Summary
קיים מגוון של גורמי גדילה וחלבונים אינטראקציה לגרום לתאים לקחת על גורלות תאים שונים במהלך ההתפתחות. כאן אנו מדגימים את השימוש כהכנה אובו לכתובת האינטראקציות האפשריות בין חלבונים שונים בהתפתחות ידי הצבת חרוזים על E2.5 עוברי אפרוח.
Abstract
בצינור העצבי מבטא חלבונים רבים בדפוסי spatiotemporal ספציפיים במהלך ההתפתחות. חלבונים אלה הוכחו להיות קריטי לקביעת גורל התא, נדידת תאים, היווצרות של מעגלים עצביים. אינדוקציה דפוסים עצביים לערב המוךפו"גנטי שהולך עצם חלבון (BMP), סוניק הקיפוד (ששש), גורם גדילה פיברובלסטים (FGF), בין היתר. בפרט, את דפוס הביטוי של Fgf8 הוא בסמיכות לאזורים להביע BMP4 ו ששש. דפוס זה עולה בקנה אחד עם הביטוי אינטראקציות התפתחותי המאפשרים דפוסים בתוך telencephalon.
כאן אנו מספקים הדגמה חזותית של שיטה שבה כהכנה אובו ניתן להשתמש כדי לבדוק את ההשפעות של Fgfs במבנה של המוח הקדמי. חרוזים הם מצופים חלבון והושמו הצינור העצבי בפיתוח לספק חשיפה מתמשכת. כי ההליך משתמשת קטן, חרוזים להציב בזהירות, היא פולשנית ומאפשרת כמה חרוזים כדי להיות ממוקם בתוך צינור עצבי יחיד. יתר על כן, השיטה מאפשרת המשך הפיתוח, כך עוברים ניתן לנתח בשלב בוגר יותר לזהות שינויים באנטומיה של דפוסים עצביים. זה פרוטוקול פשוט אבל שימושי מאפשר הדמיה בזמן אמת. הוא מספק אמצעים לערוך שינויים מוגבל במרחב ובזמן לרמות חלבון אנדוגני.
Protocol
1. הסר ביצים מן החממה
ב-E2 2.5 (~ 17 סנט HH), להסיר את הביצים ולהכין אותם בהתאם. הם יכולים להיות עבד או מיד חזר החממה עבור כמה שעות. הביצים ניתן להציב בטמפרטורת החדר בבטחה במשך יותר משעה. ביצים יכולים להישאר בחוץ למשך מניפולציות. לפעמים אלה יכול לקחת שעה או יותר.
הערה: ככל שהם בטמפרטורת החדר, סביר פחות הם לשרוד.
2. הכנת הודו דיו
- הכן פתרון חדש של דיו הודו 4% PBS סטרילית.
- ממלאים מזרק 3 מ"ל עם הפתרון.
- מניחים 27, מחט מד ½ אינץ' על המזרק.
- באמצעות זוג hemostats, לכופף את המחט עד זווית של 90 מעלות.
3. פתיחת ביצים הזרקת דיו הודו
- בעזרת זוג מלקחיים, לקלף את הקלטת אחורה לפתוח את החלון, לקבע אותו באמצעות הצד ההפוך של הסרט בצד האחורי של הביצה.
- מדריך את המחט בזווית עד שהוא נמצא ממש מתחת העובר. הנחת את המחט מתחת לדיסק צף מבטיח את הדיו, שהוא רעיל לעובר, לא יבוא במגע ישיר.
- אתה צריך רק להזריק דיו מספיק כדי ליצור ניגוד נוח. זה בדרך כלל פחות מ ¼ מ"ל.
4. פתיחת בצינור העצבי
- קח זוג מספריים לנתיחה בסדר לחתוך את קרום דק שמונח על גבי, או לפעמים סביב, את העובר.
- קחו זוג 55 מלקחיים או בדיקה טונגסטן, לפתוח את הצינור העצבי מן האחורי כדי הקדמי. ודא פתיחת הוא גדול מספיק כדי למקם חרוז לתוך זה.
הערה: בהתאם לגיל, בדיקה טונגסטן קנס יכול לשמש כדי לעשות את אותו הדבר.
5. אחזור מצופי הפרין, אקריליק חרוז
- בעזרת זוג מלקחיים 55, למצוא חרוז שלם בפתרון. תן חרוז לצרף את עצמו בקצה, לאט לאט לסגור את מלקחיים.
- הסר את חרוז מפתרון ולהביא אותו על גבי הביצה.
- לאחר חרוז הוא מתוך פתרון, הוא לא יבוא ככל הנראה מחוץ עד הושם על אלבומין.
6. הצבת חרוז
- לאחר חרוז הושם על החלק העליון של היעד באזור, השתמש בדיקה טונגסטן כדי להנחות אותו לעבר המוח הקדמי או לתקן את זה למוח האחורי.
- הוסף כמה טיפות של PBS בעזרת פיפטה μL 10.
7. סגירת ביצה
- סגור את הביצה בעזרת חתיכה דקה של הקלטת לסגור את החלון.
- חותם את הביצה על פי פרוטוקול prepping, זמין ב http://jove.com/index/Details.stp?ID=306 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בהתאם החלבון אתה רוצה להשתמש, ישנם פרוטוקולים שונים על איך להכין את החרוזים. בניסויים אלה, אנו משתמשים הפרין, אקריליק חרוזים, אבל Affi ג'ל חרוזים יכול לשמש גם. מצאנו כי הפרין, אקריליק חרוזים קל יותר לתמרן בסביבה מימית של הביצה אלבומין. חרוזים הם ספוגים אני 5 של חלבון לילה בשעה 4 ° C. חרוזים בקרה ממוקמים PBS סטרילי עד ימי השמה. היתרון בשימוש בהכנת אובו היא כי העובר עדיין חי וחופשי לפתח בדרך כלל 1. למרות הסביבה שבה explant נשמר ניתן לשלוט על משתנים מסוימים, העובר לגור מאפשר ייצוג מדויק של משפיע על חלבון על דפוסים התפתחותיים 2-3. כל מבחני שבאפשרותך לבצע על explant, אתה יכול עם העובר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Fertilized, E2-2.5 (~ St. 17 HH) | ||
| Incubator | Profi-I | Lyon | ||
| India Ink | Tool | Higgins | Prepare a 4% solution in sterile PBS. | |
| Sterile PBS | Alternatively, an antibody cocktail can be used | |||
| 1ml syringe | ||||
| 27G 1/2 needles | Tool | BD Biosciences | 305109 | Angled at 90 degrees |
| Forceps | Tool | World Precision Instruments, Inc. | size 55 | |
| Hemostats | ||||
| Dissection scissors | Tool | World Precision Instruments, Inc. | 500086 | vannas, 8.5cm |
| Parafilm tape | to seal eggs | |||
| Tungsten Probe | Tool | Electron Microscopy Sciences | 62091 | Tool #24. Handle optional. |
References
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies. Jounal of Visualized Experiments. 8, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306 (2007).
- Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles. Neuroscience. 108, 183-206 (2001).
- Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity. Development . 133, 2905-2913 (2006).
