Summary
Un método que permite la manipulación directa farmacológico de embriones de ratón durante la neurulación que no pasa por el metabolismo materno se describe. La técnica se puede adaptar a estudiar diferentes aspectos de la neurulación variando el punto en el tiempo y el agente farmacológico.
Abstract
Modelos genéticos de ratón son una herramienta importante en el estudio de los mamíferos cierre del tubo neural (Gray & Ross, 2009; Ross, 2010). Sin embargo, el estudio de los embriones de ratón en el útero está limitada por nuestra incapacidad de manipular farmacológicamente directamente a los embriones en el aislamiento de los efectos del metabolismo materno en el reactivo de interés. Si el uso de una pequeña molécula, la proteína recombinante, o siRNA, la entrega de estas sustancias a la madre, a través de la dieta o por inyección someterá estos compuestos inestables a una variedad de defensas corporales que podrían impedir que lleguen al embrión. Las investigaciones en cultivos de embriones enteros se pueden utilizar para separar la madre de la intrínseca efectos sobre el feto en desarrollo.
A continuación, presentamos un método para el cultivo de embriones de ratón utilizando los medios de comunicación altamente enriquecido en un aparato giratorio incubadora que permite el cierre normal del tubo neural después de la disección (Crockett, 1990). Una vez en la cultura, los embriones puedenser manipulado utilizando técnicas in vitro convencional que de otro modo no sería posible si los embriones estaban todavía en el útero. Los hermanos de embriones se pueden recoger en diversos puntos de tiempo para estudiar diferentes aspectos de la neurulación, que se producen a partir de E7-7.5 (formación de placa de los nervios, justo antes del inicio de la neurulación) a E9.5-10 (en la conclusión del neuroporo craneal y caudal veces cierre, Kaufman, 1992). En este protocolo, demostramos nuestro método para la disección de embriones en los puntos de tiempo que son óptimas para el estudio de la neurulación craneal. Los embriones serán disecados en E8.5 (aprox. 10-12 somities), después del inicio del cierre del tubo neural, pero antes de cumplir los embriones y el cierre del cráneo veces neural, y se mantienen en cultivo hasta E10 (26-28 somities), cuando craneal neurulación debe ser completa.
Protocol
1. Preparación de medios de cultivo - todos los reactivos se enumeran en la Tabla 1
- Descongelar el suero de ratas machos a 37 ° C.
- El calor inactiva suero de rata durante 30 minutos a 55 ° C
- Centrifugar el suero de rata a 10 km por 5 minutos a temperatura ambiente
- Quitar 50:50 sobrenadante y se mezcla con rojo fenol w DMEM libre / de glucosa
- Esterilizar los medios de comunicación utilizando un filtro de 0,45 um jeringa
- Por lo menos 1 ml de los medios de comunicación / embriones debe estar preparado
2. Aislamiento del útero de la madre embarazada
- Utilizando los procedimientos aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo (IACUC), la presa embarazada por primera vez anestesiados y luego sacrificados por dislocación cervical
- Esterilizar el abdomen con un 70% EtOH
- Una pizca de un pequeño camino de la piel a lo largo de la línea media, justo encima de la línea de los pezones, con unas pinzas grandes y abrir el abdomen por debajo de sus pinzas con unas tijeras grandes. Tenga cuidado de no dañar ninguna estructura internas
- Use las tijeras para cortar lateralmente desde la apertura inicial a cada lado del ratón para que el abdomen está abierto
- Intestinos y el exceso de depósitos de grasa a menudo pueden oscurecer el útero y estos deben ser trasladados a un lado para que la parte superior del útero y los ovarios se puede observar en cada lado
- Apriete la parte superior del útero por debajo de los ovarios y el uso de las tijeras para separar el útero de la grasa, el corte de un extremo del útero para el otro ovario
- Levante el útero con sus pinzas y colocar en una placa de Petri con solución salina
3. La eliminación de los embriones en el útero
- Enjuague el útero con una solución salina para eliminar cualquier exceso de sangre y recortar cualquier exceso de grasa desde el exterior
- Transferir a un plato limpio con la temperatura ambiente. Tyrodes solución salina para mejorar la visualización
- El uso de un microscopio estereoscópico, separe cada embrión utilizando unas tijeras pequeñas o si bien es necesario (# 5) pinzas para pelar cuidadosamente el útero de distancia. <li> Insertar pinzas finas en el espacio entre la pared del útero y la decidua y despegue de la pared uterina, teniendo cuidado de no perforar el embrión
4. La eliminación de decidua a partir de embriones
- Orientar la decidua forma que la parte más oscura (la placenta) se enfrenta lejos de ti
- Hacer una incisión con pinzas a lo largo de la línea que separa la parte oscura de la decidua de la parte más ligera, con cuidado de no cortar demasiado profundamente
- Completar la separación de la placenta de la parte superior del saco vitelino, teniendo cuidado de no romper el ectoplacental cono (EPC). En este punto usted debería ser capaz de visualizar la membrana Reicherts en el saco vitelino
- Continuar para eliminar toda la decidua (más claro de la porción) teniendo cuidado de no perforar el saco vitelino
- Pellizque suavemente y eliminar el Reicherts retirándola de la EPC. Si el EPC está dañado o separado del saco vitelino, los embriones no podrán a su vez, normalmente, de E8.5-E9.5
5. Configuración del sistema de cultivo
- Corte el extremo de una pipeta de transferencia de plástico con unas tijeras para aumentar el diámetro de la apertura para que un embrión puede ser una pipeta sin dañar el saco vitelino
- Llenar botellas limpias de rodillos con 1 ml de los medios de comunicación por embrión. Dependiendo del tipo de las botellas de rodillo utilizado un máximo de 3-6 embriones se pueden cargar en cada botella.
- La transferencia de los embriones con la pipeta de corte a la botella llena de medios de comunicación de rodillos, llevando el cargo de Tyrodes menos posible para no diluir los medios de comunicación
- Coloque el tapón de goma (tapón) de la parte superior de la botella de vidrio de rodillos
- Introduzca los frascos rotatorios en el tambor la cultura rusa para que un sello hermético se forma entre el tapón y el tambor
- Una vez que todas las botellas se han unido, y cualquier espacio vacío en el tambor han sido sellados wtapones de goma ITH, activar el rodillo
- Abrir el CO 2 y O 2 tanques y ajustarlos a aproximadamente 2 psi, por lo que la válvula de salida es la liberación de una burbuja por segundo. Por E8.5-E10 embriones, el 20% de O 2 y el 5% de CO 2 se debe utilizar.
- Asegúrese de que la incubadora se encuentra a 37 ° C y la cubierta o cerca de la incubadora para que los embriones están protegidos de la luz.
- Los embriones deben ser revisadas periódicamente para evaluar su desarrollo mediante la adición de somities, la progresión de la gira, y en la medida de cierre del tubo neural
- Después de 2-3 horas en la cultura, los inhibidores farmacológicos u otros tratamientos se pueden añadir a los medios de comunicación
- El diseño del estudio debe incluir controles, tales como vehículos o análogos inactivos de reactivo de estudio.
6. Evaluación del desarrollo de cultivo de embriones después de todo
- Desconectar el gas, dejar de rodillos, y sacar las botellas de la incubadora
- Embriones traslado de regreso a Tyrodes o PBS en una placa de Petri para su evaluación bajo microscopio estereoscópico
- El saco vitelino debe aparecer en forma de globo, un latido del corazón debe ser visible y la frecuencia cardiaca debe ser> 120 latidos por minuto, y la circulación debe ser evidente
- Fotografía embriones antes de la yema de la eliminación del saco, si es necesario
- Retire del saco vitelino del embrión mediante la reducción de un agujero cerca de la EPC y voltear el saco vitelino y el amnios en la cabeza y la cola del embrión.
- El cordón umbilical se puede cortar para separar el saco vitelino del embrión y el saco vitelino se puede utilizar para determinar el genotipo del embrión, si es necesario.
- Examinar el embrión para el número de somitas y defectos del tubo neural, tales como abrir los pliegues del cráneo, cierre incompleto de la cara y / o un neuroporo caudal abierto. Los embriones se pueden clasifican de acuerdo a la clasificación de los cambios morfogenéticos Theiler múltiples ( EMAP http://www.emouseatlas.org/ / home.html ) Una vez más, un registro fotográfico deel desarrollo del embrión es útil.
7. Notas
- Una disección de alta calidad es esencial, ya que cualquier nick o desgarros en el saco vitelino evitará convertir con éxito e inhiben el desarrollo normal. El EPC también pueden ser dañados durante la remoción de la membrana de Reichert (RM), y si el CPE es aún parcialmente separado del saco vitelino, los embriones no se desarrollan normalmente. Sin embargo, la eliminación incompleta de la RM puede causar embriones se peguen y / o células RM puede crecer en la cultura y la yema de constreñir la expansión del saco, tanto de lo que impediría el desarrollo normal.
- Pinzas limpias y afiladas son el secreto para conseguir una buena disección, porque fórceps sordo o doblados que el procedimiento sea mucho más difícil. Depósitos de proteínas en los instrumentos que van a afectar los tejidos.
- Botellas limpias, estériles de vidrio también son esenciales para evitar que los embriones se peguen a la pared lateral y se dañe. Antes de comenzar el experimento, las botellas deben ser scrubbed con agua y jabón, enjuagarse en dH 2 O, y el microondas con un poco de agua en cada botella hasta que el agua hierva. Las botellas se enjuagan con EtOH al 70% y dejar secar al aire.
- El trabajo lo más rápido posible, porque cuanto antes el embrión puede ser transferido a los medios de cultivo y se calienta de nuevo a 37 ° C la mejor supervivencia.
- Completa disección de toda la camada antes de transferir los embriones a las botellas de rodillos a fin de que cada embrión es a temperatura ambiente durante la misma cantidad de tiempo para evitar la creación de cualquier discrepancia en el crecimiento del embrión
- Mantener un ambiente estéril para evitar la contaminación bacteriana de las culturas. Nuestros experimentos de cultivo se han realizado sin antibiótico, pero muchos laboratorios añadir antibióticos a los medios de comunicación para prevenir el crecimiento bacteriano. El medio debe aparecer tan clara en el final del experimento como lo fue al comienzo del experimento. Si los medios de comunicación se ha convertido en turbia o si es un precipitado visible, es probable que una estafacontaminación que ha infectado su cultura.
- El intercambio gaseoso ineficaz también puede retrasar el desarrollo de embriones, así que asegúrese de tener un regulador fiable que garantice la prestación continua.
- Embriones se desarrollan aproximadamente el 50% más lento en la cultura ex vivo, por lo tanto es imprescindible contar con somitas para asegurarse de que han alcanzado la fase de desarrollo apropiado para la realización del experimento.
8. Los resultados representativos:
La aparición de pre-embriones y la cultura post-rusa se ilustra en la Figura 1. En el momento de la disección, los embriones debe estar en una configuración sin mover (Fig. 1A, D), donde la cola se encuentra detrás de los pliegues de la cabeza. Después de 36 horas en la cultura, los embriones deben haber completado vuelta para que estén en la C-curvas, posición fetal, donde la cola se encuentra en frente de la cabeza (Fig. 1B, C, E, F). La manipulación farmacológica con RhoA inhibidor de la cinasa (Y-27632), un conocido inhibidor de la extensión convergente enneurulación (Ybot-González, 2007), resulta en un acortamiento de los embriones a lo largo de su eje rostral-caudal (Fig. 1E, F) e inhibe el cierre del cráneo veces neural. Nuestros datos muestran que las dosis crecientes de Y-27632 progresivamente afecta el cierre veces craneal (Figura 2A) y se acorta el eje del cuerpo (Fig. 2B), en consonancia con el papel de RhoA aguas abajo de señalización en la neurulación del cráneo y la extensión convergente.
Figura 1. La aparición de embriones y la manipulación de las culturas con el inhibidor farmacológico Y-27632. (A, D) los embriones disecados en E8.5 antes de que el cultivo de embriones enteros (B, E) Los embriones en E10 con el saco vitelino sigue intacta, después de 36hrs de la cultura rusa. (C, F) El saco vitelino se ha eliminado para ilustrar el éxito de inflexión y el cierre del tubo neural. Los embriones que fueron tratados con el inhibidor de la Rho quinasa Y-27632 (E, F) no someterse a la extensión convergente adecuada e ilustrarun cuerpo reducido eje.
Figura 2. Efecto del inhibidor de la cinasa RhoA en el cierre del tubo neural craneal y el alargamiento del eje. (A) El porcentaje de embriones que fueron capaces de cerrar con éxito sus pliegues craneal (NTC% = porcentaje de cierre del tubo neural) se compara con la dosis de Y-27632 añadido al medio de cultivo. (B) La distancia entre la vesícula ótica y extremidad anterior se redujo significativamente a dosis crecientes de Y-27632 (p <0,05).
Discussion
La capacidad de separar los factores maternos, intrauterina de los que son intrínsecos al embrión durante su desarrollo es una importante herramienta para el estudio de todas las etapas de la embriogénesis. Aquí hemos analizado los efectos de un inhibidor de molécula pequeña de quinasa RhoA en el útero craneal ex neurulación, eliminando así la variable del metabolismo de la madre de la droga. Esta manipulación farmacológica tiene un profundo efecto en la neurulación del cráneo y la extensión convergente. La sensibilidad a este compuesto se puede comparar entre los diferentes mutantes de ratón genético. El método presentado aquí también se puede aplicar a los estudios de otras vías moleculares en el desarrollo, permitiendo la manipulación directa de la función celular en embriones usando una variedad de reactivos.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias al laboratorio de A. Hadjantonakis (Sloan-Kettering Institute) y el laboratorio de L. Niswander (U of Colorado-Denver) para consejos útiles con las técnicas de disección y la cultura. Este trabajo ha sido financiado por el NRSA NS059562 a JDG y RO1NS05897 de MER en colaboración con L. y J. Niswander Nadeau (Instituto de Biología de Sistemas).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope for Dissection | Leica Microsystems | M165 | |
| Precision Incubator | BTC Engineering | BTC 001 | |
| Rotating Bottle Culture Unit | BTC Engineering | BTC 003 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | BTC Engineering | BTC 005 | |
| Silicone Rubber Bung | BTC Engineering | BTC 007 | |
| Silicone Rubber Cork | BTC Engineering | BTC 008 | |
| Gas Bubbler Inlet | BTC Engineering | BTC 012 | |
| Gas Bubbler Inlet Trap | BTC Engineering | BTC 013 | |
| Gas Bubbler Outlet | BTC Engineering | BTC 014 | |
| Gas Cylinder | Tech Air | 20% O2, 5% CO2 | |
| Gas Regulator | Tech Air | ||
| Male Rat Serum | Harlan Laboratories | 4520 | |
| DMEM w/o phenol red | Invitrogen | 31053 | |
| 10 mL Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe Filter | Nalge Nunc international | 190-2545 | |
| Large Dissecting Scissors (Blunt tip) | VWR international | 82027-594 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dumot #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Tyrode’s Saline | As described in Cockroft 1990 | ||
| 10 cm Disposable Petri Dish | BD Biosciences | 351029 |
References
- Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. (1990).
- Gray, J. D., Ross, M. E. Mechanistic insights into folate supplementation from Crooked tail and other NTD-prone mutant mice. Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 85, 314-321 (2009).
- Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. , Academic Press Limited. San Diego. (1992).
- Ybot-Gonzalez, P., Savery, D., Gerrelli, D., Signore, M., Mitchell, C. E., Faux, C. H., Greene, N. D., Copp, A. J. Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure. Development. 134, 789-799 (2007).
- Ross, M. E. Gene-environment interactions, folate metabolism and the embryonic nervous system. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2, 471-480 (2010).
