Summary
En
Abstract
Att analysera axonal och dendritiska morfologi av nervceller, är det viktigt att få en korrekt märkning av neuronala strukturer. Förbereda väl märkta prover med liten eller ingen vävnadsskada ger oss möjlighet att analysera cellmorfologin och jämföra enskilda prover med varandra, därav det möjligt att identifiera mutant anomalier.
I den visade dissekeringsmetoden nervsystemet är mest inne i vuxen flyga. Genom en dorsal snitt, är buken och bröstkorgen öppnas och de flesta av de inre organen tas bort. Endast ryggsidan av den ventrala nerv sladd (VNC) och livmoderhalscancer bindväv (CVC) som innehåller den stora axoner i den gigantiska fibrer (GF) 1 är utsatta, medan hjärnan som innehåller GF cellkroppen och dendriter återstår 2 i den intakta huvudet . I denna beredning flesta nerver av VNC bör sitta kvar sina muskler.
Efter dissektion, är den intracellulära fyllning av jätten fiber (GF) med en fluorescerande färg påvisas. I CVC GF axoner finns vid rygg-ytan och därmed lätt kan visualiseras i mikroskop med differential interferens kontrast (DIC) optik. Detta gör att injektionen av GF axoner med färg på denna webbplats för att märka hela GF inklusive axoner och deras terminaler i VNC. Metoden ger pålitlig och stark färgning av GF låta nervceller som ska avbildas direkt efter påfyllning av en epifluorescent mikroskop. Alternativt kan fluorescerande signalen förstärkas med hjälp av vanliga immunhistokemi procedurer 3 lämpar sig för hög upplösning konfokalmikroskopi.
Protocol
1. Dissekering av den ventrala nerv sladden
Dissektion och färg fyllning av GF kan utföras vid rumstemperatur. För alla dissektion steg kyla (4 ° C) koksaltlösning bör användas för att bromsa cellernas ämnesomsättning och hålla nervceller vid liv längre.
- Bedöva vuxna flugor (4 dagar eller äldre) med CO 2 eller kyla dem på is tills de är orörlig. Anesthetizing med is kommer att kräva mer tid (upp till 30 min) men kommer att hålla flugorna orörlig under längre tid.
- Placera en fluga i en Sylgard belagd petriskål. Denna dissektion kräver användning av en hög förstoring (80-100x) dissektion stereomikroskop.
- Med Vannas sax, ta bort ben, snabel, och vingar.
- Använd grovt pincett och fin insekt stift (minutien stift) för att orientera flyga ryggsidan upp i Sylgard skålen. Pin buken först och sedan förlänga djuret lätt genom att placera två pinnar på vardera sidan av halsen, bakom huvudet så att nacken lätt sträcks och tillgänglig (se figur 2).
- Sänk ner flyger i rent, kallt Drosophila koksaltlösning. Vanligaste Drosophila Salines är tillräckliga för dissekering, men här använde vi en saltlösning som beskrivs i Gu och O'Dowd, 2006 4. En luftbubbla kommer att omge flyga. Ta bort luften med en spruta.
- Gör ett kort, lateralt snitt i rygg slutet av buken. Börjar på snittet, göra ett grunt, rakt snitt längs ryggens mittlinje buken mot bröstkorgen. Sedan fortsätter de grunda, längsgående snitt i bröstkorgen så exakt som möjligt längs mittlinjen mot bindväv. Det är viktigt att göra nedskärningar grunt för att inte skada VNC (Figur 1).
- Använd två fina insekt stift att försiktigt öppna bröstkorgen. Sprid kroppen halvorna från varandra med hjälp av stiften och placera stiften genom flygmuskler (Figur 2). Bröstkorgen bör inte öppnas ytterligare som visas i figur 2 för att undvika rippning av nagelbanden. För att säkerställa en rak orientering VNC stiften ska placeras i samma främre bakre position på varje sida.
- Tillgång till VNC för färgerier injektion och korrekt avbildning kan hindras av inre organ. Därför använder pincett och sax för att ta bort mage, tarm, hjärta och reproduktionsorgan. Dra ut spottkörtlarna som ligger på båda sidor av VNC. Skölj dissektion noga med färska koksaltlösning för att ta bort flytande vävnad och fett.
- Ta bort kroppsfett från undersidan av livmoderhalscancer bindväv (CVC). Fettet kroppen är bäst synlig på en hög förstoring. Använd fin pincett för att försiktigt ta tag i vävnad från sidan och dra ut den.
Den dissektion kan utföras inom 5 till 10 minuter. Genom att använda färsk, kall saltlösning den dissekeras, oskadat nervsystem kommer att förbli vid liv i minst en timme.
2. Intracellulär GF fylla
Det rekommenderas att färgen fyller så snart som möjligt efter dissekering.
- Placera Sylgard skålen med dissekerade flyga under en upprätt mikroskop med en fast fas (Figur 3) och en 10x luften mål. Center provet med den bakre änden av flugan placeras mot färgämnet fylla elektrodhållare. Använd differential interferens kontrast (DIC) läget och fokusera på CVC. Den stora axoner av GF bör tydligt synliga på rygg ytan av CVC.
- Späd Lucifer Gul CH dilithium salt i avjoniserat H2O till en koncentration av 1%. Dra ett borosilikatglas elektrod med glödlampa till en resistans på ca. 60-80 Mohm. Spetsen på glaselektrod bör vara långa och vassa. Fyll spetsen på elektroden med 1% Lucifer Gul lösning genom att placera elektroden med slutet motsatta elektroden spetsen i Lucifer Gul lösning för ca. 30-60 sekunder. Sedan återfyllning elektroden med 3M LiCl med hjälp av en Hamilton spruta lämnar en luftbubbla mellan färgämnet och LiCl. Anslut färgen fyller elektroden till huvudet scenen.
- Sätt in en klorid belagd silverelektroden tråd marken i saltlösning och placera färgen fyller elektroden ovanför flyga parallellt med VNC med hjälp av en 3D-hydraulisk mikromanipulator. Färgen fyller elektroden bör anslutas till en förstärkare som tillåter passerande strömmen i syfte att frigöra negativt eller positivt laddade färgämnen från elektroden genom att skicka hyper-eller depolariserande ström, respektive.
- Växla till en 40x nedsänkning i vatten linsen och nedre spetsen på färgen fyller elektroden på en av GF. GF axoner låg nära den dorsala ytan av CVC. Använd en framåt (mot huvudet) rörelsen att föra in elektroden i GF.
- Ändra din ljuskälla till epifluorescent ljus och byta till en Lucifer Gula filter. Applicera en hyperpolarizing ström till färgen fylla elektrod med förstärkaren att injicera Lucifer Gula i GF. Mängden färgämne som injiceras kan styras av The mycket ström skickas samt hur länge strömmen är förbi. För att förhindra att färgen rinner ut från injektionsstället eller skada GF, rekommenderas att injicera med en låg ström (ca 3-5 NA) under 1-5 minuter.
- Applicera ström tills GF terminalen i VNC kan ses tydligt (Figur 4A). För trans-synaptisk färgning av postsynaptiska neuron, fortsätter att passera aktuell på tills färgen kan också ses i postsynaptiska neuroner. Stäng av nuvarande och tar bort färgämnet fylla elektroden.
3. Representativa resultat:
En representant färgämne fylla för en GF med Lucifer Gul visas i figur 4A. Bilden förvärvades som en bild stack i Nikon Elements med hjälp av en fläck kamera monterad på mikroskop. I det här exemplet strömmen var passerat genom elektroden i ca 2 minuter. GF är ordentligt fylld och den stora GF terminalen i bröstkorgen är väl märkta (Figur 4A, ellips). Inga postsynaptiska neuroner är synliga i det här fallet, men Lucifer Gult är små nog att passera genom gap-junctions. Om färgen inte injiceras tillräckligt långt in i GF då trans-synaptisk fyller den postsynaptiska neuron får inte setts på grund av att signalen är för svag för att upptäckas. Nervceller postsynaptiska till GF (Figur 4B, pilar) kan visualiseras mer tillförlitligt med hjälp av ännu mindre neuronala spårämnen, såsom Neurobiotin. Injektion en 7% Neurobiotin i 2 M kaliumacetat lösning med en depolariserande ström i 2 minuter är tillräckligt för att märka postsynaptiska neuroner starkt. Neurobiotin kan visualiseras för konfokalmikroskopi använda Streptavidin kopplade till färger i olika våglängder. Eftersom Neurobiotin är inte en fluorescerande färg,, co-injektion av Rhodamin-dextran eller Alexa Hydrazider i samma lösning kan användas för att övervaka en lyckad injektion i GF (Figur 4C, från Boerner och Godenschwege, 2010 5).
Figur 1. Schematisk bild av en fluga visade sidled. Bröstkorgen visas med ett längsgående snitt för att visualisera inre strukturer. Under dissektionen var rygg längsgående flygmuskler (DLMS, blå) skär utan att skada den ventrala nerven sladden (VNC, djupröd), som ligger ventrala att flygningen musklerna. Tarmen (grön) ligger ovanför VNC.
Figur 2. Ryggfenan syn på en dissekeras fluga. Två stift är placerade bakom huvudet för att placera flyga. Stiften fästs genom flygmuskler (DLM) håll bröstkorgen öppnas. Inre organ togs bort för att avslöja den ventrala nerv sladd (VNC).
Figur 3. Dye fylla setup.
Figur 4. A) Z-projektion av den bakre delen av VNC visar en GF fylld med Lucifer Gul. Bilden förvärvades omedelbart efter färg påfyllning av en plats kamera. I vildtyp djur terminalen (ellips) i bröstkorgen syns tydligt. B) Confocal bilden av en GF färgämne fylla med Neurobiotin i en vildtyp fluga. Båda GFS (pilar) och nervceller postsynaptiska till GF (pilar) är märkta. Neurobiotin var visualiseras med Streptavidin kopplad till Cy3. C) Confocal bild av vild-typ GF fylld med Alexa555.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nervsystemet kan dissekeras utan att ta bort det från flugan kroppen. Detta har två fördelar, först orsakar dissektion små skador på nervsystemet, och för det andra, de flesta nerverna vara kopplad till muskler och sinnesorgan. Utföra dissekering, enligt beskrivningen, förbereder provet för rakt fram dye-märkning av GF. Bekvämt, de motoneurons postsynaptiska till GF förbli anslutna till musklerna. Axoner, därför är oskadade, hålla nervceller vid liv längre. Dessutom är skador på nervsystemet kommer att störa funktionen gap junction och därmed sannolikt kommer att påverka effekten av trans-synaptisk fyllningar.
Lucifer Gul, Rhodamine dextran, och Alexa Fluor hydrazid natriumsalt (Invitrogen) kan användas för omedelbar visualisering av GF morfologi under ett fluorescerande mikroskop, men signalförstärkning med sekundära fluorescerande antikroppar rekommenderas för högupplösande avbildning med en konfokalmikroskop 5. Både Lucifer Gul samt Neurobiotin märka postsynaptiska cellerna via trans-synaptisk fyllningar med Neurobiotin är mycket mer pålitlig. Det är dock Neurobiotin icke fluorescerande och kräver immunohistokemi efter injektion samt co-insprutning av nästa fluorescerande färg för att övervaka en lyckad injektion.
Denna teknik har använts rutinmässigt för att jämföra morfologi av GF terminaler mellan individer av samma genotyp eller mellan individer av olika genotyper 5,6,7,8. Dessutom kan morfologi av det synaptiska terminalen också korreleras med sin funktion av att få elektrofysiologiska inspelningar från kretsen innan dissektion av standardrutiner 9,10.
Slutligen skulle även våra visat dissekeringsmetod endast exponerad VNC för dye-injektion och avbildning av GF terminalen, ett efter dissektion av hjärnan från huvudet kapsel efter färg injektion möjliggör avbildning av GF soma och dendriter i hjärnan samt .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Projektet beskrivs stöddes av licensnummer R01HD050725 från National Institute of Child Health and Human Development för att märka innehållet är uteslutande ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institute of Child Health och Human Development eller National Institutes of Health. Vi tackar medlemmar Godenschwege labbet samt Barbara Schreader för deras bidrag till manuskriptet och video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| Dissection Microscope | AmScope | SM-2TZ | |
| Vannas Scissors Superfine | Academic Instruments | VS1023 | |
| Dumont Forceps Dumontstar 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm |
| Borosilicate Glass Electrodes | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| Vertical Pipette Puller 700c | David Kopf Instruments | Model 700C | |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | 1% in H2O |
| Fixed Stage Upright Microscope & Camera | Nikon Instruments | FN-1 & DS-U2 Camera | |
| Plan Fluor 10X Air Objective | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 10X NA 0.3 WD 16mm | |
| Fluor 40X water dipping Objective | Nikon Instruments | CFI Fluor 40X W NA 0.80 WD 2.0mm | |
| 3D hydraulic Micromanipulator | Narishige International | Model MW0-3 | |
| Amplifier | Getting Instruments, Inc. | Model 5A |
References
- Power, M. E. The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 88, 347-409 (1948).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, T. A., Phelan, P. Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
- Boerner, J., Duch, C. Average shape standard atlas for the adult Drosophila ventral nerve cord. J. Comp. Neurol. 518, 2437-2455 (2010).
- Gu, H., O'Dowd, D. K. Cholinergic synaptic transmission in adult Drosophila Kenyon cells in sity. J. Neurosci. 26, 265-272 (2006).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Application for the Drosophila ventral nerve cord standard in neuronal circuit reconstruction and in-depth analysis of mutant morphology. J. Neurogent. 24, 158-1567 (2010).
- Godenschwege, T. A., Kristiansen, L. V., Uthaman, S. B., Hortsch, M., Murphey, R. K. A conderved role for Drosophila Neuroglian and human L1-CAM in central-synapse formation. Curr. Biol. 16, 12-23 (2006).
- Uthaman, S. B., Godenschwege, T. A., Murphey, R. K. A mechanism distinct from highwire for the Drosophila ubiquitin conjugase bendless in synaptic growth and maturation. J. Neurosci. 28, 8615-8623 (2008).
- Storkebaum, E. Dominant mutations in the tyrosyl-tRNA synthetase gene recapitulate in Drosophila features of human Charcot-Marie-Tooth neuropathy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 11782-11787 (2009).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A. Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFS). Cold Spring Harb. Protoc. 2010, pdb.prot5453-pdb.prot5453 (2010).
- Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster. J. Vis. Exp. , (2011).
