Summary
इस कागज पूरे सेल रिकॉर्डिंग के साथ ट्रांसजेनिक सीमित निरोधात्मक न्यूरॉन आबादी में GFP व्यक्त चूहों में photostimulation स्कैनिंग लेजर के संयोजन का एक दृष्टिकोण का परिचय. व्यापक और विशिष्ट निरोधात्मक cortical न्यूरॉन्स के स्थानीय synaptic सर्किट के मात्रात्मक विश्लेषण मानचित्रण तकनीक के लिए अनुमति देता है.
Protocol
1. मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी
- ट्रांसजेनिक चूहों गहरा pentobarbital सोडियम (> 100 आईपी मिलीग्राम / किग्रा) के साथ anesthetized है और तेजी से decapitated कर रहे हैं, और उनके दिमाग में एक स्थिर और oxygenated काटने समाधान में निकाला.
- GFP चश्में नेत्रहीन स्क्रीन अगर माउस मस्तिष्क वास्तव में GFP व्यक्त करता करने के लिए किया जाता है.
- 400 मोटी सुक्ष्ममापी की प्राथमिक somatosensory cortical वर्गों sucrose युक्त कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) में एक vibratome के साथ काट रहे हैं. स्लाइस 1 sucrose युक्त ACSF में 30 मिनट के लिए 1 घंटे के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर incubated और प्रारंभिक ऊष्मायन अवधि के बाद, कमरे के तापमान पर रिकॉर्डिंग ACSF हस्तांतरित. ऊष्मायन और रिकॉर्डिंग के दौरान, स्लाइस लगातार 95% ओ 2 -5% सीओ 2 के साथ bubbled कर रहे हैं.
2. उपकरण स्टार्टअप
समग्र प्रणाली के कार्यान्वयन चित्रा 1 में सचित्र है.
- लेजर शीतलन प्रणाली और बिजली आपूर्तिकर्ता turne हैd पर, लेजर तैयार हो रही है.
- Photostimulation नियंत्रण (स्कैनिंग दर्पण प्रणाली, एक ऑप्टिकल न्यूनाधिक, एक इलेक्ट्रॉनिक शटर और एक photodiode इनपुट एम्पलीफायर सहित) से संबंधित सभी हार्डवेयर पर कर दिया जाता है.
- electrophysiological उपकरण (एक Multiclamp 700B एम्पलीफायर और micromanipulators सहित) पर कर दिया जाता है. Electrophysiological रिकॉर्डिंग, photostimulation और टुकड़ा तैयारी की इमेजिंग एक टुकड़ा छिड़काव माइक्रोस्कोप के motorized मंच पर घुड़सवार कक्ष में किया जाता है.
- इमेजिंग कैमरा (2000 Retiga, क्यू इमेजिंग, ऑस्टिन, TX) चालू है. स्लाइस अवरक्त अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) और इमेजिंग प्रणाली के माध्यम से महामारी फ्लोरोसेंट प्रकाशिकी के साथ ईमानदार माइक्रोस्कोप (BW51X, ओलिंप) के साथ देखे हैं.
- Matlab आधारित EPHUS सॉफ्टवेयर और क्यू कैमरा सॉफ्टवेयर पर कब्जा शुरू कर रहे हैं. . Ephus सॉफ्टवेयर का एक संस्करण कस्टम संशोधित (Ephus, पर उपलब्ध https://openwiki.janelia.org/ </ A>) photostimulation प्रोटोकॉल नियंत्रण और photostimulation डेटा प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- के बाद सिस्टम पर है, देखने के लिए अगर लेजर photostimulation प्रणाली काम कर रहे राज्य में है की जाँच करनी चाहिए. 4x खुर्दबीन उद्देश्य ग्लूटामेट uncaging लिए यूवी चमक देने के लिए प्रयोग किया जाता है, के रूप में सफेद कागज के एक टुकड़े के अंतर्गत रखा जा सकता है लेजर स्कैनिंग पैटर्न का पालन करते हुए सिस्टम चलाता है.
3. टुकड़ा छिड़काव की स्थापना
- एक दबाव छिड़काव प्रणाली पर बदल दिया है टुकड़ा चेंबर में रिकॉर्डिंग ACSF फ़ीड. देखभाल करने के लिए कक्ष में टुकड़ा ऊपर 2.0 मिमी की एक निरंतर द्रव स्तर को सुनिश्चित करने के लिए लिया जाता है.
- MNI बंदी ग्लूटामेट का स्टॉक समाधान का एक अशेष भाजक 0.2 मिमी बंदी ग्लूटामेट की एकाग्रता के लिए ACSF परिसंचारी के 25 मिलीलीटर के लिए जोड़ा है. कृपया ध्यान दें कि प्रयोग के 5-6 घंटे के बाद स्नान समाधान और MNI ग्लूटामेट ताजा हो जाएगा.
- एक मस्तिष्क टुकड़ा रिकार्डिंग कक्ष में ले जाया जाता है. एक इमेजिंग चला सकते हैंystem टुकड़ा की गुणवत्ता की जांच करने के लिए और anatomically प्राथमिक somatosensory क्षेत्र का पता लगाने. फिर टुकड़ा एक कस्टम निर्मित तारवाला प्लैटिनम की अंगूठी के साथ लंगर डाले है. मस्तिष्क क्षेत्र की रिकॉर्डिंग के लिए इरादा पर लंगर नहीं डाल सावधान रहो.
4. पूरे सेल रिकॉर्डिंग पैच clamping
- ग्लास इलेक्ट्रोड (4-6 MΩ प्रतिरोध) खींच लिया और एक आंतरिक सेल लेबलिंग और morphological पहचान के लिए 0.1% biocytin युक्त समाधान के साथ भरा.
- पैच रिकॉर्डिंग करने के लिए, कोशिकाओं 60x उद्देश्य में कल्पना कर रहे हैं. 1 निरोधात्मक सेल प्रकार की पहचान कर रहे हैं और GFP अभिव्यक्ति की एक ओलिंप / डीआईसी फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे दृश्य के आधार पर चयनित, रिकॉर्डिंग के बाद दृश्य अवरक्त डीआईसी वीडियो निगरानी द्वारा सहायता प्राप्त नियंत्रण के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं. कृपया ध्यान दें कि डीआईसी और फ्लोरोसेंट मोड के बीच स्विचन के कुछ समय GFP सेल स्थान की पुष्टि करते हुए लक्ष्य सेल इलेक्ट्रोड आ आवश्यक है.
- में तोड़ने पर, डीआईसी और फ्लोरोसेंट मोड के तहत 60x पर सेल के चित्र पर लाइन सत्यापन के लिए लिया जाता है. इससे पहले photostimulation डेटा के संग्रह, hyperpolarizing और वर्तमान दालों depolarizing प्रत्येक कोशिका बुनियादी electrophysiological गुणों की जांच करने के लिए इंजेक्शन हैं.
- अच्छा उपयोग प्रतिरोध (आमतौर पर <MΩ 20) के साथ एक बार स्थिर पूरे सेल रिकॉर्डिंग प्राप्त कर रहे हैं, माइक्रोस्कोप उद्देश्य 60x से लेजर स्कैनिंग photostimulation के लिए 4x के लिए बंद है. 4x में टुकड़ा छवि हासिल कर ली है और मार्गदर्शक और पंजीकरण photostimulation साइटों के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
5. लेजर scaphotostimulation nning
- photostimulation और डाटा अधिग्रहण पैरामीटर Ephus के विन्यास स्विच मॉड्यूल सक्रिय द्वारा स्थापित कर रहे हैं. आम तौर पर, 1 सेकंड के एक प्रोत्साहन अंतराल के साथ 1 एमएस लेजर (20 मेगावाट) photostimulation मानचित्रण के लिए इस्तेमाल किया जाता है. 1 10 kHz पर नमूना 2 डेटा निशान का अधिग्रहण कर रहे हैं.
- 4x टुकड़ा छवि Ephus के मैपर मॉड्यूल में भरी हुई है. सेल सोमा के स्थान परिभाषित है, और एक 16x16 पैटर्न (80 x 80 सुक्ष्ममापी रिक्ति सुक्ष्ममापी) photostimulation साइटों सेल स्थान के आसपास स्थापित कर रहे हैं, सभी cortical परतों को कवर.
- दर्ज न्यूरॉन उत्तेजना प्रोफाइल photostimulation के लिए वर्तमान क्लैंप मोड पर प्रतिक्रिया में spiking स्थानों का परीक्षण करके मैप किया जाता है. हमारे पर लाइन प्रदर्शन सुविधाओं के साथ उपयोगकर्ता के अनुकूल सॉफ्टवेयर मानचित्रण प्रयोगों की सुविधा है.
- स्थानीय उत्तेजक सर्किट कनेक्शन दर्ज सेल से उत्तेजक postsynaptic धाराओं (EPSC) का पता लगाने के द्वारा मैप किए जाते हैं, जबकि लेजर अलग स्कैनिंगस्थानों. सेल वोल्टेज क्लैंप मोड में -70 mV में आवक उत्तेजक धाराओं का पता लगाने के लिए आयोजित किया जाता है. EPSC नक्शे photostimulation पैटर्न घुमाया साथ 2-3 बार दोहराया जाता है या फ़्लिप किया.
- वैकल्पिक: स्थानीय निरोधात्मक सर्किट कनेक्शन भी दर्ज जावक निरोधात्मक धाराओं का पता लगाने के लिए वोल्टेज क्लैंप मोड में करीब 0 mV में आयोजित करने के लिए सेल से निरोधात्मक postsynaptic धाराओं (iPSC) का पता लगाने के द्वारा मैप किया जा सकता है. ध्यान दें कि यह सबसे अच्छा है iPSC मानचित्रण के लिए सीज़ियम के साथ प्रतिस्थापित पोटेशियम के साथ इलेक्ट्रोड आंतरिक समाधान का उपयोग.
- सब के बाद शारीरिक assays को पूरा कर रहे हैं, इलेक्ट्रोड धीरे दर्ज सेल से निकाल दिया जाता है. मस्तिष्क टुकड़ा बाहर ले जाया जाता है और तय 4% paraformaldehyde में रातोंरात. दर्ज कोशिकाओं biocytin खिलाफ दाग है. सेल morphology confocal या महामारी फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी, जो भी पुष्टि की है कि प्रत्येक दर्ज सेल वास्तव में GFP व्यक्त मूल रूप से लक्षित interneuron के साथ जांच की है.
6. Photostimulatआयन डेटा विश्लेषण
हमारे नव विकसित पद्धति और सॉफ्टवेयर कार्यान्वयन 11 और photostimulation कच्चे डेटा नक्शे में पैदा synaptic की घटनाओं का पता लगाने के माप के लिए लागू किया जाता है. जैसा कि चित्र में 2 उदाहरण, रंग कोडित नक्शे दर्ज न्यूरॉन synaptic इनपुट के पैटर्न को वर्णन करने के लिए निर्माण कर रहे हैं.
7. प्रतिनिधि परिणाम:
उदाहरण के electrophysiological रिकॉर्डिंग और photostimulation मानचित्रण के परिणामों चित्रा 2 में दिखाया जाता है. विशिष्ट निरोधात्मक सेल प्रकार की लक्षित रिकॉर्डिंग ट्रांसजेनिक ज्ञात निरोधात्मक प्रकार की कोशिकाओं में GFP व्यक्त चूहों का उपयोग करके संभव बनाया है. निरोधात्मक interneurons की विविधता को देखते हुए, GFP अभिव्यक्ति, आंतरिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और morphological विशेषताओं (2A चित्रा) के विश्लेषण के अंतिम सेल प्रकार वर्गीकरण पर पहुंचने के लिए संयुक्त रहे हैं. 2B - सी चित्रा वर्णन है कि लेजर स्कैनिंग photostimulation स्थानीय cortic के व्यापक मानचित्रण के लिए अनुमति देता हैअल एकल निरोधात्मक न्यूरॉन्स के लिए सर्किट कनेक्शन. कच्चे डेटा नक्शे चित्रा 2C में दिखाया गया है. प्रत्यक्ष uncaging प्रतिक्रियाओं डेटा विश्लेषण (चित्रा 2C) से बाहर रखा गया है. मात्रात्मक इनपुट नक्शे रंग कोडित रहे हैं, 2 डी एफ चित्र में दिखाया गया है. उदाहरण के लिए तेजी से spiking निरोधात्मक interneurons 4 परत और गहरी परतों से मजबूत उत्तेजक synaptic इनपुट (EPSCs) प्राप्त किया. Cortical परिभाषित रास्ते के लिए सेल synaptic इनपुट संगठन संबंधित, हम cortical सूचना संसाधन में अपने संभावित भूमिका (जैसे, प्रतिक्रिया और feedforward निषेध) का अनुमान करने में सक्षम हैं.
चित्रा 1. जनरल प्रणाली उपकरण लेजर स्कैनिंग photostimulation के लिए हमारे समग्र प्रणाली. Photostimulation नियंत्रण, वीडियो इमेजिंग, और electrophysiological रिकॉर्डिंग सिस्टम के होते हैं. हम अपनाया LSPS प्रणाली का डिजाइन पहले 7,17 वर्णित है. एक लेजर इकाई 355 एनएम यूवी लास उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता हैग्लूटामेट uncaging के लिए एर. लेजर बीम हमारी प्रणाली के ऑप्टिकल पथ के माध्यम से निर्देशित है. लेजर चमक (उदाहरण के लिए, 1 - एमएस 3) के लघु durations एक विद्युत ऑप्टिकल (यानी, pockels सेल) न्यूनाधिक और एक यांत्रिक शटर का उपयोग करके नियंत्रित कर रहे हैं. लेजर बीम सत्ता एक तटस्थ घनत्व ढाल पहिया द्वारा modulated और एक गिलास एक photodiode coverslip साथ लेजर बीम का एक छोटा सा अंश हटाने के द्वारा नजर रखी है. स्कैनिंग लेजर प्रणाली स्कैन दर्पण, स्कैन लेंस, लेंस ट्यूब, और उद्देश्य लेंस के एक XY जोड़ी भी शामिल है. दर्पण स्कैन लेंस के माध्यम से लेजर बीम उद्धार, तो बीम एक dichroic दर्पण के माध्यम से माइक्रोस्कोप में प्रवेश करती है और एक कस्टम निर्मित ट्यूब यूवी संचारण लेंस से ध्यान केंद्रित है. बीम खुर्दबीन एक अधिक खानेदार रोशन बीम (शंक्वाकार के खिलाफ), axial संकल्प को कम करने के रूप में संभव के रूप में दो आयामी मानचित्रण रखने प्रदान करने के उद्देश्य के पीछे एपर्चर underfills. 4x उद्देश्य के तहत, लेजर बीम uncaging स्पॉट, प्रत्येक approximati रूपोंएनजी 153 सुक्ष्ममापी की एक नाभीय विमान (डालने देखें) laterally चौड़ाई के साथ एक गाऊसी प्रोफाइल. विभिन्न लेजर उत्तेजना पदों galvanometers संचालित xy स्कैनिंग दर्पण के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, के रूप में दर्पण और उद्देश्य के पीछे एपर्चर संयुग्म विमानों में हैं, उद्देश्य लेंस फोकल हवाई जहाज़ में विभिन्न स्थानों में स्कैनिंग दर्पण पदों का अनुवाद. Uncaging के दौरान, नमूनों साइटों है कि पूरे क्षेत्र को शामिल किया गया है की एक चर संख्या sequentially एक nonraster, nonrandom अनुक्रम लिए हाल ही उत्तेजित साइटों के आसपास समीक्षा से बचने में प्रेरित कर रहे हैं. Xu एट अल (2010) के लिए और अधिक विस्तृत जानकारी के लिए देखें.
चित्रा 2. एक GFP व्यक्त माउस प्राथमिक संवेदी प्रांतस्था के 4 परत में तेजी से spiking interneuron स्थानीय उत्तेजक सर्किट कनेक्शन मानचित्रण A1 और A2 60x के तहत लक्षित सेल की डीआईसी और GFP फ्लोरोसेंट छवियों को दिखानेउद्देश्य मस्तिष्क में रहने वाले टुकड़ा में, जबकि A3 सेल के बाद रिकॉर्डिंग, निश्चित टुकड़ा में biocytin धुंधला हो जाना द्वारा पता चला आकारिकी से पता चलता है. A4 दर्ज GFP सेल, अलग ताकत intrasomatic मौजूदा इंजेक्शन के जवाब में एक तेजी से spiking निरोधात्मक interneuron की विशेषता है, फायरिंग पैटर्न से पता चलता है. B टुकड़ा 16 x16 photostimulation साइटों (*) के साथ आरोपित छवि दिखाने. सेल स्थान छोटे लाल वृत्त ने संकेत दिया है. सी photostimulation पैदा उत्तेजना बी में दिखाया गया है, जबकि सेल एमवी -70 में आयोजित किया गया आवक उत्तेजक धाराओं का पता लगाने के स्थानों से प्रतिक्रिया के निशान के एक सरणी से पता चलता है. Photostimulation प्रतिक्रियाओं के विभिन्न रूपों के 1 और 2 के स्थानों, जो विस्तार कर रहे हैं और अलग डालने में दिखाया निशान द्वारा सचित्र हैं. 1 ट्रेस प्रत्यक्ष प्रतिक्रियाओं का एक उदाहरण (लाल arrowheads द्वारा इंगित) सेल शरीर और promximal dendrites पर uncaging ग्लूटामेट है. 2 में अन्य निशान उत्तेजक में synaptic विशिष्ट उदाहरण हैंप्रतिक्रियाओं (नीला) डाल दिया. सीधी प्रतिक्रिया और synaptic आदानों उनके amplitudes और प्रतिक्रिया latencies द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है. डी, ई, एफ और औसत EPSC आयाम का रंग कोडित (16x16 साइटों) नक्शे, EPSC संख्या, और 1 का पता चला साइट प्रति EPSC विलंबता, क्रमशः, के लिए कच्चे डेटा सी में दिखाया नक्शे प्रत्येक से औसत इनपुट आयाम हैं उत्तेजना साइट विश्लेषण विंडो में EPSCs का मतलब आयाम आधारभूत सहज प्रतिक्रिया ही साइट के photostimulation प्रतिक्रिया से subtracted के साथ है. EPSCs और आगमन समय या साइट प्रति पहले पता लगाया EPSC की विलंबता की संख्या भी मापा जाता है और साजिश रची है. अधिक जानकारी के लिए (शि एट अल, 2010) उल्लेख करें.
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Discussion
Photostimulation आधारित मैपिंग तकनीक को प्रभावी ढंग से किया गया है cortical सर्किट का विश्लेषण करने के लिए लागू होता है. लेजर स्कैनिंग पूरे सेल रिकॉर्डिंग के साथ संयुक्त photostimulation एकल न्यूरॉन्स presynaptic इनपुट सूत्रों के लामिना वितरण के उच्च संकल्प मानचित्रण की अनुमति देता है, क्योंकि कई अलग अलग स्थानों पर presynaptic न्यूरॉन्स के समूहों की photostimulation साथ एक postsynaptic न्यूरॉन से एक साथ रिकॉर्डिंग उत्तेजक के स्थानिक वितरण के मात्रात्मक उपायों प्रदान करता है या निरोधात्मक आदानों. ट्रांसजेनिक ज्ञात निरोधात्मक प्रकार की कोशिकाओं में GFP व्यक्त चूहों का उपयोग द्वारा सहायता प्राप्त तकनीक बहुत स्थानीय निरोधात्मक cortical नेटवर्क elucidating की ओर हमारे वर्तमान काम में मदद की है. उदाहरण के अध्ययन में, हम बंदी ग्लूटामेट का इस्तेमाल एक spatially लेजर uncaging पर तरीके प्रतिबंधित न्यूरॉन्स सक्रिय. यह ध्यान दिया जाना है कि ग्लूटामेट uncaging के photoactivation channelrhodopsin या अन्य आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग द्वारा सहज molecu के माध्यम से बदला जा सकता हैविशेष सेल प्रकार में 12,13 les. इस प्रकार photostimulation तकनीक न केवल विशिष्ट cortical लेकिन यह भी उनके भाग लेने 14-16 सर्किट के भीतर न्यूरॉन्स की विशिष्ट सबसेट क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए संभव है. इसके अलावा, हम हाल ही में एक नया मानचित्रण photostimulation आधारित 9 तकनीक है कि सक्रियण के स्थानिक सटीक है कि तेजी से और उच्च अस्थायी पैदा नेटवर्क गतिविधि के संकल्प का आकलन है कि वोल्टेज के प्रति संवेदनशील के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है के साथ लेजर स्कैनिंग photostimulation द्वारा प्राप्त किया जा सकता है शामिल विकसित डाई इमेजिंग. व्यक्तिगत रूप से दर्ज न्यूरॉन्स को स्थानीय सर्किट आदानों मानचित्रण के लिए photostimulation साथ पूरे सेल रिकॉर्डिंग के संयोजन के विपरीत, इस नवाचार neuronal आबादी के स्तर पर cortical सर्किट उत्पादन और कार्यात्मक कनेक्शन नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम अपने तकनीकी सहायता के लिए Tran Huynh, एंड्रयू सैन एंटोनियो, जैरी लिन धन्यवाद. यह काम स्वास्थ्य DA023700 अनुदान के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा वित्त पोषित किया गया था और XX DA023700-04S1
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| transgenic mouse lines | Jackson lab or other sources | Please refer to Xu and Callaway (2009) | |
| GFP goggles | BLS Ltd., Hungary | ||
| vibratome | Leica Systems | VT1200S | |
| MNI caged glutamate (4-methoxy-7-nitroindolinyl-caged l-glutamate) | Tocris Bioscience, Ellisville, MO | Cat No. 1490 | |
| biocytin | B4261 | ||
| electrode puller | Sutter Instrument, Novato, CA | P-97 | |
| glass tubes for making electrodes | BF150-86-10 | ||
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Multiclamp 700B | |
| digital CCD camera | Q-imaging, Austin, TX | Retiga 2000 | |
| Research microscope | Olympus, Tokyo, Japan | BW51X | |
| UV laser unit | DPSS Lasers, Santa Clara, CA | model 3501 | |
| Other equipment for Laser scanning phostimulation | Please refer to Xu et al. (2010) | ||
Solutions: |
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References
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