Summary
Test di suscettibilità antimicrobica di Mycobacterium tuberculosis è impegnativo, ma fondamentale per la cura del paziente. Questo formato micropiastra offre test di 12 farmaci antimicobatterici e fornisce minima concentrazione inibente (MIC) valori, che sarà di aiuto nel trattamento appropriato.
Abstract
La rilevazione rapida della resistenza antimicrobica è importante nel tentativo di controllare l'aumento della resistenza Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Test di suscettibilità antimicrobica (AST) di Mtb è stata tradizionalmente eseguita con il metodo di agar proporzione o testando macrobroth su uno strumento come il BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (Diagnostica TREK, Cleveland, OH) o BacT / ALERT (bioMérieux, Hazelwood, MO). Il metodo delle proporzioni agar, mentre considerato lo standard "oro" di AST, è laborioso e richiede il calcolo della resistenza effettuando la conta delle colonie su agar contenenti droga rispetto al drug-free agar. Se vi è una crescita ≥ 1% sul farmaco contenente medio rispetto al drug-free medio, l'organismo è considerato resistente a quel farmaco. I metodi macrobroth richiedono strumentazione e rompere punto di prova ("critical") concentrazioni del farmaco per i farmaci di prima linea (isoniazide, etambutolo, rifampicina e pirazinamide). Il metodo qui descritto è disponibile in commercio in un formato da 96 pozzetti micropiastra [MYCOTB (Diagnostica TREK)] e contiene concentrazioni crescenti di 12 antimicrobici usati per il trattamento della tubercolosi inclusi sia prima (isoniazide, rifampicina, etambutolo) e farmaci di seconda linea (amikacina, cicloserina, etionamide, kanamicina, moxifloxacina, ofloxacina, acido para-aminosalicilico, rifabutina, e streptomicina). Pirazinamide, un farmaco di prima linea, non è incluso nella piastra microtiter a causa della sua necessità di condizioni di prova acida. Vantaggi del sistema micropiastra includono sia la facilità di configurazione e veloce girare intorno a tempo (14 giorni) rispetto al rapporto tradizionale agar (21 giorni). Inoltre, la piastra può essere impostato da inoculo preparato utilizzando brodo o terreno solido. Poiché il formato micropiastra è nuova e da Mtb presenta sfide di sicurezza unici nel laboratorio, questo protocollo si descrive come impostare in modo sicuro, incubare e leggere la micropiastra.
Protocol
Ogni laboratorio deve eseguire una valutazione dei rischi in collaborazione con il loro Comandante istituzionali di sicurezza biologica per determinare il livello appropriato di biosicurezza per la preparazione dell'inoculo e per pipettaggio dell'inoculo nella piastra. Nel nostro laboratorio, utilizziamo livello di biosicurezza 3 laboratorio (BSL3) pratiche fino alla micropiastre vengono inoculati, e sigillato con una guarnizione di plastica adesiva. Queste lastre vengono poi poste all'interno di un sacchetto di plastica, che è caldo anche sigillato. Lettura di incubazione e l'interpretazione dei micropiastra è condotto in un laboratorio di livello di biosicurezza 2 (BSL2).
1. Etichettatura delle materie
- Etichettare una piastra di agar sangue, tre Middlebrook 7H10 piatti, brodo Middlebrook 7H9, una soluzione salina tra tubo di vetro e perle micropiastra AST con gli identificatori appropriati (per esempio, il nome del paziente, il numero di cartella clinica) nel BSL2.
- Etichetta l'agar sangue e 7H10 placcato come il "controllo della purezza". Conta delle colonie periodica degli inoculo sono raccomandati per garantire che un'adeguata concentrazione di organismi viene utilizzato nel test. Conta delle colonie, quando eseguite dovranno avere due dei piatti 7H10 etichettati con "conta 1 / 1 colonia" e "contare 1 / 50 colonia".
2. Tecnologo preparati per andare in BSL3
- Appropriati dispositivi di protezione individuale è necessario lavorare in BSL3 e comprende solid-front camice, copricapo, guanti, copriscarpe, e un respiratore. Ciascuna istituzione dovrebbe stabilire il proprio piano di protezione delle vie respiratorie in collaborazione con l'Ufficio Igiene Industriale loro istituzione. Nel nostro laboratorio, abbiamo respiratori diversi disponibili, tra cui respiratori alimentati ad aria purificata (PAPRs) e montato con filtri HEPA, N95 mezza faccia respiratori.
3. Preparazione della cappa di sicurezza biologica
- Nel BSL3, preparare la cappa di sicurezza biologica (BSC) per la disinfezione della superficie e mettendo un tovagliolo di carta imbevuto di disinfettante circa 6 centimetri dal pannello di sfiato aria.
- Posizionare un contenitore per rifiuti a sinistra, e nephlometer piccole e vortex sulla destra.
- Loop inoculo, pipetors e suggerimenti sono posti accanto al tovagliolo di carta.
- Mettere un rack con l'organismo (in brodo o su terreno solido) e il 0,5 di serie McFarland sul tovagliolo di carta.
4. Calibrazione del nefelometro
- Posizionare un tubo di vetro salina perla tra nel nefelometro e impostare lo strumento a zero usando il vuoto salina interpolazione.
- Posizionare il 0,5 standard di McFarland nel nefelometro e calibrare secondo le istruzioni del produttore.
5. Preparazione dell'inoculo
- Lavorare nel colonie raschiare BSC dal terreno solido utilizzando un'ansa sterile nel adeguatamente etichettati salina tubo tra perle di vetro fino a ≥ 0,5 McFarland standard si ottiene.
- Ispezionare visivamente il campione, e confrontare allo standard McFarland.
- Esempio Vortex per 30-60 secondi.
- Lasciare l'inoculo di stabilirsi per 15 minuti (impostare un timer).
6. Inoculazione del micropiastra
- Regolare l'inoculo con soluzione salina tra brodo usando il nefelometro calibrato al McFarland 0,5 in passi 4.1 e 4.2. Questo deve essere completato entro 30 minuti (secondo le specifiche del produttore).
- Utilizzare un 200 pipetter microlitri e un lungo puntale resistente aerosol per rimuovere 100 l di inoculo dal rd TOP 1 / 3 della soluzione salina tubo tallone interpolazione. Inoculare il brodo Middlebrook 7H9. Lentamente vortice il brodo inoculato 7H9 per 20 secondi.
- Rimuovere la piastra microtiter AST dalla confezione del produttore. NON USARLO se l'essiccante è blu o se la confezione di alluminio è danneggiato.
- Preparare una diluizione 1:50 tubo per l'uso più tardi nella preparazione della diluizione 1:50 pipettando 50 ml di acqua sterile in una provetta sterile.
- Versare cautamente l'inoculo 7H9 brodo in un trogolo. Evitare di generare aerosol.
- Posizionare la micropiastra AST con l'etichetta rivolto verso l'alto.
- Usare un 12-canale pipetter per aggiungere 100 microlitri della inoculo a ciascun pozzetto.
- Preparare le diluizioni per la conta delle colonie:
- L'1 / 1 diluizione è preparato dal controllo positivo (H12) con striature 1 loop microlitri sul piatto 7H10 denominata "1 / 1".
- L'1 / 50 di diluizione è preparati inoculando un loop 1 microlitri dal pozzetto del controllo positivo (H12) e vorticoso nel tubo con 50 ml di tubo di acqua preparata in precedenza. Streak 1 ml di questa diluizione alla piastra etichetta "1 / 50".
- Inoculare le piastre purezza dal trogolo pipettando 50 microlitri su un agar sangue senza anticoagulante e 7H10 piastra e strisciare per l'isolamento.
- Postoun sigillo adesivo sul micropiastra AST. Premere con decisione su ogni bene per assicurare un'adeguata tenuta utilizzando il retro bianco della tenuta. Evitare pieghe.
- Disinfettare la micropiastra strofinando con un tovagliolo di carta imbevuto di un disinfettante tubercolicida e microstrips posto in un sacchetto di plastica e chiudere con una saldatura a caldo o nastro.
- Il sacchetto di plastica funge da contenitore secondario per garantire che tutti brodo è contenuto dovrebbe esserci una perdita o fuoriuscita del piatto principale.
7. Disinfezione dei materiali e cabina di sicurezza biologica
- Per evitare di produrre aerosol, attraverso un altro posto sulla parte superiore della vasca inoculato prima di inserirlo delicatamente nel contenitore degli scarti.
- Disinfettare tutti i materiali tra cui nephlometer, vortex, lastre, tubi, ecc strofinando giù con un disinfettante tubercolicida e aspettare il momento opportuno per assicurare la disinfezione secondo le istruzioni del produttore prima di togliere dal BSC. Per esempio, Prospray, il disinfettante tubercolicida usiamo, richiede 15 minuti per uccidere micobatteri.
- Mettere il recipiente scartare in un sacchetto di rischio biologico e sigillare prima di sterilizzazione in autoclave.
8. Incubazione
- Piastre devono essere incubate con i media verso il basso e si deve prestare attenzione per evitare fuoriuscite o spruzzi liquidi.
- Incubare la micropiastra AST piatto, 7H10 e piastre di agar sangue in un incubatore 35-37 ° C con il 5-10% di CO 2 con 5-10% di CO 2 nel laboratorio BSL2.
- Nel nostro laboratorio, questo è accettabile perché la piastra è ben sigillato e dentro un sacchetto di plastica sigillato.
- Non più di 2 piastre di microtitolazione AST dovrebbe essere impilati in incubatrice secondo le istruzioni del produttore.
9. Rappresentante risultati
Interpretazione dei risultati:Sigillato AST micropiastre possono essere letti manualmente usando uno specchio come un aiuto o con un lettore di piastre automatizzata, ad esempio il Vizion (Diagnostica TREK). Le lastre possono essere esaminata non appena 7 giorni dopo l'inoculazione. Esaminare i pozzetti di controllo della crescita in posizioni H11 e H12 per determinare se sono positivi (cioè, hanno un deposito di cellule sul fondo del pozzo). Se i pozzi di controllo della crescita non sono positivi, reincubare la piastra e riesaminare periodicamente (es., giorno 10, giorno 14) fino a quando i pozzi di controllo della crescita sono positivi.
- Specchio leggere:
- Luogo sigillato AST micropiastra sulla piattaforma;
- Leggi pozzetti di controllo della crescita dopo 7 giorni di incubazione, se invece è negativo, reincubare AST micropiastra;
- Se i controlli di crescita sono accettabili, quindi leggere il farmaco contenente pozzi. Per per ogni farmaco, registrare la prima diluizione che non ha una crescita confrontando i pozzi della droga con il controllo della crescita.
- La crescita appare come torbidità o come un deposito di cellule in fondo a un pozzo.
- Strumento di lettura: seguire le istruzioni del produttore, le istruzioni che seguono sono un esempio di come la lettura sarebbe stato fatto con la piattaforma Vizion:
- Log in
- Utilizzare una piastra "MYCOTB" AST software.
- Luogo piatto sigillato con il codice a barre rivolto verso l'utente. La crescita appare come torbidità o come un deposito di cellule in fondo a un pozzo.
- Leggi controlla la crescita, se questo è negativo, reincubare AST micropiastra, se positiva leggere la piastra toccando lo schermo con il primo pozzo di ogni farmaco che non mostra crescita.
Leggi le piastre purezza. La piastra di agar sangue dovrebbe mostrare alcuna crescita dopo 48 ore e la piastra di purezza 7H10 dovrebbe avere crescita confluente di un tipo di organismo. Se contaminati, il test AST microtiter deve essere ripetuta da una coltura pura.
Calcolare la conta delle colonie dal controllo positivo utilizzando la tabella sottostante:
Colony Conte chiave
| # Colonie contate sulla piastra denominata "1 / 1" | # Colonie contate sulla piastra denominata "1 / 50" | Inoculo conteggio delle colonie (ufc / ml) |
| <50 | 0 | <5 X 10 4 |
| 50-100 | 0-2 | 5 x 10 4 a 1 x 10 5 |
| > 100 | ≤ 10 | 1 x 5-5 Ottobre X 10 5 |
| > 100 | > 10 | > 5 X 10 5 |
Ci possono essere uscita con l'acido para-aminosalicilico in alcuni ceppi di Mycobacterium tubercolosis. Questo può essere interpretato, cercando in tutti i pozzetti che sono pellet e con il primo pozzo che ha la stessa dimensione del pellet come la diluizione successiva, come il punto finale. La resistenza è rara con questo farmaco.
Figura 1. Risultati rappresentativi utilizzando la piastra MYCOTB.
| Droga abbreviazione | Droga | MIC μ / ml |
| OFL | ofloxacina | 16 |
| MXF | moxifloxacina | 8 |
| RIF | rifampin | > 16 |
| AMI | amikacina | 0,5 |
| STR | streptomicina | 16 |
| RFB | rifabutina | 8 |
| PAS | acido p-aminosalicilico | ≤ 0,5 |
| ETH | etionamide | 5 |
| CYC | cicloserina | 4 |
| INH | isoniazide | 2 |
| KAN | kanamicina | 1,2 |
| EMB | etambutolo | 4.0 |
Discussion
Un esempio della micropiastra AST che controlla la crescita positiva è illustrato nella figura 1 e il punto finale MIC (mg / ml) per ogni farmaco è cerchiato. Uno studio condotto nel nostro laboratorio hanno indicato che il metodo microtiter AST piastra è equivalente al metodo gold standard proporzione agar per testare la sensibilità del Mycobacterium tuberculosis. Più veloce comunicazione dei risultati è stato ottenuto con micropiastra AST microtiter rispetto al metodo tradizionale proporzione agar con l'interpretazione finale per piastra AST microtitolazione e proporzione metodo agar a 14 e 21 giorni, respectively.The AST micropiastra ha il vantaggio di test prima e farmaci di seconda linea contemporaneamente che può aiutare a prevenire ritardi eccessivi con ceppi resistenti. La piastra microtiter AST è anche molto più facile da impostare e leggere che l'APM e sia uno specchio manuale e un sistema semi-automatico come il Vizion può essere utilizzato per leggere le piastre. La disponibilità di un valore di MIC per testare la resistenza ai farmaci TB può fornire preziose informazioni ai medici nuove rispetto al valore tradizionale concentrazione critica, soprattutto per quelli isolati con suscettibilità "borderline".
Disclosures
Non c'è nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare i tecnici di laboratorio della Clinica Mayo micobatteriologia Laboratorio per il loro aiuto durante lo studio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AST microtiter plates and adhesive seal | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | MYCOTB | |
| McFarland 0.5 standard | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | E1041 | |
| Middlebrook 7H10 plates | Fisher Scientific | ||
| Blood Agar Plates | Fisher Scientific | ||
| Sterile loops 1 μL | Fisher Scientific | ||
| Sterile loops 10 μL | Fisher Scientific | ||
| Sensititre Saline-Tween glass bead broth | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | 27143 | |
| 7H9 OADC Broth | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | T3440 | |
| Long Pipet Tips | Fisher Scientific | ||
| Sterile Troughs | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | ||
| M. tuberculosis | ATCC | 27294 | |
| Pipeters: 1000, 200, 20μL | Fisher Scientific | ||
| Tips 1000, 20, 20 μL | Fisher Scientific | ||
| Multichannel Pipetter | Fisher Scientific | ||
| Incubator 5-10% CO2 | Fisher Scientific | ||
| Plastic bags, small, CO2 permeable | Poly Plastic Products | ||
| TB disinfectant (Such as ProSpray C-60) | Certol International, Commerce City, CO | PSC60/32 | |
| Mirror Box Reader | Fisher Scientific |
References
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