Summary
שיטה המאפשרת מניפולציה תרופתי ישירה של עוברי עכברים במהלך neurulation עוקף מטבוליזם אימהית מתואר. הטכניקה ניתן להתאים ללמוד היבטים שונים של neurulation על ידי שינוי נקודת זמן סוכן תרופתי.
Abstract
מודלים העכבר גנטית הם כלי חשוב במחקר הסגר יונקים בצינור העצבי (Gray & Ross, 2009; רוס, 2010). עם זאת, המחקר של עוברים ברחם העכבר הוא מוגבל על ידי חוסר היכולת שלנו ישירות פרמקולוגית לתפעל את העוברים במנותק מן ההשפעות של מטבוליזם אימהית על מגיב של עניין. בין אם באמצעות מולקולה קטנה, חלבון רקומביננטי, או siRNA, אספקה של חומרים אלה לאם, באמצעות תזונה או על ידי הזרקת יהיה כפוף התרכובות הללו יציבים למגוון ההגנות גוף שיכול למנוע מהם להגיע אל העובר. חקירות בתרבויות של עוברים כל יכול לשמש כדי להפריד אימהית מפני השפעות על התפתחות העובר מהותי.
כאן, אנו מציגים שיטה עכבר עוברים culturing באמצעות מדיה מועשר במנגנון הרים החממה המאפשר סגירת נורמלי בצינור העצבי לאחר דיסקציה (קרוקט, 1990). לאחר בתרבות, עוברי יכוללטפל באמצעות קונבנציונאלי בטכניקות חוץ גופית כי שאחרת לא יהיה אפשרי אם העוברים היו עדיין ברחם. אחים עובריים ניתן לאסוף בנקודות זמן שונות כדי לחקור היבטים שונים של neurulation, המתרחשים מ-E7 7.5 (היווצרות צלחת עצביים, זמן קצר לפני תחילתו של neurulation) כדי E9.5-10 (בסיום neuropore לקפל הזנב גולגולתי הסגר, קאופמן, 1992). בפרוטוקול זה, אנחנו מדגימים את השיטה שלנו לנתח עוברים על timepoints כי הם אופטימליים ללימוד neurulation גולגולתי. עוברים יהיה גזור על E8.5 (כ 10-12 somities), לאחר תחילת הסגר בצינור העצבי אבל לפני הפיכת העובר ואת הגולגולת סגירה לקפל עצביים, ומתוחזק בתרבות עד E10 (26-28 somities), כאשר הגולגולת neurulation צריכה להיות מלאה.
Protocol
1. הכנה של התקשורת בתרבות - כל ריאגנטים מפורטים בטבלה 1
- חולדה זכר הפשירי בסרום על 37 ° C.
- חום להשבית בסרום חולדה במשך 30 דקות ב 55 מעלות צלזיוס
- עכברוש צנטריפוגה בסרום ב 10K במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר
- הסר 50:50 supernatant ומערבבים עם פנול אדום חופשי DMEM w / גלוקוז גבוהות
- לעקר את התקשורת באמצעות מסנן 0.45 מזרק אממ
- לפחות 1ml של התקשורת / העובר צריכים להיות מוכנים
2. בידוד של הרחם מן הסכר בהריון
- באמצעות נהלים שאושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC), הסכר בהריון הוא הרדים הראשון הקריב מכן על ידי נקע בצוואר הרחם
- לעקר את הבטן עם EtOH 70%
- קורט נתיב קטן של העור לאורך קו האמצע, בדיוק מעל קו הפטמה, עם מלקחיים גדולים לפתוח את הבטן מתחת מלקחיים שלך עם מספריים גדולות. היזהר שלא כל נזק למבנה הפנימיs
- השתמש במספריים שלך לחתוך רוחבית מפתיחת הראשונית כלפי צד של העכבר כך את הבטן כולה פתוחה
- מעיים רפידות שומן עודף יכול לעתים לטשטש את הרחם ואת אלה צריך להיות כך זז הצידה את החלק העליון של הרחם והשחלות ניתן לצפות בכל צד
- צבוט את החלק העליון של הרחם מתחת השחלות ולהשתמש מספריים שלך להפריד את הרחם מן השומן, חיתוך מקצה אחד של הרחם אל השחלה אחרים
- הרם את הרחם עם מלקחיים שלך במקום בצלחת פטרי עם תמיסת מלח
3. הסרת עוברים מן הרחם
- יש לשטוף את הרחם עם מלח כדי להסיר כל דם עודף לקצץ כל עודפי השומן מבחוץ
- העברה צלחת נקייה עם טמפ 'החדר. תמיסת מלח כדי לשפר להדמיה Tyrodes
- שימוש stereomicroscope נפרד כל העובר או באמצעות מספריים קטנים, או אם יש צורך בסדר (# 5) מלקחיים בזהירות את קליפת הרחם מזה. <li> הכנס מלקחיים עדין אל תוך החלל שבין קיר הרחם ואת decidua וקליפת בחזרה דופן הרחם, נזהרים שלא לנקב את העובר
4. הסרת decidua מעוברים
- אוריינט decidua כך את החלק כהה (השליה) פונה ממך
- עושים חתך עם מלקחיים שלך לאורך הקו המפריד בין החלק הכהה של decidua מחלק את המצית, נזהרים שלא לחתוך עמוק מדי
- השלם את הפרדת השליה מהחלק העליון של שק החלמון, נזהרת שלא לקרוע את חרוט ectoplacental (EPC). בשלב זה אתה אמור להיות מסוגל לדמיין את קרום Reicherts על שק החלמון
- המשך להסיר את decidua כולה (חלק בהיר) נזהרים שלא לנקב את שק החלמון
- בעדינות קמצוץ ולהסיר את Reicherts ידי לקלף אותה הרחק EPC. אם EPC פגום או להפריד את שק החלמון, עוברים ייכשל לפנות בדרך כלל מ-E8.5 E9.5
5. הגדרת מערכת התרבות
- חותכים את הקצה של טפטפת העברת פלסטיק במספריים כדי להגדיל את הקוטר של הפתח, כך העובר יכול להיות pipetted מבלי לפגוע שק החלמון
- מילוי בקבוקי רולר נקי עם 1 מ"ל של התקשורת לכל העובר. בהתאם לסוג בקבוקי רולר בשימוש מרבי של 3-6 עוברים יכול להיות טעון בבקבוק אחד.
- מעבירים את העוברים באמצעות פיפטה לחתוך שלך בקבוק התקשורת מילאה את מכבש, נושאת על כמו Tyrodes שפחות כדי לא לדלל את התקשורת
- צרף את התקע גומי (פקק) לחלק העליון של בקבוק זכוכית רולר
- הכנס את בקבוקי רולר לתוך התוף תרבות רולר, כך חותם הדוק נוצר בין התקע ואת תוף
- לאחר כל הבקבוקים היו מחוברים, וכל משבצות ריקות התוף כבר חתום wפקקים גומי ith, להפעיל את מכבש
- פתח CO 2 ו-O 2 טנקים ולהתאים אותם כ 2 psi, כך שסתום היציאה מפרסמת בועה לשנייה. עבור E8.5-E10 עוברים, 20% O 2 ו - 5% CO 2 אמור לשמש.
- ודא החממה מוגדר 37 ° C ו לכסות או לסגור את החממה כך עוברים מוגנים מפני האור.
- עוברים צריך להיבדק באופן תקופתי כדי להעריך את התפתחותם על ידי תוספת של somities, את ההתקדמות של מפנה, והיקף הסגר בצינור העצבי
- לאחר 2-3 שעות בתרבות, מעכבי תרופתי או טיפולים אחרים ניתן להוסיף אמצעי התקשורת
- מערך המחקר צריכה לכלול בקרות, כגון כלי רכב או אנלוגים פעיל של מגיב המחקר.
6. לאחר הערכת התפתחות התרבות העובר כולו
- כיבוי גז, להפסיק רולר, ולהסיר בקבוקים מן החממה
- עוברי העברה בחזרה Tyrodes או PBS בצלחת פטרי להערכת תחת stereomicroscope
- שק החלמון אמור להופיע בלון דמוי, הלב צריך להיות גלוי קצב הלב צריך להיות> 120 פעימות לדקה, ומחזור הדם צריך להיות ברור
- צילום עוברי לפני הסרת שק החלמון במידת הצורך
- הסר שק חלמון מעובר על ידי חיתוך חור ליד EPC ו מעיפה את שק החלמון ואת amnion מעל הראש עכוז של העובר.
- חבל הטבור ניתן לחתוך כדי להפריד את שק החלמון של העובר ואת שק החלמון יכול לשמש genotyping את העובר במקרה הצורך.
- בדוק את העובר במשך מספר somite ו למומים בצינור העצבי, כגון קפלי הגולגולת פתוחה, סגר חלקי של הפנים ו / או neuropore הזנב פתוח. עוברים יכול להיות מבוים על פי הסיווג Theiler שינויים המוךפו"גנטי שהולך מרובים ( http://www.emouseatlas.org/ eMap / home.html ) שוב, תיעוד מצולם שלהתפתחות העובר היא שימושית.
7. הערות
- דיסקציה באיכות גבוהה היא חיונית, כי כל ניק או דמעות של שק החלמון תמנע הפיכת מצליח לעכב התפתחות תקינה. EPC יכול גם להיות פגום במהלך הסרת הממברנה של רייכרט (RM), ואם EPC מופרד גם חלקית של שק החלמון, עוברים לא יפתחו כלל. עם זאת, ההסרה לא מושלמת של RM יכול לגרום עוברים להישאר ביחד ו / או תאים RM עשוי לגדול יותר בתרבות להצר הרחבת שק חלמון, אשר שניהם ימנע התפתחות תקינה.
- מלקחיים נקי וחד הם הסוד מקבל לנתיחה טוב, כי משעמם או מלקחיים כפוף להפוך את הליך משמעותי יותר קשה. פיקדונות חלבון על מכשירים יוביל נזק לרקמות.
- נקי, בקבוקי זכוכית סטרילית גם חיוני כדי למנוע עוברים יידבקו אל הקיר בצד היותו פגום. לפני תחילת הניסוי, בקבוקי צריך להיות scrubbed עם מים וסבון, ושטף DH 2 O, ו במיקרוגל עם כמות קטנה של מים בבקבוק אחד עד שהמים ירתחו. בקבוקים הם שטופים אז EtOH עם 70% ו מותר אוויר יבש.
- עבודה מהר ככל האפשר, כי במוקדם העובר ניתן להעביר בתקשורת תרבות חיממו בחזרה 37 מעלות צלזיוס הישרדות טובים יותר.
- השלם לנתח את החול כולו לפני העברת כל העוברים על בקבוקי רולר כך עובר כל בטמפרטורת החדר למשך אותו פרק זמן ולהימנע מיצירת פערים בצמיחה העובר
- יש לשמור על סביבה סטרילית על מנת למנוע זיהום חיידקי של התרבויות. ניסויים בתרבות שלנו בוצעו ללא אנטיביוטיקה, אבל במעבדות רבות להוסיף אנטיביוטיקה התקשורת שלהם על מנת למנוע התפתחות חיידקים. המדיום אמור להופיע ברורה בסוף הניסוי כפי שהיה בתחילת הניסוי. אם התקשורת הפכה מעוננים או שיש לזרז גלוי, יש סיכוי קוןtamination כי נגוע בתרבות שלך.
- חילוף הגזים יעיל יכול גם לעכב את התפתחות העובר, כדי להיות בטוח יש וסת אמין שיבטיחו אספקה רציפה.
- עוברים לפתח כ -50% איטי יותר בתרבות vivo לשעבר, ולכן זה חיוני לספור somites כדי לוודא שאתה הגיעו לשלב ההתפתחות המתאים להשלמת הניסוי.
8. נציג תוצאות:
הופעתו של עוברי טרום ופוסט מכבש התרבות מתוארת באיור 1. בזמן דיסקציה, עוברים צריכה להיות בתצורה הפוכה (איור 1 א, ד) שבו הזנב עומד מאחורי קפלי הראש. לאחר 36 שעות בתרבית, עוברי צריך להשלים מפנה, כך שהם נמצאים בעמדה, C-מעוקל העובר, שבו הזנב מול הראש (איור 1B, C, E, F). מניפולציה תרופתי עם RhoA קינאז מעכב (Y-27632), מעכב ידוע של הרחבה מתכנסת במהלךneurulation (Ybot-גונזלס, 2007), התוצאה היא קיצור של העוברים בציר שלהם מקורי, הזנב (איור 1E, F) ומעכב גולגולתי סגר לקפל עצביים. הנתונים שלנו מראים כי מינון גדל והולך של Y-27632 בהדרגה פוגעת סגר לקפל גולגולתי (איור 2A) ומקצרת את ציר הגוף (איור 2 ב), עולה בקנה אחד עם תפקידו של הזרם RhoA איתות neurulation גולגולת הרחבה מתכנסת.
באיור 1. מראה של עוברים תרבויות מניפולציה עם מעכב תרופתי Y-27632. (A, D) עוברים גזור על E8.5 לפני תרבות שלמה העובר (B, E) עוברים על E10 עם שק החלמון עדיין שלם, לאחר 36hrs של התרבות הרים. (C, F) שק חלמון הוסר כדי להמחיש מפנה מוצלחת הסגר בצינור העצבי. עוברים אשר טופלו עם Rho קינאז מעכב Y-27632 (E, F) הצליחה לעבור הרחבה מתכנסת נכונה להמחישציר הגוף מקוצר.
איור 2. השפעת מעכבי קינאז RhoA על סגירת הגולגולת בצינור העצבי ואת התארכות ציר. (א) אחוז עוברים כי היו מסוגלים בהצלחה קרוב קפלי הגולגולת שלהם (% NTC = סגירת הצינור העצבי אחוז) בהשוואה למינון של Y-27632 הוסיף התקשורת והתרבות. (ב) המרחק בין שלפוחית forelimb otic ו צומצם משמעותית במינון הולך וגדל של Y-27632 (p <0.05).
Discussion
היכולת להפריד בין האם, גורמים תוך רחמי מאלה מהותי לעובר במהלך התפתחותו הוא כלי חשוב ללימוד כל שלבי embryogenesis. כאן יש לנו ניתחו את ההשפעות של מעכבי מולקולה קטנה של קינאז RhoA על ברחם neurulation גולגולתי לשעבר, ובכך להסיר את חילוף החומרים משתנה האימהי של התרופה. זו מניפולציה תרופתי יש השפעה עמוקה על neurulation גולגולת הרחבה מתכנסת. רגישות תרכובת זו ניתן להשוות בין שונות גנטית עכברים מוטנטים. השיטה המוצגת כאן יכול להיות מיושם גם על מחקרים של מסלולים מולקולריים אחרים בפיתוח, המאפשר מניפולציה ישירה של פונקציית הסלולר עוברים באמצעות מגוון של חומרים כימיים.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
ברצוננו להודות מעבדה של א Hadjantonakis (סלואן קטרינג המכון) ואת המעבדה של ל Niswander (U קולורדו, דנבר) עבור עצות מועילות עם טכניקות לנתיחה ותרבות. עבודה זו נתמכה על ידי NRSA NS059562 כדי JDG ו RO1NS05897 כדי MER בשיתוף עם L. Niswander וג' Nadeau (המכון Systems Biology).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope for Dissection | Leica Microsystems | M165 | |
| Precision Incubator | BTC Engineering | BTC 001 | |
| Rotating Bottle Culture Unit | BTC Engineering | BTC 003 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | BTC Engineering | BTC 005 | |
| Silicone Rubber Bung | BTC Engineering | BTC 007 | |
| Silicone Rubber Cork | BTC Engineering | BTC 008 | |
| Gas Bubbler Inlet | BTC Engineering | BTC 012 | |
| Gas Bubbler Inlet Trap | BTC Engineering | BTC 013 | |
| Gas Bubbler Outlet | BTC Engineering | BTC 014 | |
| Gas Cylinder | Tech Air | 20% O2, 5% CO2 | |
| Gas Regulator | Tech Air | ||
| Male Rat Serum | Harlan Laboratories | 4520 | |
| DMEM w/o phenol red | Invitrogen | 31053 | |
| 10 mL Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe Filter | Nalge Nunc international | 190-2545 | |
| Large Dissecting Scissors (Blunt tip) | VWR international | 82027-594 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dumot #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Tyrode’s Saline | As described in Cockroft 1990 | ||
| 10 cm Disposable Petri Dish | BD Biosciences | 351029 |
References
- Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. (1990).
- Gray, J. D., Ross, M. E. Mechanistic insights into folate supplementation from Crooked tail and other NTD-prone mutant mice. Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 85, 314-321 (2009).
- Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. , Academic Press Limited. San Diego. (1992).
- Ybot-Gonzalez, P., Savery, D., Gerrelli, D., Signore, M., Mitchell, C. E., Faux, C. H., Greene, N. D., Copp, A. J. Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure. Development. 134, 789-799 (2007).
- Ross, M. E. Gene-environment interactions, folate metabolism and the embryonic nervous system. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2, 471-480 (2010).
