I denna metod vilar ägget på sin sida och ett litet fönster skärs i skalet. Efter den experimentella procedur, är skalet används för att täcka ägget under hela dess utveckling. Klart plasttejp överliggande det äggskal skyddar embryot och hjälper till att behålla fukt under resten av inkubationstiden. Denna metod har använts med början vid två dagars inkubation och har gjort det möjligt överlevnad genom mogna embryonala åldrar.
Protocol
1. Ta bort ägg från inkubatorn
- Behåll vid 37 ° C och en relativ luftfuktighet som över 60%.
- Ta bort äggen, slå ägg 90 ° så att den stora basen ligger horisontellt.
2. Pinnen ägg att sterilisera
- Mätta en bunt icke-steril kompress med 70% etanol.
- Använd två till tre bitar att svabba upp till 5 ägg. Kassera när gasväv är smutsig.
3. Förbereda äggvita borttagning webbplats
- Klipp ut och placera en 1 "x 1" bit 3M tejp precis till vänster om basen för att skydda det område där albumin kommer att dras ut.
4. Borttagning av äggvita
- Använd poängen med en sax för att göra ett litet hål i mitten av bandet.
- Med hjälp av en 10 cc spruta med en 18-gauge, 1-tums nål, sakta borra in nålen genom hålet som gjorts av sax.
- Kör ner nålen i 45 ° C vinkel mot botten av ägget.
- Luta nålen mot centrum och dra upp 3 till 4 ml av äggvita.
5. Fönstring
- Skär en 3 "x 3" plastbit tejp och sträcka ut den för att passa på toppen av ägget. Utöka hörn av torget runt den rundade ändar av den horisontella ytan av ägg, försiktigt så att inte dra för hårt. Dra bandet så att det är tätt mot ytan av ägg utan veck.
- Använda ett par vassa raka 4 "dissektion sax, vrid ett hål i botten mitt i det område där bandet var placerad. Sakta guide nedre bladet på saxen in i ägget att se till att hålla de tips upp mot insidan av skalet. Direct kniven mot basen och långsamt börjar skära skalet. Gör på ett motsols vis, stannar precis innan den når upp i mitten. Ta bort saxen och upprepa går i motsatt riktning tills bara en liten bit av ägg sitter kvar. Kontrollera att ägget befruktas. Stäng fönstret.
6. Utgående, åter öppna och tätning ägget.
- Skär om en 2-3 "lång med 1 / 2" bred plasttejp och stänga fönstret så det passar tillbaka in i hålet som klipptes. Ta ytterligare 1 x 1 "bit tejp och försegla hålet från vilken ägget var tömd. Använd en pincett för att öppna ägget göra några manipulationer. När du är redo att återvända äggen till inkubatorn, skära en bit av tejp som är tillräckligt stor för att täta fönster och täcker hela horisontell yta av ägget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod gör det möjligt för långa överlevnadstid efter experimentella manipulationer. Till exempel tillåts dye-märkning studier överlevnad till E10 eller senare i en öde kartläggning (1). Dessutom har den använts i ovo elektroporering studier som ger förändringen av nivåerna genuttryck och krävs utveckling för att gå till senare utvecklingsstadier (2-6). Detta fönstersystem Tekniken kan användas i kombination med ett förfarande som kräver överlevnad efter manipulationer för att embryot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotating incubator | Profi | Maintain at 37° Degrees with relative humidity set above 60% | ||
| 70 % EtOH | ||||
| gauze | ||||
| 3M plastic tape | ||||
| 10cc syringe | 1/egg | |||
| 18G needles | 1½ inch needle, 1/syringe | |||
| Dissection scissors | 4" sharp straight blades | |||
| Fertilized Eggs |
References
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 224, 138-151 (2000).
- Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 269, 26-35 (2004).
- Cramer, K. S., Cerretti, D. P., Siddiqui, S. A. Dev Biol. 295, 76-89 (2006).
- Huffman, K. J., Cramer, K. S. Dev Neurobiol. 67, 1655-1668 (2007).
- Krull, C. E. Dev Dyn. 229, 433-439 (2004).
- Gerlach-Bank, L. M., Cleveland, A. R., Barald, K. F. Dev Dyn. 229, 219-230 (2004).
