Het in kaart brengen Remmende neuronale circuits door Laser Scanning fotostimulatie

Summary

Deze paper introduceert een benadering van het combineren van laser scanning fotostimulering met hele cel opnames in transgene muizen die GFP in beperkte remmende neuron populaties. De techniek maakt uitgebreide mapping en kwantitatieve analyse van lokale synaptische circuits specifieke remmende corticale neuronen.

Abstract

Remmende neuronen zijn cruciaal voor corticale functies. Zij omvatten ongeveer 20% van de gehele corticale neuronale populatie en kan verder worden onderverdeeld in verschillende subtypes gebaseerd op hun immunochemische, morfologische en fysiologische eigenschappen ^1-4. Hoewel eerder onderzoek heeft veel onthuld over de intrinsieke eigenschappen van afzonderlijke soorten remmende neuronen, kennis over hun lokale circuit verbindingen is nog relatief beperkt ^3,5,6. Gezien het feit dat elk individueel neuron de functie wordt gevormd door de exciterende en inhiberende synaptische input binnen corticale circuits, hebben we met behulp van laser scanning fotostimulatie (WAPZ) naar de kaart lokale circuit verbindingen met specifieke remmende celtypen. Vergeleken met conventionele elektrische stimulatie of glutamaat bladerdeeg stimulatie, WAPZ heeft unieke voordelen waardoor uitgebreide mapping en kwantitatieve analyse van de lokale functionele ingangen individueel geregistreerd neuronen ^3,7-9. Laser fotostimulatie via de glutamaat uncaging activeert selectief neuronen perisomatically, zonder activering van axonen van doorgang of distale dendrieten, die een sub-laminaire mapping resolutie zorgt ervoor. De gevoeligheid en efficiëntie van WAPZ voor mapping inputs van vele plaatsen stimulatie over een groot gebied zijn goed geschikt voor corticale circuit analyse.

Hier introduceren we de techniek van WAPZ in combinatie met whole-cell patch clamping voor lokale remmende circuit in kaart brengen. Gerichte opnamen van specifieke remmende celtypen vergemakkelijkt door het gebruik van transgene muizen die groen fluorescent eiwit (GFP) in beperkte remmende neuron populaties in de cortex ^3,10 Dat sluit bemonstering van de beoogde celtypes en ondubbelzinnige identificatie van de opgenomen celtypen kunnen . Zoals voor WAPZ in kaart brengen, schetsen we het systeem instrumentatie, beschrijven de experimentele procedure en data-acquisitie, en de huidige voorbeelden van circuit in kaart brengen in muis primaire somatosensory cortex. Zoals geïllustreerd in onze experimenten wordt opgesloten glutamaat geactiveerd in een ruimtelijk beperkte gebied van de hersenen slice door UV laser fotolyse, gelijktijdige voltage-clamp opnamen waarmee de aanwezigheid van fotostimulering opgewekte synaptische responsen. Kaarten van zowel stimulerende of remmende synaptische input aan de beoogde neuron worden gegenereerd door het scannen van de laserstraal honderden potentiële presynaptische locaties te stimuleren. Zo WAPZ maakt de bouw van gedetailleerde kaarten van synaptische input botsende op specifieke soorten remmende neuronen door middel van herhaalde experimenten. Tezamen de fotostimulering gebaseerde techniek biedt neurowetenschappers een krachtig hulpmiddel voor het bepalen van de functionele organisatie van de lokale corticale circuits.

Protocol

1. Brain slice voorbereiding

1. Transgene muizen diep verdoofd met pentobarbitalnatrium (> 100 mg / kg, ip) en snel onthoofd en hun hersenen geëxtraheerd in een bevroren en geoxygeneerde oplossing snijden.
2. GFP veiligheidsbril worden gebruikt om visueel te screenen als de hersenen van muizen inderdaad tot uitdrukking GFP.
3. Primaire somatosensorische cortex delen van 400 urn dik gesneden met een vibratome in suikerhoudende kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF). Plakjes worden eerst geïncubeerd in suikerhoudende ACSF gedurende 30 minuten tot 1 uur bij 32 ° C, en na de initiële incubatieperiode overgedragen naar opnametoestel ACSF bij kamertemperatuur. Gedurende de incubatie en opname worden de plakken continu geborreld met 95% O _{2 -5%} CO2.

2. Apparatuur opstarten

Het totale systeem uitvoering is geïllustreerd in figuur 1.

1. De laser koelsysteem en energieleverancier is Turned op, om de laser klaar.
2. Alle sluitwerk voor fotostimulering control (inclusief de aftastspiegel systeem, een optische modulator, een elektronische sluiter en een fotodiode ingangsversterker) ingeschakeld.
3. De elektrofysiologische apparatuur (inclusief Multiclamp 700B versterker en micromanipulators) ingeschakeld. Elektrofysiologische opnames, fotostimulering en beeldvorming van het segment preparaten worden uitgevoerd in een plak perfusie kamer gemonteerd op het gemotoriseerde objecttafel van de microscoop.
4. De afbeeldende camera (Retiga 2000, Q-imaging, Austin, TX) ingeschakeld. Slices worden gevisualiseerd met de rechtopstaande microscoop (BW51X, Olympus) met infrarood differentieel interferentie contrast (DIC) en epi-fluorescentie optiek door de imaging-systeem.
5. De Matlab-gebaseerde EPHUS software en Q-capture camera software worden opgestart. Een op maat aangepaste versie van Ephus software (Ephus, beschikbaar op https://openwiki.janelia.org/ </ A>) gebruikt om fotostimulatie protocollen controleren en verkrijgen fotostimulering data.
6. Nadat het systeem is ingeschakeld, moet men controleren of de laser fotostimulatie systeem is op een werkende staat. Zoals de 4x microscoop objectief wordt gebruikt voor het leveren van de UV knippert glutamaat uncaging, kan een stuk wit papier worden gebracht onder de laser scanning patroon te observeren terwijl het systeem draait.

3. Het opzetten van slice perfusie

1. Een druk perfusie systeem wordt ingeschakeld om de opname ACSF meegenomen in de slice kamer. Zorg wordt genomen om een ​​constant vloeistofniveau van 2,0 mm boven het segment in de kamer te waarborgen.
2. Een portie van de voorraadoplossing van MNI-kooien-glutamaat wordt toegevoegd aan 25 ml van circulerende ACSF een concentratie van 0,2 mM glutamaat opgesloten. Houd er rekening mee dat na 5-6 uur van experimenteren, het bad oplossing en MNI-glutamaat wordt vernieuwd.
3. Een hersenen slice wordt verplaatst naar de opname kamer. Men kan draaien de beeldvorming systeem om de slice kwaliteit te controleren en anatomisch te lokaliseren de primaire somatosensorische gebied. Dan is de slice is verankerd met een op maat gemaakte stringed platina ring. Zorg ervoor dat u het anker gezet over de hersenen regio voor opnames.

4. Whole cell patch-klemmen-opname

1. Glaselektroden (4-6 MQ weerstand) getrokken en gevuld met een interne oplossing die 0,1% biocytin voor cel etikettering en morfologische identificatie.
2. Om patch opname uit te voeren, cellen zijn afgebeeld op het 60x objectief. Remmende celtypen worden eerst geïdentificeerd en geselecteerd op basis visualisatie van GFP expressie onder een DIC / fluorescent Olympus microscoop opnamen worden vervolgens uitgevoerd onder visuele controle behulp van infrarood DIC videobewaking. Let een paar keer schakelen tussen de DIC en fluorescerende modes moet de GFP cellocatie bevestigen het naderen van de elektrode aan de doelcel.
3. Bij het breken in, worden de beelden van de cel aan 60x onder het DIC en tl-modi die voor de on-line verificatie. Voordat verzameling van fotostimulatie gegevens worden hyperpolariserende en depolariserende stroompulsen geïnjecteerd om elke cel de basisbehoeften van elektrofysiologische eigenschappen te onderzoeken.
4. Zodra stabiele gehele cel opnamen worden bereikt met een goede toegang weerstand (gewoonlijk <20 MQ) wordt het microscoopobjectief omgeschakeld van 60x tot 4x voor laserscanning fotostimulering. De plak beeld op 4x wordt verkregen en wordt gebruikt voor het geleiden en registreren fotostimulering sites.

5. Laser scanning fotostimulatie

1. De fotostimulatie en data-acquisitie parameters worden ingesteld door het activeren van de configuratie schakelmodule van Ephus. Gewoonlijk wordt 1 ms laser (20 mW) met een stimulus interval van 1 seconde aan fotostimulering mapping. Gegevens sporen van 1 seconde bemonsterd op 10 kHz worden verworven.
2. De 4x slice afbeelding wordt geladen in de mapper module van Ephus. De locatie van de cel soma is gedefinieerd, en de fotostimulering plaatsen van een 16x16 patroon (80 micrometer x 80 micrometer afstand) zijn opgezet rond de cel locatie, die alle corticale lagen.
3. De excitatie profiel van de opgenomen neuron wordt geprojecteerd door onderzoek van de pieken locaties in reactie op fotostimulering over de recente mode. Onze gebruiksvriendelijke software met de on-regelig display functies vergemakkelijkt het in kaart brengen van experimenten.
4. Lokale prikkelende circuit verbindingen worden in kaart gebracht door de detectie van excitatoire postsynaptische stromingen (EPSC) van de opgenomen cel, terwijl laser scanning op verschillendelocaties. De cel wordt gehouden bij -70 mV in spanningsklem modus om naar binnen prikkelende stromen te detecteren. De EPSC kaarten worden herhaald 2-3 keer met de fotostimulering patroon gedraaid of gespiegeld.
5. Optioneel: Lokale remmende circuit verbindingen kunnen ook in kaart gebracht door de detectie van remmende postsynaptische stromingen (IPSC) van de opgenomen cel gehouden op dicht bij 0 mV in het voltage clamp-modus om naar buiten remmende stromen te detecteren. Merk op dat het het beste om de elektrode interne oplossing te gebruiken met kalium vervangen door cesium voor IPSC in kaart brengen.
6. Nadat alle fysiologische assays voltooid zijn, wordt de elektrode voorzichtig uit de cel opgenomen. De hersenen slice wordt afgesloten en gefixeerd in 4% paraformaldehyde gedurende de nacht. De opgenomen cellen wordt gekleurd tegen biocytin. Celmorfologie wordt bestudeerd met confocale of epi-fluorescentie microscopie, die eveneens bevestigt dat elke gemeten cel inderdaad het GFP-expressie interneuron oorspronkelijk bedoeld.

6. Photostimulation gegevensanalyse

De nieuw ontwikkelde methoden en software-implementatie ¹¹ wordt toegepast op de detectie en meting van fotostimulering opgewekte synaptische gebeurtenissen in de ruwe data kaarten. Zoals geïllustreerd in figuur 2 zijn gekleurde kaarten geconstrueerd om het patroon van synaptische input om het opgenomen neuron illustreren.

7. Representatieve resultaten:

Voorbeeld resultaten van elektrofysiologische opname en fotostimulering mapping worden getoond in Figuur 2. Gerichte opnamen van specifieke remmende celtypen mogelijk gemaakt door transgene muizen die GFP in bekende remmende celtypen. Gezien de verscheidenheid aan remmende interneuronen worden analyses van GFP expressie intrinsieke elektrofysiologie en morfologische kenmerken (Figuur 2A) gecombineerd om tot een definitief celtype classificatie. Figuur 2B-C illustreren dat laserscanning fotostimulering maakt uitgebreide in kaart brengen van lokale cortical circuit verbindingen met enkele remmende neuronen. De ruwe data kaart wordt weergegeven in figuur 2C. De directe uncaging reacties worden uitgesloten van data analyse (Figuur 2C). De kwantitatieve input kaarten zijn kleur-gecodeerd, afgebeeld in figuur 2D-F. Het voorbeeld snel spiking remmende interneuronen ontvangen sterke prikkelende synaptische input (EPSCs) uit laag 4 en diepere lagen. Door over de cel synaptische input organisatie gedefinieerd corticale paden zijn wij in staat om de mogelijke rol (bijvoorbeeld feedback en feedforward-inhibitie) concluderen in corticale verwerking van informatie.

Figuur 1. Algemeen stelsel instrumentatie voor laserscanning fotostimulering. Ons totale systeem bestaat uit fotostimulatie controle, video imaging en elektrofysiologische opname systemen. We adopteerden het ontwerp van de WAPZ systeem eerder beschreven ^7,17. Een laser unit wordt gebruikt om 355 nm UV las genererener voor glutamaat uncaging. De laserstraal wordt gericht door de optische weg van ons systeem. Korte periodes van laser knippert (bijv., 1 - 3 ms) worden bestuurd door middel van een elektro-optische modulator (dwz Pockels cel) en een mechanische sluiter. Laserbundel kracht wordt gemoduleerd door een neutrale dichtheidsgradiënt wiel en gecontroleerd door het omleiden van een fractie van de laserbundel met een dekglaasje bedekt met een fotodiode. De laser scanning omvat een paar XY scanspiegels de scan lens, de buis lens en de objectieflens. De spiegels leveren de laserstraal door middel van een scan lens, dan de straal komt de microscoop via een dichroïsche spiegel en wordt gefocusseerd door een op maat gemaakte UV-doorlatende buis lens. De bundel underfills de achterkant opening van het microscoopobjectief een meer zuilvormige (in tegenstelling tot conische) belichtende bundel, waarbij de mapping als tweedimensionale mogelijk doordat de axiale resolutie leveren. Onder 4x doelstelling de laserstraal vormt uncaging spots, elk approximating een Gaussische profiel met een breedte van 153 pm zijdelings in het brandvlak (zie inzet). Verschillende laserstimulatie posities kunnen worden bereikt door galvanometers aangedreven XY scanning spiegels, de spiegels en de achterkant apertuur van het objectief in geconjugeerde vlakken, vertalen in verschillende posities spiegel scannen locaties op de objectieflens brandvlak. Tijdens uncaging wordt een variabel aantal patroon sites die het gehele gebied bedekt opeenvolgend gestimuleerd in een nonraster, niet-willekeurige sequentie te voorkomen herzien de nabijheid van recent gestimuleerd sites. Raadpleeg Xu et al.. (2010) voor meer gedetailleerde informatie.

Figuur 2. Het in kaart brengen lokale prikkelende circuit verbindingen met een GFP-expressie snel spiking interneuron in laag 4 van de muis primaire sensorische cortex. A1 en A2 tonen de DIC en GFP fluorescentie beelden van de beoogde cel onder de 60xdoelstelling in het levende brein slice, terwijl A3 de cel morfologie onthuld door biocytin kleuring in de post-opname, vaste slice zien. A4 toont het afvuren patronen van de opgenomen GFP cel kenmerkend een snel spiking remmende interneuron in antwoord op huidige intrasomatic injecties van verschillende sterktes. B tonen de slice beeld bovenop met de 16 x16 fotostimulatie plaatsen (*). De cellocatie wordt aangegeven door de kleine rode cirkel. C toont een reeks van fotostimulering-evoked response sporen uit de stimulatie locaties die in B, terwijl de cel werd gehouden bij -70 mV tot innerlijke prikkelende stromen te detecteren. Verschillende vormen van fotostimulering reacties worden geïllustreerd door de sporen op plaatsen 1 en 2, die worden geëxtraheerd en afzonderlijk in de insert. Het spoor 1 is een voorbeeld van de directe reacties (aangegeven met de rode pijlpunten) aan glutamaat uncaging het cellichaam en dendrieten promximal. Andere sporen in 2 zijn typische voorbeelden van prikkelende synaptische ingezet reacties (blauw). Directe reacties en synaptische ingangen kunnen worden onderscheiden door hun amplitudes en reactietijden. D, E en F zijn de gekleurde kaarten (16x16 sites) van de gemiddelde amplitude EPSC de EPSC getallen en de eerste gedetecteerde EPSC latency per site, respectievelijk voor de ruwe data getoonde kaart in C. De gemiddelde input amplitude van elk stimulatie site is de gemiddelde amplitude van EPSCs in het analysevenster met de basislijn spontane reactie afgetrokken van de fotostimulering respons van dezelfde site. Het aantal EPSCs en de aankomsttijd of latentie van de eerste gedetecteerde EPSC per site tevens gemeten en uitgezet. Raadpleeg (Shi et al.., 2010) voor meer details.

Discussion

Fotostimulering-based mapping technieken ook werkelijk zijn toegepast voor het analyseren van corticale circuits. Laser scanning fotostimulering gecombineerd met hele cel opname maakt het mogelijk hoge resolutie in kaart brengen van laminaire verdeling van presynaptische ingangsbronnen om enkele neuronen, omdat de gelijktijdige opname van een postsynaptische neuron met fotostimulering van clusters van presynaptische neuronen op veel verschillende locaties biedt kwantitatieve maatregelen van de ruimtelijke verdeling van de excitatoire of remmende ingangen. Deze techniek geholpen door het gebruik van transgene muizen die GFP in bekende remmende celtypes is sterk vergemakkelijkt ons huidige werk in de richting van het ophelderen van lokale remmende corticale netwerken. In het voorbeeld studie hebben we gekooid glutamaat neuronen in een ruimtelijk wijze beperken op uncaging laser activeren. Opgemerkt dat glutamaat uncaging kan worden vervangen door fotoactivatie via channelrhodopsin of andere genetisch gecodeerd fotogevoelige moleculaireles in specifieke celtypen ^12,13. Dus de fotostimulering techniek kan niet alleen specifieke corticale gebieden maar ook specifieke subset van neuronen in de deelnemende circuits ^14-16 richten. Daarnaast hebben wij recent een nieuw fotostimulering gebaseerde mapping techniek ⁹ dat de ruimtelijke nauwkeurigheid van activatie die door laser-scanning fotostimulering worden bereikt met snelle en hoge tijdsresolutie beoordeling van opgeroepen netwerk activiteit die kan worden bereikt door spanningsgevoelige bevat kleurstofbeeldvorming. Anders combinatie van gehele cellen opnamen met fotostimulering voor het toewijzen lokaal circuit inputs afzonderlijk opgenomen neuronen, kan deze worden gebruikt om innovatie corticale circuituitgang en functionele verbanden kaart op het niveau van neuronale populaties.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
transgenic mouse lines	Jackson lab or other sources		Please refer to Xu and Callaway (2009)
GFP goggles	BLS Ltd., Hungary
vibratome	Leica Systems	VT1200S
MNI caged glutamate (4-methoxy-7-nitroindolinyl-caged l-glutamate)	Tocris Bioscience, Ellisville, MO	Cat No. 1490
biocytin		B4261
electrode puller	Sutter Instrument, Novato, CA	P-97
glass tubes for making electrodes		BF150-86-10
Multiclamp 700B amplifier	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	Multiclamp 700B
digital CCD camera	Q-imaging, Austin, TX	Retiga 2000
Research microscope	Olympus, Tokyo, Japan	BW51X
UV laser unit	DPSS Lasers, Santa Clara, CA	model 3501
Other equipment for Laser scanning phostimulation			Please refer to Xu et al. (2010)
Solutions:
Sucrose-containing artificial cerebrospinal fluid (ACSF) for slice cutting (in mM: 85 NaCl, 75 sucrose, 2.5 KCl, 25 glucose, 1.25 NaH2PO4, 4 MgCl2, 0.5 CaCl2, and 24 NaHCO3). Recording ACSF (in mM: 126 NaCl, 2.5 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 1.25 NaH2PO4, and 10 glucose) Electrode internal solution (in mM: 126 K-gluconate, 4 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0.3 GTP-Na, and 10 phosphocreatine; pH 7.2, 300 mOsm).