Summary
اختبار الحساسية للمضادات الميكروبات من المتفطرة السل يشكل تحديا لكنها حاسمة لرعاية المرضى. هذا الشكل لوحة microtiter يقدم اختبار مضاد المتفطرات 12 المخدرات ويوفر الحد الأدنى من تركيز المثبطة (MIC) القيم ، والتي سوف تساعد في العلاج المناسب.
Abstract
الكشف السريع عن مقاومة الجراثيم للأدوية مهم في الجهود الرامية إلى السيطرة على زيادة انتشار السل المقاوم للالمتفطرة (MTB). وقد جرت العادة على إجراء اختبارات الحساسية للمضادات الميكروبات (AST) من MTB يؤديها أغار الطريقة من نسبة أو عن طريق اختبار macrobroth على صك مثل BACTEC (بيكتون ديكنسون ، سباركس ، MD) ، VersaTREK (TREK تشخيص ، كليفلاند ، أوهايو) أو جرثومة / ALERT (bioMérieux ، Hazelwood ، MO). الأسلوب نسبة آغار ، في حين تعتبر "الذهب" معيار AST ، هو العمل المكثف ويتطلب حساب المقاومة عن طريق إجراء تعداد المستعمرة المحتوية على أجار المخدرات بالمقارنة مع أجار خالية من المخدرات. إذا كان هناك نمو ≥ 1 ٪ على المدى المتوسط التي تحتوي على المخدرات بالمقارنة مع المتوسط خال من المخدرات ، ويعتبر الكائن مقاومة لهذا الدواء. أساليب القياس وmacrobroth تتطلب اختبار نقطة فاصل ("حرجة") تركيزات المخدرات للأدوية الخط الأول (أيزونيازيد ، الإيثامبوتول ، ريفامبين ، وبيرازيناميد). وصف الأسلوب هنا هو متاح تجاريا في 96 لوحة تنسيق جيد microtiter [MYCOTB (TREK تشخيص)] ، ويحتوي على تركيزات متزايدة من 12 مضادات الميكروبات المستخدمة لعلاج السل بما في ذلك على حد سواء الأولى (أيزونيازيد ، ريفامبين ، الإيثامبوتول) وأدوية الخط الثاني (الأميكاسين ، سيكلوسيرين ، إيثيوناميد ، الكانامايسين ، موكسيفلوكساسين ، أوفلوكساسين ، شبه أمينوساليسيليك حامض ، rifabutin ، والستربتوميسين). بيرازيناميد ، لا يتم تضمين دواء السطر الأول ، في لوحة microtiter نظرا لحاجتها لظروف اختبار الحمضية. مزايا النظام microtiter تشمل كلا من سهولة انشاء وأسرع بدوره حول الوقت (14 يوما) مقارنة مع نسبة آغار التقليدية (21 يوما). بالإضافة ، يمكن تعيين ما يصل من لوحة قيحة أعدت باستخدام مرق أو متوسطة الصلبة. منذ شكل لوحة microtiter هو جديد ومنذ MTB تحديات سلامة فريدة من نوعها في المختبرات ، وهذا البروتوكول سوف تصف كيفية الإعداد بأمان ، واحتضان وقراءة لوحة microtiter.
Protocol
كل مختبر يحتاج إلى إجراء تقييم المخاطر بالتعاون مع هذه المؤسسات مسؤول السلامة البيولوجية لتحديد مستوى السلامة الحيوية المناسبة لإعداد اللقاح وpipetting من اللقاح في لوحة. في المختبر لدينا ، ونحن الاستفادة من مستوى السلامة الحيوية 3 مختبرات (BSL3) الممارسات حتى يتم تلقيح لوحات microtiter ، ومختومة بختم لاصق من البلاستيك. ثم توضع هذه اللوحات داخل كيس من البلاستيك ، والذي هو ايضا للحرارة مختومة. ويجري الحضانة وتفسير قراءة لوحة microtiter في السلامة الحيوية في المختبرات من المستوى 2 (BSL2).
1. وضع العلامات للمواد
- التسمية آغار الدم لوحة ، وثلاث لوحات Middlebrook 7H10 ، Middlebrook 7H9 مرق ، والمالحة توين أنبوب الزجاج وحبة لوحة AST microtiter مع التعريف المناسب (على سبيل المثال ، اسم المريض ورقم السجل الطبي) في BSL2.
- تسمية آغار الدم و7H10 مطلي ب "التحقق من نقاء". ويوصى بحساب مستعمرة الدوري لقيحة لضمان أن يتم استخدام التركيز المناسب من الكائنات الحية في الاختبار. وسوف يقوم بحساب مستعمرة عند الحاجة إلى وجود اثنين من لوحات 7H10 المسمى ب "العد 01/01 مستعمرة" و "العد 1 / 50 مستعمرة".
2. التحضير التقني للذهاب الى BSL3
- المعدات الوقائية الشخصية الملائمة واللازمة للعمل في BSL3 وتضم الجبهة ثوب الصلبة ، وتغطية الرأس ، والقفازات ، ويغطي الحذاء ، وجهاز تنفس. وينبغي على كل مؤسسة وضع خطة حماية الجهاز التنفسي الخاصة بالتعاون مع موظف في مؤسستهم النظافة الصناعية. في المختبر ، لدينا العديد من أجهزة التنفس الصناعي المتاحة ، بما في ذلك أجهزة التنفس بالطاقة تنقية الهواء (PAPRs) ومزودة - HEPA تصفيتها ، N95 نصف كمامات الوجه.
3. التحضير لمجلس الوزراء السلامة البيولوجية
- في BSL3 ، وإعداد مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (BSC) من تطهير المياه السطحية ووضع منشفة ورقية غارقة مع حوالي 6 بوصات مطهر من الجو لوحة تنفيس.
- وضع حاوية النفايات على اليسار ، وnephlometer الصغيرة وvortexer على اليمين.
- توضع حلقات بتلقيح ، ونصائح pipetors بجانب منشفة ورقية.
- مكان الرف مع الكائن (في المرق أو المتوسطة الصلبة) و0.5 مكفارلاند القياسية على منشفة ورقية.
4. معايرة nephelometer
- وضع أنبوب زجاجي توين حبة المالحة في nephelometer وتعيين إلى الصفر باستخدام أداة فارغة توين المالحة.
- ضع 0.5 مكفارلاند القياسية في nephelometer ومعايرة حسب تعليمات الشركة المصنعة.
5. التحضير لقيحة
- يعملون في المستعمرات كشط BSC ، من متوسطة الصلبة باستخدام حلقة عقيمة في الأنبوب المسمى مناسب توين المالحة حبة الزجاج حتى يتم الحصول على ≥ 0.5 مكفارلاند قياسي.
- تفقد البصر العينة ، وقارن بين لمعيار مكفارلاند.
- نموذج الدوامة ل 30-60 ثانية.
- السماح لقيحة لتسوية لمدة 15 دقيقة (تعيين الموقت).
6. تلقيح لوحة microtiter
- ضبط قيحة مع مرق توين المالحة باستخدام nephelometer معايرة مكفارلاند إلى 0.5 في خطوات 4.1 و 4.2. ويجب الانتهاء من هذا في غضون 30 دقيقة (مواصفات المصنع الواحد).
- استخدام pipetter 200 ميكرولتر وLONG غيض الهباء الجوي الماصة المقاومة لإزالة 100 ميكرولتر من اللقاح من الثالثة 03/01 أعلى الأنبوب المالحة توين حبة. تحصين مرق 7H9 Middlebrook. دوامة ببطء مرق 7H9 تلقيح لمدة 20 ثانية.
- إزالة لوحة microtiter AST حزمة من الشركة المصنعة. لا تستخدم إذا كان لالمجففة باللون الأزرق أو في حالة تلف الحزمة احباط.
- يعد أنبوب تخفيف 01:50 لاستخدامها لاحقا في التحضير للتخفيف 01:50 بواسطة pipetting 50 ميكرولتر من الماء المعقم في أنبوب العقيمة.
- صب بعناية قيحة مرق 7H9 الى الحضيض. تجنب توليد الهباء.
- مكان لوحة microtiter AST مع التسمية باتجاهك.
- استخدام pipetter 12 قناة لإضافة 100 ميكرولتر من اللقاح على كل جانب.
- تحضير التخفيفات للمستعمرة التهم :
- مستعدة التخفيف 01/01 من سيطرة إيجابية جيدا (H12) من الحلقة 1 streaking ميكرولتر على لوحة 7H10 المسمى "1 / 1".
- مستعدة التخفيف 1 / 50 ، فحقن حلقة 1 ميكرولتر من سيطرة إيجابية جيدا (H12) ويحوم عليه في أنبوب مع 50 ميكرولتر من أنبوب المياه أعدت أعلاه. خط 1 ميكرولتر من هذا التخفيف إلى لوحة المسمى "1 / 50".
- تطعيم لوحات النقاء من حوض بواسطة pipetting 50 ميكرولتر an آغار الدم على نحو ملائم وصفت لوحة 7H10 ومتتالية للعزلة.
- مكانختم لاصقة على لوحة microtiter AST. اضغط بقوة على كل بئر كافية لضمان ختم باستخدام الظهر الأبيض من الختم. تجنب التجاعيد.
- تطهير لوحة microtiter بواسطة مسحه بمنشفة مبللة ورقة مع مطهر مبيد للعصيات السلية ومكان لوحة microtiter في كيس من البلاستيك وختم وثيقة مع الحرارة أو الشريط.
- الكيس البلاستيكي بمثابة حاوية الثانوية لضمان أن يرد كل المرق يجب أن يكون هناك تسرب أو انسكاب من لوحة الأولية.
7. تطهير المواد والسلامة البيولوجية لمجلس الوزراء
- لتجنب إنتاج الهباء ، ومكان آخر على أدنى مستوى أعلى من أدنى مستوى تحصين قبل وضعه في وعاء بلطف تجاهل.
- تطهير جميع المواد بما في ذلك nephlometer ، vortexer ، وألواح وأنابيب وغيرها من خلال المسح بمطهر مبيد للعصيات السلية وانتظر الوقت المناسب لضمان التعقيم وفقا لتعليمات الشركة الصانعة قبل إزالة من ش. على سبيل المثال ، Prospray ، ومطهر مبيد للعصيات السلية التي نستخدمها ، ويتطلب 15 دقيقة لقتل متفطرات.
- مكان الحاوية تجاهل في حقيبة واقية وختم قبل التعقيم.
8. حضانة
- وينبغي لوحات المحتضنة مع وسائل الإعلام باستمرار ، وينبغي الحرص على تجنب إراقة أو أي سائل الرش.
- احتضان لوحة microtiter AST اللوحة ، ولوحات 7H10 آغار الدم في الحاضنة 35-37 درجة مئوية مع 5-10 ٪ أكسيد الكربون CO 2 مع 5-10 ٪ 2 في المختبر BSL2.
- في المختبر لدينا ، وهذا أمر مقبول لأن لوحة جيدا مختومة ومختومة داخل حقيبة بلاستيكية.
- وينبغي أن تكون مكدسة لا يزيد عن 2 microtiter وحات AST في الحاضنة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
9. ممثل النتائج
تفسير النتائج :يمكن قراءة لوحات مختومة AST microtiter يدويا باستخدام مرآة كمساعدة أو مع قارئ لوحة الآلي مثل Vizion (TREK تشخيص). يمكن فحص لوحات أقرب وقت بعد 7 أيام من التلقيح. فحص الآبار سيطرة على النمو في المناصب H11 و H12 لتحديد ما إذا كانت إيجابية (أي ، لديها ودائع من الخلايا في أسفل البئر). إذا آبار مراقبة النمو ليست إيجابية ، reincubate لوحة وإعادة النظر بشكل دوري (على سبيل المثال ، يوم 10 ، 14 يوما) حتى آبار مراقبة نمو إيجابية.
- مرآة نصها كما يلي :
- مختومة مكان AST microtiter وحة على المنبر ؛
- قراءة آبار مراقبة النمو بعد 7 أيام من الحضانة ، وإذا كان هذا هو ، reincubate السلبية لوحة microtiter AST ؛
- إذا كانت الضوابط نمو مقبولة ، ثم قراءة الآبار التي تحتوي على المخدرات. عن كل دواء ، سجل التخفيف الأولى التي لا يوجد لديه النمو مقارنة مع الآبار المخدرات سيطرة على النمو.
- النمو كما يبدو أو كما التعكر وديعة من الخلايا في أسفل البئر.
- صك القراءة : اتبع تعليمات المصنعين ، والتعليمات الواردة أدناه هي مثال على الكيفية التي سيتم الانتهاء من القراءة مع منصة Vizion :
- تسجيل الدخول.
- استخدام "MYCOTB" لوحة AST البرمجيات.
- مكان لوحة مختومة مع الباركود التي تواجه المستخدم. النمو كما يبدو أو كما التعكر وديعة من الخلايا في أسفل البئر.
- قراءة ضوابط النمو ، وإذا كان هذا هو ، reincubate السلبية لوحة microtiter AST ، وإذا قرأ لوحة إيجابية عن طريق لمس الشاشة مع البئر الأول من كل العقاقير التي لا تظهر النمو.
قراءة لوحات النقاء. وينبغي لوحة آغار الدم لا تظهر أي نمو بعد 48 ساعة ، والنقاء لوحة 7H10 ينبغي أن يكون النمو متموجة من نوع كائن واحد. إذا كانت ملوثة ، واختبار microtiter AST يحتاج إلى تكرار من ثقافة نقية.
حساب التهم مستعمرة من التحكم به بشكل جيد إيجابية في الجدول أدناه :
مستعمرة الكونت مفتاح
| عد المستعمرات # على لوحة كتب عليها "01/01" | عد المستعمرات # على لوحة المسمى "1 / 50" | قيحة الكونت مستعمرة (كفو / مل) |
| <50 | 0 | <5 X 10 4 |
| 5-10 | 0-2 | 5 X 04 حتي 01 أكتوبر X 10 5 |
| > 100 | ≤ 10 | 1 X 05 حتي 05 أكتوبر X 10 5 |
| > 100 | > 10 | > 5 X 10 5 |
قد يكون هناك شبه زائدة مع أمينوساليسيليك حامض في بعض سلالات المتفطرة tuberculoSIS. ويمكن تفسير هذا من خلال النظر في جميع الآبار التي الكريات واستخدام أول بئر يحتوي على نفس حجم بيليه والتخفيف المقبل ، حيث نقطة نهاية. المقاومة هي نادرة مع هذا الدواء.
الشكل 1. النتائج ممثل باستخدام لوحة MYCOTB.
| اختصار المخدرات | دواء | μ MIC / مل |
| OFL | أوفلوكساسين | 16 |
| MXF | موكسيفلوكساسين | 8 |
| RIF | ريفامبين | > 16 |
| AMI | الأميكاسين | 0.5 |
| STR | الستربتومايسين عقار طبي | 16 |
| RFB | rifabutin | 8 |
| PAS | ف أمينوساليسيليك حمض | ≤ 0.5 |
| ETH | إيثيوناميد | 5 |
| مراكز الشباب الإصلاحية | سيكلوسيرين | 4 |
| INH | إيزونيازيد | 2 |
| KAN | الكاناميسين | 1.2 |
| الإدارة الانتخابية | إيثامبوتول | 4.0 |
Discussion
ويرد مثال لوحة microtiter AST الذي يتحكم نمو إيجابية في الشكل 1 ، وحلقت فوق نقطة النهاية MIC (ميكروغرام / مل) عن كل دواء. وأشارت دراسة أجريت في المختبر لدينا أن لوحة microtiter AST الأسلوب هو ما يعادل الذهب القياسية آغار طريقة لاختبار نسبة التعرض لمرض السل المتفطرة. وتم الحصول على نتائج أسرع التقارير مع لوحة microtiter microtiter AST بالمقارنة مع نسبة أغار الطريقة التقليدية مع التفسير النهائي للوحة microtiter AST وأغار على طريقة نسبة 14 و 21 يوما ، لوحة respectively.The microtiter AST في الاستفادة من التجارب الأولى و عقاقير الخط الثاني في وقت واحد والتي يمكن أن تساعد على منع التأخير المفرط مع السلالات المقاومة للعقاقير. لوحة microtiter AST هو أيضا أسهل بكثير لإعداد وقراءة من الألغام المضادة للأفراد ، ويمكن استخدامها على حد سواء مرآة اليدوي ونظام شبه الآلي مثل VIZION لقراءة لوحات. قد توفر قيمة MIC لاختبار السل مقاومة تقديم معلومات جديدة وقيمة للأطباء النسبي لقيمة تركيز الحرجة التقليدية ، وخصوصا بالنسبة لأولئك مع حساسية العزلات "الشريط الحدودي".
Disclosures
لا يوجد شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
نود أن نشكر التكنولوجيين مختبر لمختبر عيادة مايو كلينيك Mycobacteriology لما قدموه من مساعدة أثناء الدراسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AST microtiter plates and adhesive seal | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | MYCOTB | |
| McFarland 0.5 standard | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | E1041 | |
| Middlebrook 7H10 plates | Fisher Scientific | ||
| Blood Agar Plates | Fisher Scientific | ||
| Sterile loops 1 μL | Fisher Scientific | ||
| Sterile loops 10 μL | Fisher Scientific | ||
| Sensititre Saline-Tween glass bead broth | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | 27143 | |
| 7H9 OADC Broth | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | T3440 | |
| Long Pipet Tips | Fisher Scientific | ||
| Sterile Troughs | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | ||
| M. tuberculosis | ATCC | 27294 | |
| Pipeters: 1000, 200, 20μL | Fisher Scientific | ||
| Tips 1000, 20, 20 μL | Fisher Scientific | ||
| Multichannel Pipetter | Fisher Scientific | ||
| Incubator 5-10% CO2 | Fisher Scientific | ||
| Plastic bags, small, CO2 permeable | Poly Plastic Products | ||
| TB disinfectant (Such as ProSpray C-60) | Certol International, Commerce City, CO | PSC60/32 | |
| Mirror Box Reader | Fisher Scientific |
References
- Wengenack, N., Hall, L., Labombardi, V., Parrish, N. Evaluation of the New Sensititre (MYCOTB) MIC Plate for the Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) to First and Second Line Drugs. Presented at 50th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2010 Sept. 12, Boston, MA, , Abstract 2450 (2010).
- HHS Publication No. (CDC) 21-112: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). U.S. Department of Health and Human Services Centers for Disease and Preventions. , 5th Edition, National Institutes of Health. (2009).
- Morcillo, N., Imperiale, B., Digiulio, B. Evaluation of MGIT 960 and the colorimetric-based method for tuberculosis drug susceptibility testing. Int J Tuberc Lung Dis. 14, 1169-1175 (2010).
- Bemer, P., Bodmer, T., Munzinger, J., Perrin, M., Vincent, V., Drugeon, H. Multicenter Evaluation of the MB/BACT System for Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 42, 1030-1034 (2004).
- SENSITITRE MYCOTB Susceptibility Plate: For Mycobacterium Susceptibility Testing. Product Insert. , TREK Diagnostic Systems. Cleveland, OH. (2010).
- CLSI. Susceptiblity Testing of Mycobacteria, Nocardia, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard. Document M24-A. , CLSI. Wayne, Pennsylvania. (2003).
- Sullivan, N., Sotos, J., Anhalt, K., Allen, S. Preliminary results from a new TREK Sensititre Mycobacterium tuberculosis MIC plate (MYCOTB). C-151 presented at 110th American Society for Microbiology, Annual Meeting, San Diego, CA, , Abstract C-151 (2010).
- VersaTREK MYCO SUSCEPTIBLITY KIT. Product insert. , TREK Diagnostic Systems. Cleveland, OH. 7115-7160 (2008).
- Parrish, N. M., Carroll, K. C. The Role of the Clinical Mycobacteriology Laboratory in the Diagnosis and Management of Tuberculosis in Low Prevalance Settings. J Clin Microbiol. , Forthcoming (2010).
- Kam, K. M., Sloutsky, A., Yip, C. W., Bulled, N., Zingol, M., Espinal, M., Kim, S. J. Determination of critical concentrations of second-line anti-tuberculosis drugs with clinical and microbiological relevance. Int J Tubercl Lung Dis. 14, 282-288 (2010).
- Woods, G. L., Warren, N. G., Inderlied, C. B. Susceptibility Test Methods: Mycobacteria, Nocardia, and Other Actinomycetes. Manual of Clinical Microbiology. Murray, P. R., Barron, E. J., Jorgensen, J. H., Landry, M. L., Pfaller, M. A. , 9th Ed, ASM Press. Washington DC. 1223-1247 (2007).
- Bergmann, J. S., Woods, G. L. Evaluation of the ESP Culture System II for Testing Susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis Isolates to Four Primary Antituberculosis Drugs. J Clin Microbiol. 36, 2940-2943 (1998).
