מיפוי מעגלים עצביים מעכבים ידי Photostimulation סריקת הליזר

Summary

נייר זה מציג את גישה של שילוב סריקת הליזר photostimulation עם הקלטות תא שלמות בעכברים מהונדסים המבטאים GFP באוכלוסיות נוירון מעכבות מוגבלות. הטכניקה מאפשרת מיפוי מקיף וניתוח כמותי של מעגלים סינפטיים המקומיים של נוירונים בקליפת המוח מעכבים ספציפיים.

Abstract

הנוירונים מעכבים הם קריטיים לתפקוד של קליפת מוח. הם מהווים כ 20% מהאוכלוסייה העצבית בקליפת המוח כולו וניתן לסווג נוסף לתוך תת מגוונים המבוסס על immunochemical, הצורני שלהם, והתכונות פיסיולוגיות ^1-4. למרות שמחקרים קודמים גילו הרבה על תכונות פנימיות של סוגים שונים של תאי עצב מעכבים, ידע על קשרי המעגלים המקומיים שלהם הוא עדיין מצומצם יחסית ^3,5,6. בהתחשב בכך שהפונקציה של כל נוירון בודד מעוצבת על ידי הקלט המעורר והמעכב הסינפטית בתוך מעגלי קליפת מוח, היינו באמצעות ליזר סריקת photostimulation (LSPS) לחיבורים במעגל מקומיים המפה לסוגי תאים מעכבים ספציפיים. בהשוואה לגירוי חשמלי קונבנציונלי או גירוי עלים גלוטמט, LSPS יש יתרונות ייחודיים המאפשרים מיפוי מקיף וניתוח כמותי של תשומות פונקציונליות מקומיות לנוירונים ^3,7-9 נרשמו בנפרד. ליזר תמונהגירוי באמצעות משחרר רפרוף גלוטמט סלקטיבי מפעיל נוירונים perisomatically, ללא הפעלת האקסונים של מעבר או דנדריטים הדיסטליים, אשר מבטיח רזולוצית מיפוי תת מינרית. הרגישות והיעילות של LSPS לתשומות מיפוי מאתרי גירוי רבים על פני אזור גדול מתאימות גם לניתוח מעגל קליפת מוח.

כאן אנו מציגים טכניקה של LSPS שילוב עם תיקון כל תאי clamping למיפוי מעגל מעכב מקומי. הקלטות ממוקדות של סוגי תאים מעכבים ספציפיים בהנחייתם של שימוש בעכברים מהונדסים המבטאים חלבוני ניאון ירוקים (GFP) באוכלוסיות נוירון מעכבות מוגבלות בקליפת ^3,10, המאפשרת דגימה עקבית של סוגי התאים הממוקדים וזיהוי חד משמעי של סוגי התאים נרשמו . באשר למיפוי LSPS, אנו מתארים את מכשור המערכת, לתאר את הליך הניסוי ורכישת נתונים, ודוגמאות נוכחיות של מיפוי מעגל בעכבר העיקרי somatosensory קליפת המוח. כפי שהודגם בניסויים שלנו, גלוטמט כלוב מופעל באזור מרחב מוגבל של פרוסת המוח על ידי photolysis הליזר UV; הקלטות בו זמנית מתח מהדק לאפשר זיהוי של תגובות הסינפטי photostimulation-עוררו. מפות של קלט הסינפטי או מעכב או מעורר לנוירון הממוקד נוצרות על ידי סריקת קרן הליזר כדי לעורר מאה אתרים presynaptic פוטנציאליים. לפיכך, LSPS מאפשר הבנייה של מפות מפורטות של תשומות סינפטיים impinging על סוגים מסוימים של נוירונים מעכבים באמצעות ניסויים חוזרים ונשנים. יחדיו, הטכניקה photostimulation המבוססת מציעה מדעני המוח כלי רב עצמה לקביעת הארגון הפונקציונלי של מעגלי קליפת מוח המקומיים.

Protocol

1. הכנת פרוסת המוח

1. עכברים מהונדסים הם עמוקים מורדמים בנתרן פנטוברביטל (> 100 מ"ג / ק"ג, ip) ומהירות ערופה, והמוח שלהם חולצו בפתרון חיתוך קפוא וחומץ.
2. משקפי GFP משמשים ראייה למסך אם מוח העכבר אמנם מבטא את ה-GFP.
3. חלקים בקליפת מוח חושיים ראשוניים של 400 מיקרומטר העבה לחתוך עם vibratome בנוזל המכיל סוכרוז המלאכותי השדרתי (ACSF). פרוסות מודגרת ראשון בסוכרוז המכיל ACSF למשך 30 דקות עד 1 שעות ב 32 ° C, ואחרי תקופת הדגירה הראשונית, הועברו לACSF הקלטה בטמפרטורת חדר. במהלך הדגירה וההקלטה, בפרוסות בעבעו ברציפות עם 95% _2% -5 O CO _2.

2. הפעלת ציוד

היישום הכולל של המערכת בא לידי ביטוי באיור 1.

1. מערכת קירור הליזר וספק כוח היא אל תדליקד ב, מקבל הליזר מוכן.
2. כל החומרה הקשורה לשליטת photostimulation (כולל מערכת סריקת המראה, אפנן אופטי, תריס אלקטרוני ומגבר קלט photodiode) מופעלת.
3. ציוד אלקטרו (כולל מגבר 700B Multiclamp וmicromanipulators) מופעל. הקלטות אלקטרו, photostimulation, והדמיה של ההכנות הפרוסות נעשות בתא זלוף פרוסה הועלה על הבימה הממונעת של מיקרוסקופ.
4. מצלמת ההדמיה (Retiga 2000, ש-הדמיה, אוסטין, טקסס) מופעלת. פרוסות דמיינו עם מיקרוסקופ הזקוף (BW51X, אולימפוס) עם ניגוד אינפרא אדום הפרש התערבות (DIC) ואופטיקה עלית ניאון באמצעות מערכת ההדמיה.
5. תוכנת Matlab מבוססת EPHUS ותוכנת מצלמה ש-לכידה הם התחילו. גרסה מותאמת עדכון של תוכנת Ephus (Ephus, זמין בhttps://openwiki.janelia.org/ </>) משמש לשליטת פרוטוקולי photostimulation ולרכוש נתוני photostimulation.
6. לאחר שהמערכת מופעלת, צריך לבדוק אם מערכת photostimulation הליזר היא במצב עבודה. כאובייקטיבי מיקרוסקופ 4x משמש להעברה את הבזקי UV למשחרר רפרוף גלוטמט, פיסת נייר לבן ניתן לשים תחת להתבונן דפוס סריקת ליזר תוך המערכת פועלת.

3. הגדרת זלוף פרוסה

1. מערכת זלוף לחץ מופעלת להאכיל ACSF ההקלטה לתוך חדר הפרוסה. טיפול נלקח על מנת להבטיח רמת נוזל קבועה של 2.0 מ"מ מעל הפרוסה בבית הבליעה.
2. Aliquot של פתרון המניות של משרד תשתיות הלאומיים, בכלוב-גלוטמט הוא הוסיף 25 מ"ל של מחזורי ACSF לריכוז של 0.2 מ"מ גלוטמט בכלוב. שים לב שאחרי 5-6 שעות של ניסויים, פתרון האמבטיה וMNI-גלוטמט יהיה רעננים.
3. פרוסת מוח מועברת לתא ההקלטה. אפשר להפעיל את ההדמיה שלystem כדי לבדוק את האיכות והפרוסה אנטומית לאתר את האזור החושי הראשוני. אז הפרוסה מעוגנת בטבעת פלטינת מייתר בהזמנה אישית. יש להיזהר שלא לשים את העוגן על האזור במוח המיועד להקלטות.

4. הקלטת תא כל תיקון clamping-

1. אלקטרודות זכוכית (MΩ 4-6 התנגדות) הם משכו ומלאים בפתרון פנימי המכיל biocytin 0.1% לתיוג תא וזיהוי מורפולוגי.
2. כדי לבצע הקלטת תיקון, תאים הם דמיינו במטרת 60x. סוגי תאים מעכבים מזוהים ראשון ונבחרו על סמך הדמיה של ביטוי של GFP תחת מיקרוסקופ אולימפוס דסק"ש / ניאון; הקלטות לאחר מכן מתבצעות תחת בקרה חזותית בעזרת ניטור וידאו דסק"ש אינפרא אדום. שים לב כמה פעמים במעבר בין מצבי DIC וניאון יש צורך לאשר את מיקום תא GFP עת שהתקרב לאלקטרודה לתא המטרה.
3. עם השבירה ב, התמונות של התא ב60x תחת מצבי DIC וניאון נלקחות לאימות באופן מקוון. לפני איסוף נתוני photostimulation, hyperpolarizing וdepolarizing פולסים נוכחיים הזריק לבחון תכונות אלקטרו הבסיסיות של כל תא.
4. אחרי תאים שלמים ברגע יציב מושגות עם התנגדות גישה טובה (בדרך כלל <20 MΩ), מטרת מיקרוסקופ מופעלת מ60x ל4x לphotostimulation סריקת הליזר. התמונה הפרוסה ב4x נרכשה ותשמש להדרכה ורישום אתרי photostimulation.

5. הליזר SCAnning photostimulation

1. את הפרמטרים לרכישת photostimulation ונתונים נקבעים על ידי הפעלת מודול מתג התצורה של Ephus. בדרך כלל, 1 MS ליזר (20 mW) עם מרווח גירוי של 1 שני משמש למיפוי photostimulation. עקבות נתונים של 1 שני נדגמו ב 10 קילוהרץ הם נרכשים.
2. תמונת פרוסת 4x נטענת למודול הממפה של Ephus. המיקום של סומה תא מוגדר, ואתרי photostimulation של תבנית בגודל 16x16 (80 מיקרומטר 80 מיקרומטר ריווח x) מוגדרים סביב מיקום התא, מכסים את כל שכבות בקליפת המוח.
3. פרופיל העירור של נוירון נרשם ממופה על ידי בחינת מיקומי תקיעת המסמר בתגובה לphotostimulation במצב הנוכחי המהדק. התוכנה הידידותית למשתמש שלנו עם תכונות התצוגה מקוונות מאפשרת ניסויי המיפוי.
4. חיבורי מעגלים מעוררים מקומיים ממופים זיהוי של זרמי postsynaptic מעוררים (EPSC) מהתא נרשם בזמן סריקת ליזר בשונהמקומות. התא מתקיים ב -70 mV במצב מהדק מתח כדי לזהות זרמים מעוררים פנימה. מפות EPSC חוזרות 2-3 פעמים עם מסובב דפוס photostimulation או התהפכו.
5. אופציונלי: חיבורי מעגלים מעכבים מקומיים יכולים גם ממופים על ידי זיהוי של זרמי postsynaptic מעכבים (iPSC) מהתא המוקלט שנערך על קרוב ל 0 mV במצב מהדק מתח כדי לזהות זרמים מעכבים חיצוניים. שים לב שהדרך טובה ביותר הוא להשתמש בפתרון הפנימי אלקטרודה עם אשלגן הוחלף בצזיום למיפוי iPSC.
6. אחרי כל המבחנים הפיסיולוגיים סקרים, אלקטרודה מוסרת בעדינות מהתא המוקלט. פרוסת המוח נלקחת החוצה וקבוע בparaformaldehyde 4% בין הלילה. התאים נרשמו מוכתמים נגד biocytin. מורפולוגיה תא נבדקה עם מיקרוסקופיה confocal או עלית הניאון, שגם מאשר שכל תא הוא אכן נרשם interneuron GFP להביע ממוקד במקור.

6. Photostimulatניתוח נתוני יון

מתודולוגיה חדשה שפותחה שלנו ויישום תוכנה ¹¹ מוחלת על זיהוי והמדידה של photostimulation-עוררו אירועים הסינפטי במפות הנתונים הגולמיות. כפי שהודגם באיור 2, מפות צבעוניות שנבנות על מנת להמחיש את הדפוס של קלט הסינפטי לנוירון נרשם.

7. נציג תוצאות:

תוצאות לדוגמה של הקלטה ומיפוי אלקטרו photostimulation מוצגות באיור 2. הקלטות ממוקדות של סוגי תאים מעכבים ספציפיים מתאפשרות באמצעות עכברים מהונדסים המבטאים GFP בסוגי תאים מעכבים ידועים. בהינתן המגוון של interneurons המעכב, ניתוחים של ביטוי של GFP, אלקטרו הפנימי ומאפיינים מורפולוגיים (איור 2 א) משולבים להגיע לסיווג סוג התא הסופי. תרשים 2B-C להמחיש שphotostimulation סריקת הליזר מאפשר מיפוי מקיף של cortic המקומיal חיבורי מעגלים להנוירונים מעכבים יחידים. מפת הנתונים הגולמית שמוצגת באיור 2 ג. את התגובות משחררות רפרוף הישירות אינן נכללות בניתוח נתונים (האיור 2C). מפות הקלט כמותיים מסומנות בצבעים, שמוצגות באיור 2D-F. את interneurons המעכב מהיר spiking הדוגמא קבל קלט הסינפטי מעורר חזק (EPSCs) משכבה 4 ושכבות עמוקות יותר. על ידי הנוגע לארגון הקלט הסינפטי של התא למסלולים קורטיקליים מוגדרים, אנו יכולים להסיק התפקיד האפשרי שלו (למשל, משוב ועיכוב feedforward) בעיבוד מידע בקליפת המוח.

איור 1. מכשור כללי למערכת photostimulation סריקת הליזר. המערכת הכוללת שלנו מורכב משליטת photostimulation, הדמית וידאו, ומערכות הקלטת אלקטרו. אנחנו אמצנו את העיצוב של מערכת LSPS תואר קודם ^7,17. יחידת ליזר משמשת לייצור 355 ננומטר UV אסאה למשחרר רפרוף גלוטמט. קרן הליזר מכוון דרך הנתיב האופטי של המערכת שלנו. משכי זמן קצרים של הבזקי ליזר (למשל, 1 - 3 ms) נשלטים על ידי שימוש במאפנן אלקטרו אופטי (כלומר, pockels תא) וצמצם מכאני. כוח קרן הליזר הוא מווסת על ידי גלגל שיפוע צפיפות ניטראלית ופיקוח על ידי הסטת חלק קטן של קרן הליזר עם coverslip זכוכית לphotodiode. מערכת סריקת הליזר כוללת זוג XY של מראות סריקה, סריקת העדשה, עדשות הצינור, ועדשה האובייקטיבית. המראות לספק קרן הליזר דרך עדשת סריקה, ולאחר מכן את הקרן נכנסה למיקרוסקופ באמצעות מראה Dichroic וממוקד על ידי עדשת מחוייט UV-העברת צינור. קרן underfills הצמצם האחורי של מטרת מיקרוסקופ כדי לספק יותר עמודים (בניגוד לצורה חרוטה) קרן מאירה, שמירה על המיפוי כדו ממדים שניתן על ידי הקטנת הרזולוציה הצירית. תחת מטרת 4x, קרן הליזר יוצרת כתמים משחררים רפרוף, כל approximating פרופיל Gaussian ברוחב של 153 מיקרומטר הרוחבי במישור המוקד (ראה מסגרת). עמדות גירוי ליזר שונות יכולות להיות מושגות באמצעות מראות סריקת XY galvanometers מונחה, כמו המראות והצמצם האחורי של המטרה הן במטוסים המצומד, לתרגם עמדות המראה למקומות שונים בסריקת מישור המוקד של העדשה האובייקטיבית. במהלך משחרר רפרוף, מספר משתנה של אתרי דוגמת שמכסים את כל השדה מומרצים רצף בnonraster, רצף אקראי, כדי למנוע מחודש קרבת אתרי מגורה לאחרונה. אנא עיין בשו et al. (2010) לקבלת מידע מפורט יותר.

איור 2. מיפוי קשרי מעגלים מעוררים מקומיים לinterneuron GFP מבטא מהיר spiking בשכבת 4 של קליפת מוח התחושתית עכבר עיקרית. A1 ו-A2 להראות את תמונות DIC וGFP ניאון של התא הממוקד תחת 60xמטרה בפרוסת המוח החייה, ואילו A3 מציג את המורפולוגיה של התאים שהתגלתה על ידי הצביעה בbiocytin לאחר הקלטת פרוסה, הקבועה. A4 מציג את דפוסי הירי של התא המוקלט GFP, האופייני לinterneuron המעכב המהיר spiking, בתגובה לזריקות נוכחיות intrasomatic של עוצמות שונות. B מציג את התמונה על גבי הפרוסה עם 16 אתרי photostimulation x16 (*). מיקום התא מסומן בעיגול האדום הקטן. C מראה מערך של עקבות תגובה photostimulation עורר-ממקומות הגירוי מוצגים בB, ואילו התא התקיים ב -70 mV לאתר זרמים מעוררים פנימה. צורות שונות של תגובות photostimulation מומחשות באמצעות העקבות במקומות 1 ו 2, שהתרחבו ובנפרד מוצגים בכנס. עקבות 1 היא דוגמה לתשובות ישירות (שמצוין על ידי ראשי החץ האדומים) לגלוטמאט משחרר רפרוף על גוף התא ודנדריטים promximal. עקבות אחרות ב2 הן דוגמאות טיפוסיות של הסינפטי מעורר בלשים תגובות (כחול). תשובות ישירות ותשומות סינפטיים יכולים להיות מכובדות על ידי אמפליטודות שלהם, וזמן תגובת תגובה. D, E ו-F הן מפות בצבעים (16x16 אתרים) של ממוצע EPSC משרעת, מספרי EPSC והשהית EPSC התגלתה לראשונה לאתר, בהתאמה, עבור הנתונים הגולמיים המפה מוצגת בג משרעת הקלט ממוצע מכל אתר הוא גירוי המשרעת הממוצעת של EPSCs בחלון הניתוח, בתגובה הספונטנית הבסיסית נגרעה מתגובת photostimulation של אותו האתר. מספר EPSCs ואת זמן ההגעה או ההשהיה של EPSC התגלה לראשונה לאתר גם מדד וזמם. אנא עיין ב( השי et al., 2010) לקבלת פרטים נוספים.

Discussion

טכניקות מיפוי Photostimulation מבוססות כבר מיושם ביעילות לניתוח מעגלים בקליפת מוח. photostimulation סריקת הליזר בשילוב עם הקלטת תא שלמה מאפשר מיפוי ברזולוציה גבוה של הפצות עלעלים של מקורות קלט presynaptic לנוירונים בודדים, כי ההקלטה סימולטנית מנוירון postsynaptic עם photostimulation של צבירי נוירונים presynaptic במקומות רבים ושונים מספקת מדדי כמותיים של התפלגות המרחבית של גירוי או תשומות מעכבות. טכניקה זו סייעה באמצעות עכברים מהונדסים המבטאים GFP בסוגי תאים מעכבים ידועים שהקלה את העבודה הנוכחית שלנו באופן משמעותי לכיוון הבהרת רשתות קליפת מוח מעכבות מקומיות. במחקר הדוגמא, השתמש גלוטמט כלוב כדי להפעיל נוירונים באופן להגביל מרחבית על משחרר רפרוף הליזר. יש לציין שמשחרר רפרוף גלוטמט יכול להיות מוחלף עם photoactivation דרך channelrhodopsin או מקודד גנטי molecu הרגיש אחרles בסוגי תאים מסוימים ^12,13. לכן טכניקת photostimulation אפשר למקד לא רק אזורים בקליפת המוח ספציפיים, אלא גם משנה ספציפית של תאי עצב בתוך המעגלים המשתתפים ^14-16. בנוסף, לאחרונה פתחו שיטה חדשה המבוסס על מיפוי photostimulation ⁹ שמשלבת את הדיוק המרחבי של הפעלה שיכול להיות מושגת על ידי photostimulation ליזר סריקה עם הערכת הפתרון מהירה וגבוהה זמנית של פעילות רשת עוררה שיכול להיות מושגת על ידי מתח רגיש לצבוע הדמיה. בניגוד לשילוב של הקלטות תא שלמות עם photostimulation למיפוי תשומות מעגלים מקומיות לנוירונים שנרשמו בנפרד, חדשנות זו יכולה לשמש למיפוי פלט מעגל קליפת המוח וקשרים פונקציונליים ברמה של אוכלוסיות עצביות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
transgenic mouse lines	Jackson lab or other sources		Please refer to Xu and Callaway (2009)
GFP goggles	BLS Ltd., Hungary
vibratome	Leica Systems	VT1200S
MNI caged glutamate (4-methoxy-7-nitroindolinyl-caged l-glutamate)	Tocris Bioscience, Ellisville, MO	Cat No. 1490
biocytin		B4261
electrode puller	Sutter Instrument, Novato, CA	P-97
glass tubes for making electrodes		BF150-86-10
Multiclamp 700B amplifier	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	Multiclamp 700B
digital CCD camera	Q-imaging, Austin, TX	Retiga 2000
Research microscope	Olympus, Tokyo, Japan	BW51X
UV laser unit	DPSS Lasers, Santa Clara, CA	model 3501
Other equipment for Laser scanning phostimulation			Please refer to Xu et al. (2010)
Solutions:
Sucrose-containing artificial cerebrospinal fluid (ACSF) for slice cutting (in mM: 85 NaCl, 75 sucrose, 2.5 KCl, 25 glucose, 1.25 NaH2PO4, 4 MgCl2, 0.5 CaCl2, and 24 NaHCO3). Recording ACSF (in mM: 126 NaCl, 2.5 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 1.25 NaH2PO4, and 10 glucose) Electrode internal solution (in mM: 126 K-gluconate, 4 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0.3 GTP-Na, and 10 phosphocreatine; pH 7.2, 300 mOsm).