Summary
يوصف أسلوب السماح للتلاعب الدوائية المباشرة للأجنة الفئران خلال neurulation ان يتجاوز التمثيل الغذائي للأمهات. ويمكن تكييف هذه التقنية لدراسة جوانب مختلفة من neurulation من خلال تغيير نقطة زمنية وكيل الدوائية.
Abstract
نماذج الماوس الوراثية هي أداة هامة في دراسة الثدييات إغلاق الأنبوب العصبي (غراي وروس ، 2009 ؛ روس ، 2010). ومع ذلك ، يقتصر على دراسة الأجنة في الرحم بواسطة الفأرة عدم قدرتنا على التعامل مباشرة عقاقيري الأجنة في معزل عن تأثيرات الأيض الأمهات على كاشف للاهتمام. وسواء باستخدام جزيء صغير من البروتين المؤتلف ، أو سيرنا ، وتسليم هذه المواد إلى الأم ، من خلال النظام الغذائي أو عن طريق الحقن تخضع هذه المركبات غير مستقرة لمجموعة متنوعة من دفاعات الجسم التي يمكن منعهم من الوصول إلى الجنين. ويمكن استخدام التحقيقات في الثقافات كلها من الأجنة لفصل الأمهات من آثار على التنمية الذاتية الجنين.
هنا ، نقدم طريقة لزرع أجنة الفئران باستخدام وسائل التخصيب في جهاز حاضنة الدوارة التي تسمح لإغلاق الأنبوب العصبي الطبيعي بعد تشريح (كروكيت ، 1990). مرة واحدة في الثقافة ، ويمكن للأجنةيمكن معالجته باستخدام التقنيات التقليدية في المختبر أنه لن يكون الأمر خلاف ذلك ممكن اذا كانت لا تزال على الأجنة في الرحم. ويمكن جمع الأشقاء الجنين في نقاط زمنية مختلفة لدراسة جوانب مختلفة من neurulation ، والتي تحدث من 7.5 - E7 (العصبية تشكيل لوحة ، وقبيل بدء neurulation) لE9.5 - 10 (في ختام الجمجمة العصبي أضعاف ، والذيلية الإغلاق ، كوفمان ، 1992). في هذا البروتوكول ، ونحن لدينا وسيلة لشرح تشريح أجنة في timepoints التي هي الأمثل لدراسة neurulation الجمجمة. وسيتم تشريح أجنة في E8.5 (حوالي 10-12 somities) ، وبعد الشروع في إغلاق الأنبوب العصبي ولكن قبل أن يتحول الجنين وإغلاق الجمجمة أضعاف العصبية ، والمحافظة في الثقافة حتى E10 (somities 26-28) ، عندما الجمجمة وينبغي أن تكون كاملة neurulation.
Protocol
1. يتم سرد كافة الكواشف في الجدول رقم 1 -- إعداد وسائل الثقافة
- مصل الفئران الذكور ذوبان الجليد عند 37 درجة مئوية.
- حرارة تعطيل مصل الفئران لمدة 30 دقيقة عند 55 درجة مئوية
- الطرد المركزي في مصل الفئران لمدة 5 دقائق 10K في درجة حرارة الغرفة
- إزالة 50:50 طاف والاختلاط مع الفينول الحمراء ث DMEM الحرة / الجلوكوز السامية
- تعقيم وسائل الإعلام باستخدام حقنة أم تصفية 0.45
- وينبغي أن تكون مستعدة على الأقل من وسائل الإعلام 1ml / جنين
2. عزل الرحم من السد حامل
- باستخدام الإجراءات التي وافق عليها رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام (IACUC) ، والسد حامل تخدير الأولى والتضحية ثم خلع عنق الرحم
- تعقيم البطن مع EtOH 70 ٪
- قرصة مسار صغيرة من الجلد على طول خط الوسط ، تماما فوق خط الحلمة ، مع ملقط الكبيرة وفتح البطن تحت ملقط الخاص مع مقص كبير. يجب الحرص على عدم الاضرار بأي الهيكل الداخليق
- استخدام مقص لقطع أفقيا الخاص من فتح أولية تجاه كل جانب من الماوس بحيث البطن كلها مفتوحة
- يمكن الامعاء ومنصات الدهون الزائدة غالبا ما يحجب الرحم ويجب أن يتم نقل هذه جانبا بحيث يمكن ملاحظتها الجزء العلوي من الرحم والمبايض على كل جانب
- قرصة الجزء العلوي من الرحم دون المبيض واستخدام المقص الخاص لفصل الرحم من الدهون ، وقطع من طرف واحد من المبيض إلى الرحم أخرى
- اخراج الرحم بالملقط الخاص ووضع في طبق بتري مع المالحة
3. إزالة الأجنة من الرحم
- شطف الرحم مع المياه المالحة لإزالة أي فائض في الدم وتقليم أي الدهون الزائدة من الخارج
- نقل إلى طبق نظيف مع درجة حرارة الغرفة. المالحة لتحسين التصور Tyrodes
- باستخدام stereomicroscope منفصلة لكل جنين باستخدام مقص صغير أو الغرامة إذا كان من الضروري (# 5) ملقط بعناية قشر الرحم إربا. <لى> إدراج ملقط غرامة في الفضاء بين جدار الرحم والساقط وقشر الظهر جدار الرحم ، والحرص على عدم اختراق الجنين
4. إزالة الساقط من أجنة
- توجيه الساقط بحيث قتامة جزء (المشيمة) تواجه بعيدا عنك
- إجراء شق بالملقط الخاص على طول الخط الفاصل بين الجزء المظلم من الساقط من أخف وزنا جزء ، والحرص على عدم قطع عميق جدا
- استكمال فصل المشيمة من الجزء العلوي من كيس المح ، والحرص على عدم تمزيق مخروط المشيمة الظاهر (EPC). عند هذه النقطة يجب أن تكون قادرا على تصور الغشاء Reicherts على كيس المح
- تواصل لإزالة الساقط بأكمله (أخف وزنا جزء) والحرص على عدم اختراق كيس الصفار في
- قرصة بلطف وإزالة Reicherts بواسطة تقشير بعيدا عن EPC. في حالة تلف EPC أو فصلها عن كيس المح ، وسوف تفشل لتحويل الأجنة عادة من E9.5 - E8.5
5. إعداد نظام الثقافة
- قطع نهاية ماصة نقل من البلاستيك مع مقص لزيادة القطر لفتح بحيث يمكن pipetted الجنين دون الاضرار كيس المح
- تعبئة الزجاجات الأسطوانة نظيفة مع 1 مل من وسائل الإعلام في جنين. ويمكن تبعا لنوع من الزجاجات الدوارة المستخدمة بحد أقصى 3-6 أجنة يتم تحميلها في كل زجاجة.
- نقل الأجنة باستخدام ماصة الخاص لخفض الزجاجة الدوارة وسائل الإعلام مليئة ، كما تحمل اكثر من Tyrodes أقل قدر ممكن حتى لا تضعف وسائل الإعلام
- إرفاق المكونات المطاطية (كدر) إلى الجزء العلوي من زجاجة الأسطوانة
- تضاف إلى الزجاجات الأسطوانة الأسطوانة أسطوانة الثقافة بحيث يتم تشكيل ختم محكم بين المكونات والطبلة
- بمجرد أن يتم إرفاق جميع الزجاجات ، وانه تم اغلاق أي فتحات فارغة في طبلة ثالسدادات المطاطية إيث ، وتفعيل الأسطوانة
- فتح CO 2 و O 2 الدبابات وتكييفها مع ما يقرب من 2 رطل ، بحيث صمام مأخذ هو الافراج عن واحد فقاعة في الثانية الواحدة. لE8.5 - E10 الأجنة ، ينبغي أن تستخدم 20 ٪ O 2 و 5 ٪ CO 2.
- ضمان أن يتم تعيين الحاضنة إلى 37 درجة مئوية ، وتغطي وثيقة أو الحاضنة بحيث يتم الأجنة محمية من الضوء.
- يجب فحص الأجنة دوريا لتقييم تنميتها من خلال إضافة somities ، تطور وتحول ، ومدى إغلاق الأنبوب العصبي
- بعد 2-3 ساعات في الثقافة ، يمكن إضافة مثبطات الدوائية أو العلاجات الأخرى إلى وسائل الإعلام
- ينبغي أن تشمل الدراسة تصميم الضوابط ، مثل السيارة أو نظائرها نشط من كاشف الدراسة.
6. تقييم وضع الجنين بعد ثقافة بأكملها
- إيقاف الغاز ، ووقف الدوارة ، وإزالة زجاجات من الحاضنة
- نقل الأجنة مرة أخرى إلى Tyrodeق أو برنامج تلفزيوني في طبق بيتري للتقييم بموجب stereomicroscope
- ينبغي أن يظهر كيس المح تشبه البالون ، ونبضات القلب وينبغي أن تكون واضحة ومعدل ضربات القلب وينبغي> 120 نبضة في الدقيقة ، وتداولها وينبغي أن يكون واضحا
- تصوير الأجنة قبل إزالة كيس المح إذا لزم الأمر
- إزالة الكيس المحي من الجنين عن طريق خفض حفرة بالقرب من EPC والتقليب كيس المح والسلى على رأسه والردف من الجنين.
- ويمكن قطع الحبل السري لفصل صفار كيس من الجنين ، ويمكن استخدام كيس المح عن التنميط الجيني للجنين إذا لزم الأمر.
- فحص الجنين لعدد الجسيدة وعيوب الأنبوب العصبي ، مثل فتح الجمجمة طيات ، وإغلاق كاملة للوجه و / أو العصبي فتح الذيلية. ويمكن أجنة نظموا وفقا لتصنيف تايلر من التغييرات تخلقية متعددة ( http://www.emouseatlas.org/ EMAP / home.html ) مرة أخرى ، وهو رقم قياسي من الصور الفوتوغرافيةتطور الجنين هو مفيد.
7. تلاحظ
- وتشريح عالية الجودة أمر ضروري ، لأن أي نك أو الدموع في الكيس المحي سيمنع تحول ناجحة وتمنع التطور الطبيعي. يمكن أيضا أن يكون معطوبا EPC خلال ازالة غشاء رايخرت (RM) ، وإذا تم فصل ولو جزئيا EPC من الكيس المحي والأجنة لن تتطور بشكل طبيعي. ومع ذلك ، يمكن إزالة كاملة للقضية الأجنة RM الى توحيد صفوفهم و / أو الخلايا قد اكتسى RM في الثقافة وانقباض الكيس المحي التوسع ، وكلاهما من شأنه أن يمنع النمو الطبيعي.
- ملقط نظيفة وحادة هي سر الحصول على تشريح جيد ، لأن ملقط مملة أو عازمة جعل الداخلي أكثر صعوبة بكثير. ودائع البروتين في الصكوك تؤدي إلى تلف الأنسجة.
- نظيفة والزجاجات معقمة ضرورية أيضا لمنع الأجنة من الالتصاق على الجدار الجانبية وتضررت الراهن. قبل بدء التجربة ، يجب أن تكون زجاجات SCRubbed بالصابون والماء ، وتشطف في DH 2 O ، والمايكرويف مع كمية صغيرة من الماء في كل زجاجة حتى يغلي الماء. ثم يتم شطف الزجاجات EtOH مع 70 ٪ والسماح للهواء الجاف.
- العمل في أسرع وقت ممكن ، لأن عاجلا يمكن نقل الجنين إلى وسائل الإعلام والثقافة ، وتحسنت مرة أخرى إلى 37 درجة مئوية وأفضل البقاء على قيد الحياة.
- تشريح كامل القمامة بالكامل قبل نقل الأجنة إلى أي زجاجات الأسطوانة بحيث أن كل جنين هو في درجة حرارة الغرفة لنفس المقدار من الوقت لتجنب خلق أي تباينات في نمو الجنين
- الحفاظ على بيئة معقمة لمنع التلوث الجرثومي من الثقافات. وقد أجريت تجارب ثقافتنا دون المضادات الحيوية ، ولكن العديد من المعامل إضافة المضادات الحيوية إلى وسائل الإعلام لمنع نمو البكتيريا. وينبغي أن تظهر واضحة على المديين المتوسط كما في نهاية التجربة كما كان في بداية التجربة. إذا أصبحت وسائل الإعلام غائما أو هناك يعجل مرئية ، من المحتمل أن يكون هناك يخدعtamination التي أصابت ثقافتك.
- ويمكن تبادل الغاز غير فعالة أيضا تأخير تنمية الأجنة ، لذلك يجب التأكد من أن منظم موثوق بها من شأنها أن تضمن تسليم المستمر.
- الأجنة تطوير ما يقرب من 50 ٪ أبطأ في الثقافة فيفو السابقين ، ولذلك فمن الضروري أن نعتمد somites لضمان أنك وصلت إلى مرحلة مناسبة للتنمية لاستكمال التجربة.
8. ممثل النتائج :
ظهور الأجنة قبل وثقافة ما بعد الدوارة هو موضح في الشكل 1. في وقت التشريح ، وينبغي أن تكون الأجنة في تكوين جهدا (الشكل 1A ، D) حيث الذيل وراء طيات الرأس. بعد 36 ساعة في الثقافة ، كان ينبغي أن أكملت تحول الأجنة بحيث تكون في موقف ، C - منحني الجنين ، حيث الذيل في مقدمة الرأس (الشكل 1B ، C ، E ، F). الدوائية التلاعب مع RhoA كيناز المانع (Y - 27632) ، مثبط معروفة من خلال تمديد المتقاربةneurulation (Ybot - غونزاليس ، 2007) ، والنتائج في تقصير من الأجنة على طول محور منقاري - الذيلية لهم (الشكل 1E ، F) ويمنع إغلاق الجمجمة أضعاف العصبية. البيانات المتوفرة لدينا تبين أن جرعات متزايدة من Y - 27632 يضعف تدريجيا اغلاق أضعاف الجمجمة (الشكل 2A) ، ويقصر محور الجسم (الشكل 2B) ، بما يتسق مع دور المصب RhoA يشير في الجمجمة والإرشاد neurulation المتقاربة.
الشكل 1. المظهر الأجنة الثقافات والتلاعب مع مثبط الدوائية Y - 27632. (أ ، د ،) في تشريح الأجنة E8.5 الجنين قبل ثقافة بأكملها (B ، E) أجنة في E10 مع الكيس لا تزال سليمة صفار ، بعد 36hrs الثقافة الدوارة. (C ، F) تمت إزالة كيس المح لتوضيح تحول ناجح وإغلاق الأنبوب العصبي. فشل الأجنة التي كانت تعامل مع مثبط كيناز رو Y - 27632 (E ، F) للخضوع لتمديد المتقاربة السليم وتوضيحمحور الجسم تقصير.
الشكل 2. تأثير مثبط كيناز RhoA على الجمجمة إغلاق الأنبوب العصبي واستطالة المحور. (أ) تتم مقارنة النسبة المئوية للأجنة التي كانت قادرة على إغلاق بنجاح طيات هذه الجمجمة (NTC ٪ = النسبة المئوية إغلاق الأنبوب العصبي) إلى جرعة من Y - 27632 إضافة إلى وسائل الإعلام الثقافة. (ب) وخفضت بشكل كبير المسافة بين الحويصلة الأذنية وforelimb بجرعات متزايدة من Y - 27632 (ع <0.05).
Discussion
القدرة على فصل الأمهات ، وعوامل داخل الرحم من تلك التي هي متأصلة في جنين خلال عملية وضعه هو أداة هامة لدراسة جميع مراحل تكوين الجنين. هنا قمنا بتحليل آثار مثبط جزيء صغير من كيناز RhoA على الجمجمة neurulation الرحم السابقين ، من شأنه أن يزيل متغير من الأمهات استقلاب الدواء. هذا التلاعب الدوائي له تأثير عميق على neurulation الجمجمة والإرشاد المتقاربة. ويمكن مقارنة الحساسية لهذا المركب بين مختلف المسوخ الماوس الوراثية. ويمكن أيضا أسلوب المعروضة هنا يمكن تطبيقها على دراسات المسارات الجزيئية الأخرى في مجال التنمية ، والسماح للتلاعب مباشرة من وظيفة الخلايا في الأجنة باستخدام مجموعة متنوعة من الكواشف.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر مختبر Hadjantonakis A. (معهد سلون كيترينج) ومختبر Niswander L. (U - دنفر كولورادو) للحصول على المشورة المفيدة مع تقنيات التشريح والثقافة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل NRSA NS059562 لJDG وRO1NS05897 لمير بالتعاون مع Niswander لام وياء نادو (معهد بيولوجيا الأنظمة).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope for Dissection | Leica Microsystems | M165 | |
| Precision Incubator | BTC Engineering | BTC 001 | |
| Rotating Bottle Culture Unit | BTC Engineering | BTC 003 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | BTC Engineering | BTC 005 | |
| Silicone Rubber Bung | BTC Engineering | BTC 007 | |
| Silicone Rubber Cork | BTC Engineering | BTC 008 | |
| Gas Bubbler Inlet | BTC Engineering | BTC 012 | |
| Gas Bubbler Inlet Trap | BTC Engineering | BTC 013 | |
| Gas Bubbler Outlet | BTC Engineering | BTC 014 | |
| Gas Cylinder | Tech Air | 20% O2, 5% CO2 | |
| Gas Regulator | Tech Air | ||
| Male Rat Serum | Harlan Laboratories | 4520 | |
| DMEM w/o phenol red | Invitrogen | 31053 | |
| 10 mL Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe Filter | Nalge Nunc international | 190-2545 | |
| Large Dissecting Scissors (Blunt tip) | VWR international | 82027-594 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dumot #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Tyrode’s Saline | As described in Cockroft 1990 | ||
| 10 cm Disposable Petri Dish | BD Biosciences | 351029 |
References
- Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. (1990).
- Gray, J. D., Ross, M. E. Mechanistic insights into folate supplementation from Crooked tail and other NTD-prone mutant mice. Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 85, 314-321 (2009).
- Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. , Academic Press Limited. San Diego. (1992).
- Ybot-Gonzalez, P., Savery, D., Gerrelli, D., Signore, M., Mitchell, C. E., Faux, C. H., Greene, N. D., Copp, A. J. Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure. Development. 134, 789-799 (2007).
- Ross, M. E. Gene-environment interactions, folate metabolism and the embryonic nervous system. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2, 471-480 (2010).
