נוזל הקשה Lateral: דגם של פגיעה מוחית טראומטית של עכברים

Summary

נוזל הקשה הרוחב (LFP), מודל הוקמה של פגיעה מוחית טראומטית אצל עכברים, הוא הוכיח. LFP ממלא שלושת הקריטריונים העיקריים במודלים של בעלי חיים: התאמה, תוקף, אמינות קליני. ההליך המורכב craniotomy כירורגית, קיבעון של הרכזת ואחריו אינדוקציה של פגיעה, והתוצאה היא פגיעות מוקד ומפוזר, הוא תיאר.

Abstract

פגיעה מוחית טראומטית (TBI) יש תנופה מחודשת במחקר להשיג בשל המודעות הגוברת של פגיעות ראש, אשר התוצאה התחלואה והתמותה. בהתבסס על אופי הפגיעה העיקרית בעקבות התוצאה TBI, השלכות מורכבות משני הטרוגנית, אשר ואחריו ^1,2 תהליכי ההתחדשות. פגיעה ראשונית יכול להיגרם על ידי contusion ישיר המוח מפני משבר בגולגולת או גז ומתיחות של עקירה רקמת המוח ולגרום עקב תנועה ^3,4. המטומות וכתוצאה מכך, ופגיעות לגרום תגובה וסקולרית ^3,5, והנזק מורפולוגית ופונקציונלית של החומר הלבן מוביל מפוזר פציעה axonal ^6-8. שינויים נוספים משני נראית לרוב במוח הן בצקת לחץ תוך גולגולתי מוגבר ^9. לאחר TBI יש שינויים מיקרוסקופיים הביוכימיים והפיזיולוגיים הכרוכים שחרור של נוירוטרנסמיטורים excitotoxic, מתווכים החיסונית רדיקלים ^10-12, אשר בסופו של דבר התוצאה לטווח ארוך לקויות נוירולוגיות ^13,14. לכן בחירת במודלים של בעלי חיים מתאים של TBI כי נוכח האירועים תאית ומולקולרית דומה TBI האדם מכרסם הוא קריטי לחקר המנגנונים פגיעה ותיקון.

דגמים ניסיוניים שונים של TBI פותחו כדי לשחזר היבטים של TBI נצפתה אצל בני אדם, ביניהם שלושה דגמים ספציפיים המותאמים נרחב מכרסמים: כלי הקשה נוזל, השפעת קליפת המוח ושחרר / השפעה משקל האצת ^1. המכשיר הקשה נוזל מייצר פציעה דרך craniectomy ידי החלת הדופק קצר הלחץ על הנוזל על הדורה ללא פגע. הדופק הוא נוצר על ידי מטוטלת בולט בוכנה מאגר של נוזלים. הקשה מייצר תזוזה קצרה דפורמציה של רקמה עצבית ^1,15. לעומת זאת, פגיעה בקליפת המוח השפעה מספקת אנרגיה מכנית על הדורה שלם באמצעות impactor נוקשה תחת לחץ פנאומטי ^16,17. המודל ירידה / השפעה במשקל מתאפיינת נפילת מוט בעל מסה מסוימת על הגולגולת סגורה ^18. בין הדגמים TBI, LFP הוא המודל הוקמה הכי נפוץ להעריך במוח מעורבים פציעה מוקדי מפוזר ^19. זה לשחזור, והוא טופל על מנת לאפשר מניפולציה של פרמטרים פציעה. LFP פציעות משחזר נצפתה בבני אדם, ובכך טיוח זה רלוונטיות קלינית, ומאפשר בדיקה של הרפוי הרומן לתרגום קליניים ^20.

אנו מתארים את פרוטוקול מפורט לביצוע הליך LFP בעכברים. הפגיעה גרמה היא קלה עד בינונית, עם אזורים במוח כמו ההיפוקמפוס, קליפת המוח ואת כפיס המוח להיות פגיעים ביותר. משימות למידה בהיפוקמפוס מנוע נחקרים הבאים LFP.

Protocol

1. Craniectomy

1. אתר כירורגי סטרילי מוכן כולל מכשיר יישור stereotaxic (מכשירים Kopf) לעכברים עם בעל גז העכבר בראש הרדמה (Kopf מכשירים) מחובר למכונת הרדמה עם O ₂ סומק (פארק המדע) על מנת לאפשר שאיפה מתמשכת של isoflurane במהלך הניתוח . כרית חימום שמרו על 37 מעלות צלזיוס ממוקם תחת העכבר במהלך הניתוח. מיקרוסקופ כירורגי מקור האור הוא זקוק. הנסיין צריך ללבוש חלוק מעבדה, מסכת מנתחים, כיסוי רגליים, כפפות, כיסוי ראש. כל הכלים והחומרים קשר באתר כירורגית צריך להיות מעוקר.
2. רכזת פציעה, המורכב סוף הנשי של Luer-Lok, נוצר על ידי חיתוך קצה המתכת של 20 גרם ½ 1 "מחט (בקטון דיקינסון) בסכין גילוח. לרכזת יש לחתוך עם הטיה קלה יש פתח בקוטר של כ 3 מ"מ פנימית. המקדחה (ראה שלב 1.10) ניתן להשתמש כדי למדוד לפברק רכזת פגיעה בקוטר הנכון. רכזת אחת נדרש לכל בעלי החיים. רכזת יצורף הגולגולת ומחובר LFP המכשיר, כדי לספק את הדופק של לחץ.
3. חוט ניילון מוצק (בקוטר 1.7 מ"מ, למשל קו גוזם עשב) הוא חתך לתוך ~ 1 מ"מ עובי הדיסקים באמצעות סכין גילוח. שוב, דיסק אחד נדרש לכל בעלי החיים. זה משמש כדי לייצב את המקדחה בזמן ביצוע craniectomy (ראה שלב 1.10).
4. עכברים יכולים להיות זן ולכל גיל (אנו משתמשים בעיקר C57BL / 6 הגילאים 1-9 חודשים). העכבר הוא שקלו הרדים בתא קטן אינדוקציה (טרום מלאים 4-5% isoflurane ב 100% O ₂₎ במשך דקה לפחות 1. עבור כאבים מקדימה, הזרקה של buprenorphrine (0.1 מ"ג / ק"ג) ניתנת intraperitoneally והעכבר ממוקם בחזרה לתוך החדר עוד דקה. משטר משככי כאבים צריכה להיות מאושרת על ידי התייעצות עם השימוש בבעלי חיים הוועדה המקומית אכפת.
5. השיער בחלק העליון של ראשו של עכבר חיתוך קרוב לעור ככל האפשר. העכבר הוא ממוקם מכשיר יישור stereotaxic מצויד לנשוך מצופה שנועדה לנהל הרדמה גז נדיף (Kopf מכשירים). רמת הגז isoflurane מצטמצם 2% או השפעה. קצב הנשימה היא פיקוח חזותית במהלך הניתוח. פרמטרים פיזיולוגיים נוספים כגון גזים בדם _(p O _{2, p} CO _2), ה-pH בדם או לחץ דם ניתן למדוד באמצעות ציוד מתאים במהלך ההליך.
6. עין דמעות מלאכותיות משחה סיכה הוא לשים על העיניים של העכבר באמצעות מטוש צמר גפן כדי לשמור עליהם מפני התייבשות. Povidone יוד מוחל על העור בין העיניים והצוואר עם המוליך כותנה ואחריו אלכוהול 70%. היישום של יוד povidone ואלכוהול חוזרים עבור סכום כולל של 3 פעמים.
7. חתך בקרקפת קו האמצע הוא עשוי העיניים על הצוואר באמצעות אזמל (# 15 להב) והעור חזר עם מהדק בולדוג קטן (כלים המדע פיין # 18050-28) כדי לחשוף את הגולגולת ומספקים שדה כירורגי ברור. מהדק בולדוג לתלות את הקצוות לרוחב הגולגולת.
8. הרדמה מקומי bupivacaine (0.025% בשנת מלוחים) על הגולגולת עם המוליך כותנה ו fascia שרוטה מהגולגולת עם קצה הכלי שיניים או מגרד העצם (למשל, כלי מדעי בסדר, # 10075-16).
9. סמן קבע משמש כדי לסמן את הגולגולת באמצע הדרך בין גבחת ו למבדה בין תפר sagittal ו לרוחב הרכס מעל באונה הימנית (~ 2 מ"מ ימינה של קו האמצע). ירידה של דבק cyanoacrylate Loctite (Loctite טאק פאק 454) הוא לשים פלסטיק לשקול סירה לצד מלקחיים אחיזה (כלים המדע פיין, דומון # 6) משמשים כדי לטבול דיסק של חוט ניילון עשב מוצק (ראה 1.3 לעיל) לתוך הדבק ולאחר מכן לחץ על הדיסק על סימן בגולגולת. אחת עד שתי טיפות של מאיץ Loctite מועבר על גבי הדיסק בעזרת מזרק 1ml ו -26 08/03 מחט G לגרום התקשות הדבק. בדיקת עמידה של הדיסק לגולגולת לפני שתמשיך.
10. מניחים 3 החיצונית מ"מ קוטר המקדחה (חנות מחקר מכשור, אוניברסיטת פנסילבניה) על הדיסק ספין בכיוון השעון עד שיש לך לחתוך דרך הגולגולת. בדוק את התקדמותו של המקדחה לעתים קרובות, כדי למנוע קידוח רחוק מדי לתוך הגולגולת פריצת הדורה. יהיה דילול של הגולגולת מסביב להיקף הדיסק ואת דש הגולגולת ירגיש משוחרר כשלוחצים עליו קלות. מניחים את הכלי שיניים מקביל / אופקית על פני השטח של הגולגולת לחטט תחת הגולגולת להרים את הכיסוי עד העצם. לנתק את עצם הגולגולת עם מלקחיים. אם יש כמות קטנה של דימום, ללא פשרות של דורה, להשתמש המוליך כותנה להפעיל לחץ עד שהדימום ייפסק ולמנוע אבק עצם להגיע אל דורא. עם זאת, אם יש הפרה של הדורה כזה בקיעה כי הוא גלוי, החיה יש לסלק מן הניסוי על ידי המתת חסד הומנית. צעד זה דורש תרגול מספיקכדי להשיג את מיומנות כירורגית הנדרש.
11. בעזרת מלקחיים, לשמור על הרכזת פגיעה בעמדה מעל craniectomy בגולגולת, כך ההטיה של הרכזת מיושר עם העקמומיות של הגולגולת (כלומר את הקצה יותר של הרכזת נמצאת ליד הרכס לרוחב הגולגולת). בינתיים, באמצעות מקל עץ, חתוך בזווית בסכין גילוח יש קצה חד, להחיל ג'ל דבק סופר סביב בקצוות החיצוניים של הרכזת עם היד הנגדית ולייצב את הרכזת עד שהיא מודבקת זקוף מעל החור. יש להקפיד לא להגיע דבק על גבי הדורה. דבק על הדורה יגרום הנחתה של הפציעה.
12. בעזרת כוס נייר קטנה, לערבב methyl-methacrylate אקריליק שיניים (Liquid Jet אקריליק עם שרף פרם reline / תיקון, שיין באטלר) כדי ליצור פתרון צמיגה. השתמש מזרק 1 סמ"ק עם מחט לא מחובר להחיל בטון מסביב הרכזת פציעה. המלט צריך לכסות את תחתית מ"מ 2 של הרכזת פציעה, כמו גם את הגולגולת חשוף שמסביב. התפרים הגולגולת חתומות עם מלט כדי להבטיח כי בולוס נוזלים מפציעה נשאר בתוך חלל הגולגולת.
13. מלאו את הרכזת עם NaCl 0.9% סטרילי (סליין) באמצעות מזרק מחט קהה. מלוחים ישמור על לחות הדורה במהלך שלב ההחלמה. בנוסף, אם הרכזת פציעה לא נשאר מלא, כי יציין דליפה חיבור הרכזת אל הגולגולת רכזת חדשה צריכה להיות מחוברת. העכבר יש לתת זריקה 0.25 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית IP, הסירו מהמכשיר יישור stereotaxic והושמו בכלוב ריק עם מכסה ללא חוט בר בצלחת ההתחממות. מניחים כמה hydragel בתחתית הכלוב ולאפשר העכברים להתאושש עבור 1-2 שעות.

2. אינדוקציה של פציעה

1. הפעל את האוסילוסקופ (Tektronix TDS 1001B, ערוץ אוסצילוסקופ Digi אחסון 40 MHz, 500Ms.s) ו מגבר (Inducer טראומה לחץ מגבר מתמר) המחובר למכשיר LFP. ודא כי המכשיר LFP (עיצוב ייצור מותאמים אישית, Virginia Commonwealth University) לבין צינורות בלחץ גבוה (אורך 41cm, נפח 2ml, בקסטר # 2C5643) המחוברים אליה מלאים מים סטריליים ללא בועות אוויר. בסוף הצינור הוא פיסת זכר Luer-Lok. עם סיום Luer-Lok של צינורות סגורה, ולספק פולסים בדיקה על ידי שחרור המטוטלת. המכשיר צריך להיות דרוך על ידי מתן כ 10 פולסים הבדיקה. אשר מטוטלת שנותנת אות חלקה על אוסצילוסקופ ואת המגבר. אות רועש מעיד אוויר במערכת כי יש להסיר לפני מתן הדופק פציעה. משך הדופק צריך להיות בערך 20 msec. המגבר מתמר מסופק עם המכשיר LFP הוא מכויל כך 10 mV = 1.0 פאונד לאינץ' מרובע (PSI). אחת האווירה (ATM) = 14.7 PSI. הלחצים פגיעה נמסר בדרך כלל בטווח של 0.9-2.1 אטמוספרות לייצר מגוון רחב של ליישר פעמים רפלקס ואת התמותה הגוברים הקשורים בצקת ריאות. פציעה קלה נחשב זמן ליישר רפלקס מ 2 - 4 דקות ו 0 - שיעור התמותה של 5%. פגיעה מתונה נחשבת רפלקס ליישר זמן של 6 - 10 דקות ו 10 - שיעור התמותה 20%. במידת הצורך, להתאים את הזווית של המטוטלת כדי להגדיל או להקטין את עוצמת הדופק. הזווית של נקודת ההתחלה של המטוטלת הוא כ 10 מעלות. לאחר התאמת המכשיר LFP, הקפידו לפתוח את סוף Luer-Lok של צינורות.
2. העכבר ממוקם תא הרדמה 4-5 isoflurane% (טעון מראש) ועד מטוס כירורגית של הרדמה הוא הגיע. העכבר ממוקם על פלטפורמה ליד המכשיר LFP ואת הרכזת מלא מלוחים סטרילית. צינורות של המכשיר LFP עם זכר Luer-Lok מחובר מתאים Luer-Lok הנשי של הרכזת. חיה ממוקם על צידו פעם דפוס הנשימה קורות חיים נורמליים אבל לפני החיה להכרתו מלא (~ 2 דקות), המטוטלת של המכשיר LFP הוא שוחרר כדי לגרום הדופק יחיד של פציעה. חשוב לא לגרום לפגיעה בעוד החיה מורדמת מדי, מכיוון שזה עלול לגרום לכשל נשימתי ומוות. הלחץ המדויק של הדופק צריך להיות מוקלט. שלם, חיות דמה לעבור את כל אותם הליכים למעט הדופק נוזל בפועל לגרום לפציעה.
3. בעלי חיים יש להסיר מיד מהמכשיר LFP והניח על גבו כדי לפקח על זמן ליישר רפלקס. אחרי העכבר יש התיישרה, ואז הוא הרדים בקצרה שוב הבטון הוסרו רכזת יחד ביד מהגולגולת. הקרקפת סגור אז עם Vetbond דבק רקמות (3M), תפר או סיכות. כל בקיעה של הדורה או חסימה של הרכזת הוא ציין. רכזת occluded יפיק פציעה נחלש גודל ידוע. חיה ממוקם בחזרה בכלוב על כרית חימום עד אמבולטורי ואז חזר הביתה הכלוב שלה.

3. הערכה של המנוע, התוצאות קוגניטיביים היסטולוגית

1. מוטור גירעונות שנגרמו LFP ניתן לקבוע באמצעות בדיקת rotarod, אינדיקטור vestibulomotor משולבת פונקציה הסנסורית ^21. כל בעלי החיים חייבים להיבדק לפני הפציעה כדי לקבוע קריאה המחקר ולאחר להסתגל העכברים כדי הפרדיגמה. עכברים מאומנים על המכשיר rotarod 3 פעמים ביום עם 1 שעות במרווחים intertrial יומיים לפני הפציעה. חביון לאזן על קוטר 36 מ"מ החיצוני, סיבוב מוט, שבו יש משטח גומי נמדד. עליות מהירות 4-40 סל"ד מעל מרווח 180 שניות. כל משפט מסתיים כאשר החיה נופלת rotarod.
2. בנקודות זמן שונות בעקבות פציעה (בדרך כלל 1, 7 ו - 21 ימים), העכברים נבדקו שוב על המכשיר rotarod. הערכת הבדיקות rotarod לאחר פציעה מבוססת על עשרות בודדות יחסית latencies הבסיס שלהם ^22. ההשהיה הממוצע ליפול של עכברים הוא נפגע בהשוואה לזו של עכברים דמה.
3. LFP קוגניטיבי הפונקציה הבאה ניתן לבדוק על סט נפרד של עכברים באמצעות מבוך המים מוריס (עם אמא), מדד רגיש של זיכרון פוסט למידה ועבודה מרחבית במכרסמים ^23. עכברים הם יתרגלו הפרדיגמה ונבדק התגובה הבסיסית באמצעות מבחן פלטפורמה גלוי 4 ימים לפני הפציעה. בריכה עגולה לבנים (1 מ 'קוטר) מלא במים ולא רעיל בצבע לבן. הפלטפורמה היא לנראים באמצעות דגל או סמן ואין רמזים חזותיים הם על הקירות. במשך 4 ניסויים, העכבר ממוקם ברבע השני של פלטפורמת גלוי, ואת חביון למצוא את הפלטפורמה נמדד. זמן מקסימלי למשפט הוא 60 שניות ועכבר נשאר או מושם על הבמה במשך 15 שניות בסוף כל משפט. מרווח intertrial הוא 5 דקות שבמהלכן עכבר חיממו על כרית חימום. הפלטפורמה היא עברה ברבע שונה עבור כל ניסוי וארבעה ניסויים מבוצעים.
4. כדי להעריך את הלמידה, עכברים מאומנים על עם אמא באמצעות פלטפורמה מוסתר קבוע באחד 4 הרביעים בנקודות זמן שונות בעקבות פציעה (בדרך כלל 1, 7 ו - 21 ימים). רמזים שחור ולבן ממוקמים על הקירות. ברבע שבו העכבר ממוקם מגוונת pseudorandomly במהלך האימונים את הזמן כדי לאתר את פלטפורמת מוקלט. זמן מקסימלי למשפט הוא 60 שניות ועכבר נשאר או מושם על הפלטפורמה למשך 15 שניות וחיממה 5 דקות בין הניסויים. עכברים כפופים 8 משפטים / יום במשך 3 ימים רצופים. כדי להעריך שימור הזיכרון, החיות כפופים למשפט 60 שניות בדיקה למחרת האימון האחרון. במהלך המשפט בדיקה, הפלטפורמה היא להסיר כדי לקבוע את משך הזמן ושחה מרחק ברבע שבו פלטפורמת פעם. בסופו של דבר, מבחן פלטפורמה גלוי נעשית כדי לשלול מנוע אפשרי גירעונות חזותיים שהתפתחו לאחר פציעה.
5. כדי לקבוע את ההשלכות של פגיעה היסטולוגית LFP, רקמה נקבע על ידי זלוף intracardial ב 0.9% NaCl ואחריו paraformaldehyde 4% בנקודות הזמן הרצוי לאחר פציעה. רקמה היא postfixed לילה בשעה 4 ° C ו cryoprotected אז ב -10% ו -30% סוכרוז פתרון והטבעה. קטעים סדרתי קפואים נחתכים על cryostat ומעובד באמצעות טכניקות immuohistochemical ו היסטולוגית שונים.

4. נציג תוצאות:

הפגיעה הנגרמת על ידי המכשיר LFP ניתנת לשחזור מן החי מן החי, במיוחד עם הכשרה כירורגית מספיק. כדי לשמור על עקביות של הפגיעה, כמות הלחץ נשא את דורה על ידי המכשיר הוא במעקב. המטוטלת פוגעת מלא מים צילינדר אקרילי עם צינור בלחץ גבוה ו-Lok Luer הולם אשר מחובר לרכזת פציעה מודבקת באתר craniectomy על החיה (איור 1A). עבור פגיעה קלה עד בינונית, הזווית של המטוטלת נקבע כדי ליצור לחץ בטווח 0.9-2.1 atm ו אוסצילוסקופ מחוברים למגבר משמש כדי לחזות את הדופק לחץ (איור 1B). פגיעה מייצרת מגוון של ליישר פעמים רפלקס ואת התמותה הגוברים הקשורים בצקת ריאות. פציעה קלה נחשב זמן ליישר רפלקס מ 2 - 4 דקות ו 0 - שיעור התמותה של 5%. פגיעה מתונה נחשבת רפלקס ליישר זמן של 6 - 10 דקות ו 10 - שיעור התמותה 20%. יתר על כן, העכברים נתון LFP עשוי להפגין פוזה טוניק כי ניתן להצביע על התקף. תפיסה קשורה לעיתים קרובות עם הדורה בסכנה. ביחד, ממצאים אלה מראים כי הפגיעה היא גרימת נזק נוירולוגי. חיות שאם מחוברים למכשיר LFP אבל המטוטלת לא ישוחרר.

כדי להמחיש את הנזק הנגרם על ידי LFP, יש לנו לבצע immunocytochemistry באמצעות נוגדנים אשר מכירים האסטרוציטים ומקרופגים הן אלו סוגי תאים הקשורים בתגובה לפציעה. גליה חלבון Fibrillary חומציים (GFAP) מכתים מגלה דבקת מוגברת לאורך הקורטקס באזור הפציעה WHereas עכברים דמה אינם מציגים astrocytosis מוגברת באתר המקבילה מתחת craniectomy (איור 2 א ', ב). באופן דומה, MAC1 מכתים מדגים מקרופאגים יותר סביב האתר של פציעה לעומת עכברים נתון ניתוח הדמה. בנוסף, יש נזק פיזי לעיתים קרובות רקמת קליפת המוח לעין בעכברים נתון LFP אך לא דמה עכברים (איור 2 ג, ד).

בדיקות ההתנהגות הבאים LFP קלה ניתן להשתמש כדי להעריך את התוצאות הן קוגניטיבית ומוטורית. עם אמא משמש כדי לקבוע השפעות על למידה וזיכרון. באמצעות רמזים חזותיים בחדר בדיקות, עכברים דמה הפך במהירות יעילה יותר באיתור פלטפורמה עם כל יום של אימונים עוקבים במבוך מים. עכברים נתון LFP קלה להימשך זמן רב יותר כדי לאתר את פלטפורמת מוסתר על היומיים הראשונים של בדיקות דמה ביחס לעכברים, אבל אז מופיעים ללמוד את המשימה ביום השלישי (איור 3A). ממצאים אלה מראים כי הפגיעה מפחית את הקצב שבו העכברים יכולים לרכוש למידה מרחבית. כדי לקבוע את ההשפעה של הפגיעה על שימור זיכרון, במשפט מבוצעת בדיקה 1 יום אחרי האימון האחרון. עכברים שאם לבלות יותר זמן ברבע היעד לעומת העכברים נתון LFP קלה טוען כי הפציעה השפיעה על היכולת של העכברים לזכור את המיקום של איפה פלטפורמה המשמשת לישיבה (איור 3B). על מנת להעריך תפקוד של תנועה, עכברים נוסו על המכשיר rotarod. עכברים נתון LFP קלה יש החביון הממוצע קצר יותר ליפול לעומת העכברים דמה 1, 7 ו - 21 ימים שלאחר פציעה (dpi) (איור 3 ג). נתונים אלה מראים כי עכברים פצועים יש לקויי vestibulomotor משולבת פונקציה הסנסורית.

1. איור LFP המכשיר עקבות נציג אוסצילוסקופ המתקבל במהלך הפציעה. א) רכיבים של המכשיר LFP הם: המטוטלת קבוע לעמוד ולהגדיר בזווית קבועה מראש, כדי לספק את הכוח הרצוי, מים מלאים גליל אקרילי עם צינור בלחץ גבוה וכן ראוי זכר Luer-Lok המצורפת, מגבר, ו אוסצילוסקופ. ב) נציג שמץ של דופק לחץ אוסצילוסקופ. ערך שיא ל-השיא הוא 2.16 וולט המעיד על לחץ של atm 1.47.

איור 2. דבקת משופרת תגובה דלקתית LFP הבא מדגים את מידת הפציעה. סעיפים רוחבי קפואים (20μm) דרך המוח של עכבר נתון דמה ניתוח (A, C) או פציעה LFP (B, D) 7 ימים שלאחר פציעה (dpi). תמונות קליפתיים נלקחים במוקד craniectomy. (A, B) רקמה צבעונית עם נוגדן לזהות האסטרוציטים. גליה Fibrillary חומציים (GFAP) חלבון נוגדן (MAB360, Chemicon, 1:400) מגלה מספר גבוה יותר של האסטרוציטים ברחבי קליפת המוח של העכבר נתון פציעה LFP (חיצים) לעומת ניתוח הדמה. נוגדן הוא משני עז אנטי העכבר 594 (1:1000). (ג ד) רקמה צבעונית עם נוגדן לזהות מקרופאגים. MAC1 נוגדן (MAC1 אלפא השרשרת CD11b, BD Biosciences, 01:50) מגלה macrophges יותר ו / או מופעל microglia סביב האתר של פגיעה בקליפת המוח (חיצים) לעומת ניתוח הדמה. נוגדנים משני הוא עכברוש עז אנטי CY3 (01:50). בר סולם = 200μm ב A ו-B, 100μm ב C ו-D

איור 3. בדיקות ההתנהגות הבאים LFP קלה מדגים ליקויים נפצעו לעומת עכברים דמה. א) עכברים נתון LFP קלה להימשך זמן רב יותר ללמוד את המשימה של מציאת פלטפורמה עם אמא מאשר עכברים דמה. שאם לעומת LFP (שד 'שניות ± SEM) 1 יום 34.21 ± 3.02 לעומת 38.64 ± 2.63; 2 ביום 24.52 ± 2.84 לעומת 2.11 ± 27.21, יום 3 22.47 ± 2.00 לעומת 2.52 ± 22.08 (1 dpi, n = 9 דמה, 10 LFP) . ב) עכברים נתון LFP קל להשקיע פחות זמן ברבע היעד במהלך המשפט 24 שעות בדיקה לאחר האימון האחרון ביחס לעכברים עם אמא דמה (21 dpi, n = 10). ג) עכברים נתון LFP קל ליפול המכשיר rotarod מוקדם יותר מאשר עכברים דמה (1, 7, ו - 21 dpi, n = 5 מזויף, 8 LFP). ברים שגיאה מייצגים SE.

Discussion

השיטה המוצגת כאן LFP דגמים רבים של התוצאות neuropathalogical והתנהגותיים של קל עד בינוני פגיעה מוחית טראומטית וזו הסיבה היא הפכה מודל החיה בשימוש נרחב של TBI. ישנם מספר שלבים קריטיים לשקול על מנת להגביר את תקפות ומהימנות של טכניקה זו. לדוגמה, חשוב כי בעלי החיים היחידים שבהם את היושרה של דורה לא נפגע במהלך craniectomy להיות חשוף LFP בשימוש במחקר. יתר על כן, אם הוא craniectomy occluded על ידי דבק או מלט כזה חלק הדורה מתחת craniectomy לא נחשף הכוח של לחץ הנוזלים, החיה יש לסלק מן המחקר. לבסוף, אם הזמן ליישר רפלקס או שיעור התמותה אינו בטווח הרצוי, החיה לא צריך להיות שנכללו במחקר. עוצמת הדופק הלחץ ניתן להגדיל ליצור פציעות חמורות יותר.

כפי שניתן לראות בתרשים 1, את התצורה של המכשיר LFP היא פשוטה יחסית, שחזור של מידת הפגיעה מתוחזק על ידי ניטור אטמוספרות הלחץ על אוסילוסקופ. הצורה חלקה של העקום על עקבות אוסצילוסקופ מציין כי אין בועות אוויר בנוזל שעשוי להפריע אינדוקציה הפגיעה LFP. בדיקת הדופק צריך להיות מועברת לפני גרימת פציעה ואם זכר אוסצילוסקופ אינו התערוכה עקומה חלקה, בועות אוויר להסירו. משך הדופק הוא כ 20 msec המייצגת את זמן הגיוס נמדד סימולציות מבחן ההתרסקות. פציעות של פולסים קצרים יותר עשויים לייצר פציעות מוקד יותר. לכן, זה משך מודלים הדופק האדם TBI.

שינויים מורפולוגיים הסלולר הבא LFP כוללות נזק פיזי לרקמות כמו גם מספר גדל של האסטרוציטים ומקרופגים כפי שמודגם באיור 2. היא מבוססת היטב כי אחד מסימני ההיכר של הפציעה היא היפרפלזיה של האסטרוציטים ויצירת צלקת גליה. הצלקת גליה הוכח יש גם השפעות חיוביות ופוגעות ^24. באופן דומה, מקרופאגים ידועים להצטבר ברקמות שונות במהלך הפציעה לאחר שלב כאשר את תהליך הריפוי מתחיל ^25. לפיכך, מספר גדל של GFAP ו MAC1 תאים חיובי דגימות LFP יחסי שולט דמה מעיד על אינדוקציה של פציעה. חוסר הביטוי של אלה סמנים ספציפיים התא שולט דמה עולה כי המניפולציות כירורגית לבד אין השלכות שליליות על בריאותם של רקמת המוח, וכי שינויים בביטוי חלבונים ספציפיים הפרדיגמה פציעה.

השלכות התנהגותיות של LFP קלה באיור 3 כוללים לבעיות קוגניטיביות ומוטוריות. הממצאים מצביעים על כך עם אמא עכברים LFP בסופו של דבר ללמוד את המשימה, אך בקצב איטי יותר מאשר עכברים מזויף והם לא זוכר את המשימה כמו גם יום אחד אחרי אימון. לכן, גם עכברים נפצעו המעטה הם פחות יעיל מאשר העכברים דמה בבית באמצעות רמזים חיצוניים לתהליך, לאחד ולאחסן מידע מרחבי, אשר חייב להאסף במהלך הבדיקה שלאחר מכן. אחרים בהיפוקמפוס תלויי משימות קוגניטיביות כגון תגובת פחד מותנה הוכחו להיפגע בעכברים נתון LFP ^26. לבסוף, חביון קצר ליפול על ידי עכברים LFP ביחס לעכברים דמה של הפרדיגמה rotarod עד 3 שבועות בעקבות פציעה קלה הוא אינדיקטור של גירעונות vestibulomotor משולבת פונקציה הסנסורית. פגיעה מתונה יותר יחשוף שינויים בולט יותר בתפקוד הקוגניטיבי והמוטורי כפי שהוכח על ידי קבוצות אחרות ^27-30.

לסיכום, LFP היא מודל תקף TBI אדם משום שהוא ממלא את הקריטריונים של רבים מהצפוי. LFP מספק תוקף לבנות בכך שהיא משחזרת את תהליכי האטיולוגית כי לגרום TBI בבני אדם. באופן ספציפי, את עוצמת הכוח ואת שיעור התמותה דומה לזו המתרחשת בספורט מתון מתון פציעות הקשורות מכונית עם אזהרה כי מראש פגיעה התערבויות כירורגיות ייחודיים המודל החי. LFP גם מפגין תוקף פנים כי משחזר LFP רבים אנטומי, השפעות ביוכימיות neuropathological והתנהגותיים שנצפתה TBI האדם. ישנם שני שינויים מוקד ומפוזר זוהה לאחר LFP ואת lateralization ההשפעה מאפשר להשוות את הנזק מורפולוגיים בצד ipsilateral לפגיעה לזה בצד הנגדי. אזהרה אחת היא כי השפעות קוגניטיביות המנוע יכול להיות עדין יותר כתוצאה של פגיעה באונה אחת בלבד. לבסוף, מוצגים LFP תוקף ניבוי ואת האמינות של הטכניקה LFP מאפשר הערכה של מניפולציות גנטיות שונות תרופתי לפני או אחרי הגיוס של פגיעה ^20. משתנים פיסיולוגיים כמו לחץ דם, חומציות דם לדםגזי יהיה צורך למדוד את נוכחות והיעדרות של התרופה מבחן כדי לקבוע את מנגנון הפעולה של הסוכן טיפולית. עם זאת, בשל האופי המורכב של ההשלכות הראשוני והמשני של TBI, היא משימה קשה לזהות התערבות יחיד שיכול להקל על כל הסימפטומים.

שיקול עתיד טכניקה LFP ניתן להשתמש הקשה מיקרו נוזל המעסיקה מעבד מבוקר, מכשיר מונע פניאומטית כדי לבטל את הצורך בכיול הכוח מועברים על ידי המטוטלת ולהימנע משתנים תפעוליים כגון בועות אוויר בנוזל ¹⁵ . עם זאת, הגישה LFP תקן הוכח על ידי חוקרים רבים להיות טכניקה אמין ופשוט לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס נזק והתאוששות הבאים TBI שיוביל התערבויות ותרופות טוב יותר.

Materials

Stereotaxic alignment instrument for mice (Kopf Instruments) Mouse gas anesthesia head holder (Kopf Instruments) Anesthesia machine with O2 flush (Parkland Scientific) Anesthesia machine with O2 flush (Parkland Scientific) Buprenorphrine (Webster Animal Supply) Refresh Lacri Lube eye ointment (Fisher) Bupivacaine/Marcaine (Webster Animal Supply) Povidone-iodine solution (Fisher) 20 g 1 ½” needles (Becton Dickinson) Scalpel blade (#15) and holder (Becton Dickinson) Bulldog clamps (Fine Science Tools) Dental tool or bone scraper (Fine Science Tools) Side grasping forceps Dumont #6 (Fine Science Tools) 3mm outer diameter trephine (Research Instrumentation Shop, University of Pennsylvania) Solid nylon cord (1.7 mm diameter, e.g. weed trimmer line) Super glue gel Loctite cyanoacrylate glue (Loctite 444 Tak Pak) (Henkel Corporation) Jet Acrylic Liquid (Butler Schein) Perm Reline/Repair Resin (Butler Schein) Storage Oscilloscope TDS 1001B, 40 mHz, 500MS/s (Tektronix) Trauma Inducer Pressure Transducer Amplifier (Custom Design and Fabrication, Virginia Commonwealth University) LFP device (Custom Design and Fabrication, Virginia Commonwealth University) High-pressure tubing, length 41cm, volume 2ml (Baxter) 3M Vetbond Tissue Adhesive (Fisher)