Neurale buis sluiting in Mouse Whole Embryo Cultuur

Summary

Een methode waardoor de directe farmacologische manipulatie van muis embryo's tijdens neurulatie dat maternale metabolisme omzeilt wordt beschreven. De techniek kan worden aangepast aan de verschillende aspecten van de neurulatie studie door het variëren van het tijdstip en farmacologische agent.

Abstract

Genetische muismodellen zijn een belangrijk instrument in de studie van zoogdieren neurale buis sluiting (Gray & Ross, 2009; Ross, 2010). Echter, is de studie van muis embryo's in utero beperkt door ons onvermogen om direct farmacologisch de embryo's los manipuleren van de effecten van maternale metabolisme op het reagens van belang. Of het nu gaat met behulp van een klein molecuul, recombinant eiwit of siRNA, de levering van deze stoffen aan de moeder, via de voeding of door injectie zal onderwerpen deze instabiele verbindingen aan een verscheidenheid van lichamelijke afweer die hen kon verhinderen het bereiken van de embryo. Onderzoeken in culturen van hele embryo's kunnen worden gebruikt om afzonderlijke maternale van intrinsieke foetale effecten op de ontwikkeling.

Hier presenteren we een methode voor het kweken van muizenembryo's met behulp van hoog verrijkt media in een roller incubator apparaat die het mogelijk maakt voor de normale neurale buis sluiting na dissectie (Crockett, 1990). Eenmaal in cultuur, embryo's kunnenworden gemanipuleerd met behulp van conventionele in-vitro-technieken die niet anders mogelijk zou zijn indien de embryo's nog in de baarmoeder. Embryo broers en zussen kunnen afgehaald worden op verschillende tijdstippen op verschillende aspecten van neurulatie, die voortkomen uit E7-7.5 (neurale plaat formatie, net voor de aanvang van neurulatie) onderzoek om E9.5-10 (aan het einde van craniale vouwen en caudale neuropore sluiting, Kaufman, 1992). In dit protocol, tonen we onze methode voor het ontleden van embryo's op tijdstippen die optimaal zijn voor de studie van craniale neurulatie. Embryo's worden ontleed in E8.5 (ca. 10-12 somities), na de inleiding van de neurale buis sluiten, maar voorafgaand aan de embryo draaien en craniale neurale vouwen sluiting, en onderhouden in cultuur tot E10 (26-28 somities), wanneer craniale neurulatie moet volledig zijn.

Protocol

1. De voorbereiding van de cultuur media - alle reagentia zijn vermeld in tabel 1

1. Dooi mannelijke rat serum bij 37 ° C.
2. Warmte-Inactiveer rat serum gedurende 30 minuten bij 55 ° C
3. Centrifugeer rat serum op 10K gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur
4. Verwijder supernatant en meng 50:50 met fenol-rood vrij DMEM w / High Glucose
5. Steriliseer de media met een 0,45 um spuitfilter
6. Minstens 1 ml van de media / embryo moet worden voorbereid

2. Isolatie van de baarmoeder van de zwangere dam

1. Met behulp van procedures die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC), de zwangere dam wordt eerst verdoofd en daarna gedood door cervicale dislocatie
2. Steriliseer de buik met 70% EtOH
3. Knijp een klein pad van de huid langs de middellijn, net boven de tepel lijn, met grote tangen en open de buik onder je tangen met grote schaar. Wees voorzichtig dat u geen interne structuur schades
4. Gebruik je schaar om zijwaarts gesneden uit de eerste opening naar de zijkanten van de muis, zodat de hele buik open is
5. Darmen en overtollig vet pads kunnen vaak obscure de baarmoeder en deze moet worden verplaatst opzij, zodat de bovenkant van de baarmoeder en eierstokken kan worden waargenomen aan elke kant
6. Knijp de bovenkant van de baarmoeder onder de eierstokken en gebruik je schaar om de baarmoeder te scheiden van het vet, het snijden van het ene eind van de baarmoeder naar de andere eierstok
7. Til de baarmoeder met je pincet en plaats in een petrischaal met een zoutoplossing

3. Verwijdering van embryo's uit de baarmoeder

1. Spoel de baarmoeder met een zoutoplossing om eventuele overtollige bloed te verwijderen en het overtollige vet versiering aan de buitenkant
2. Transfer naar een schone schotel met room temp. Tyrodes zoutoplossing om visualisatie te verbeteren
3. Met behulp van een stereomicroscoop, een aparte elk embryo met behulp van een klein schaartje of, indien nodig fijne (# 5) tang zorgvuldig verwijderen van de baarmoeder uit elkaar.
<li> Invoegen fijn pincet in de ruimte tussen de baarmoederwand en de decidua en pel de rug van de baarmoederwand, en let niet te doorboren het embryo

4. Verwijdering van decidua uit embryo's

1. Plaats de decidua, zodat de donkere gedeelte (placenta) is van u af naar
2. Maak een incisie met je tang langs de lijn tussen de donkere gedeelte van de decidua van het lichtere gedeelte, waarbij je niet te diep ingesneden
3. Vul de scheiding van de placenta van de bovenkant van de dooierzak, zorg dat u de ectoplacental kegel (EPC) scheuren. Op dit punt moet je in staat om de Reichert de membraan te visualiseren op de dooierzak
4. Blijf de hele decidua (lichtere gedeelte) en let niet te doorboren de dooierzak te verwijderen
5. Knijp voorzichtig in en verwijder de Reichert met het schillen van uit de buurt van de EPC. Als het EPC is beschadigd of gescheiden van de dooierzak, zal embryo's niet normaal te keren van E8.5-E9.5

5. Het opzetten van de cultuur-systeem

1. Snij het uiteinde van een plastic overdracht pipet met een schaar aan de diameter van de opening te verhogen, zodat een embryo kan worden gepipetteerd zonder beschadiging van de dooierzak
2. Vul schone roller flesjes met 1 ml van media per embryo. Afhankelijk van het type van de rolflessen gebruik gemaakt van een maximum van 3-6 embryo's kunnen worden geladen in elke fles.
3. Breng de embryo's met behulp van uw gesneden pipet om de media-roller gevulde fles, met meer dan zo weinig Tyrodes mogelijk om niet aan de media te verdunnen
4. Bevestig de rubberen plug (stop) naar de top van het glas roller fles
5. Steek de roller flessen in de rol cultuur trommel, zodat een goede afdichting wordt gevormd tussen de stekker en de trommel
6. Als alle flessen zijn aangesloten, en de eventuele lege plekken in de trommel zijn verzegeld wet rubber stoppers, activeert u de roller
7. Open CO ₂ en O ₂ tanks en stel ze tot ongeveer 2 psi, zodat de uitlaatklep is een zeepbel per seconde los te laten. Voor E8.5-E10 embryo's, zou 20% O ₂ en 5% CO ₂ worden gebruikt.
8. Zorg ervoor dat de incubator is ingesteld op 37 ° C en deksel of de incubator, zodat de embryo's worden afgeschermd van licht te sluiten.
9. Embryo's moeten regelmatig worden gecontroleerd om hun ontwikkeling te beoordelen door de toevoeging van somities, de progressie van het draaien, en de mate van neurale buis sluiting
10. Na 2-3 uur in de cultuur, kunnen farmacologische remmers of andere behandelingen worden toegevoegd aan de media
11. De opzet van het onderzoek moeten controles worden opgenomen, zoals het voertuig of inactieve analogen van de studie reagens.

6. Evaluatie van ontwikkeling na hele embryo cultuur

1. Schakel gas, stop roller, en verwijder de flessen van incubator
2. Transfer embryo's terug naar Tyrodes of PBS in een petrischaal voor de evaluatie in het kader stereomicroscoop
3. De dooierzak moet ballon-achtige verschijnen, een hartslag moeten zichtbaar zijn en de hartslag moet> 120 slagen per minuut, en het verkeer moet worden duidelijk
4. Foto embryo's voorafgaand aan de dooierzak verwijderen indien nodig
5. Verwijder de dooierzak uit embryo door een gat in de buurt van de EPC en flippen de dooierzak en amnion over het hoofd en de romp van het embryo.
6. De navelstreng kan worden gesneden om de dooierzak te scheiden van het embryo en de dooierzak kan worden gebruikt voor genotypering van de embryo indien nodig.
7. Onderzoek van de embryo voor somiet aantal en neurale buis defecten, zoals een open schedel plooien, onvolledige sluiting van het gezicht en / of een open caudale neuropore. Embryo's kunnen worden opgevoerd op basis van de Theiler indeling van meerdere morfogenetische wijzigingen ( http://www.emouseatlas.org/ eMap / home.html ) Nogmaals, een fotografisch verslag vanontwikkeling van het embryo is nuttig.

7. Opmerkingen

1. Een hoge kwaliteit dissectie is essentieel, omdat elke nick of scheuren in de dooierzak succesvol zal draaien voorkomen en remmen de normale ontwikkeling. De EPC kan ook worden beschadigd tijdens het verwijderen van de membraan van de Reichert's (RM), en als de EPC is zelfs gedeeltelijk gescheiden van de dooierzak, embryo's niet normaal ontwikkelen. Echter, onvolledige verwijdering van de RM oorzaak embryo's aan elkaar plakken en / of RM cellen kunnen overwoekeren in cultuur en vernauwen dooierzak expansie, die beide zou een normale ontwikkeling te voorkomen.
2. Schoon en scherpe tangen zijn het geheim aan het krijgen van een goede dissectie, want saai of gebogen tang maken de procedure aanzienlijk moeilijker. Eiwit deposito's op instrumenten zal leiden tot weefselschade.
3. Schoon, steriele glazen flessen zijn ook essentieel om embryo's te voorkomen dat het vasthouden aan de zijwand en het wordt beschadigd. Vóór het begin van het experiment, moeten flessen worden scrubbed met water en zeep, gespoeld in dH ₂ O, en de magnetron met een kleine hoeveelheid water in elke fles tot het water kookt. Flessen worden vervolgens gespoeld met 70% EtOH en liet aan de lucht drogen.
4. Werk zo snel mogelijk, want hoe sneller het embryo kan worden overgedragen aan de cultuur media en verwarmd terug naar 37 ° C is de betere overleving.
5. Vul het ontleden van de hele nest alvorens een embryo's rolflessen zodat elk embryo is op kamertemperatuur voor dezelfde hoeveelheid tijd om te voorkomen dat eventuele verschillen in groei embryo
6. Handhaven van een steriele omgeving om bacteriële besmetting van de culturen te voorkomen. Onze cultuur experimenten zijn uitgevoerd zonder antibiotica, maar veel laboratoria toe te voegen aan hun antibiotische media om bacteriegroei te voorkomen. Het medium moet zo duidelijk aan het einde van het experiment zoals het was in het begin van het experiment. Als media is troebel of er is een zichtbare neerslag, is er waarschijnlijk een conbesmetting die is geïnfecteerd jouw cultuur.
7. Ineffectief gasuitwisseling kan ook vertragen embryo's ontwikkeling, dus zorg ervoor dat een betrouwbare regelaar die continue levering te verzekeren.
8. Embryo's ontwikkelen ongeveer 50% langzamer in ex vivo cultuur, daarom is het essentieel om somieten tellen om ervoor te zorgen dat u de juiste fase van ontwikkeling heeft bereikt voor de voltooiing van het experiment.

8. Representatieve resultaten:

De verschijning van embryo's pre-en post-roller cultuur wordt geïllustreerd in figuur 1. Op het moment van dissectie, moeten embryo's worden in een unturned configuratie (Fig. 1A, D), waar de staart achter het hoofd vouwen. Na 36 uur in de cultuur, moeten embryo's dus afgerond hebben draaien dat ze in de C-gebogen, foetale houding, waarbij de staart is in de voorkant van het hoofd (afb. 1B, C, E, F). Farmacologische manipulatie met RhoA kinase remmer (Y-27632), een bekende remmer van convergente uitbreiding tijdens deneurulatie (Ybot-Gonzalez, 2007), resulteert in een verkorting van de embryo's langs hun rostraal-caudaal as (fig. 1E, F) en remt de craniale neurale plooi sluiting. Onze gegevens tonen aan dat toenemende doses van Y-27,632 geleidelijk craniale vouw sluiting schaadt (Figuur 2A) en verkort het lichaam as (Fig. 2B), in overeenstemming met de rol van downstream RhoA signalering in craniale neurulatie en convergente extensie.

Figuur 1. Verschijning van culturen embryo's en manipulatie met de farmacologische remmer Y-27632. (A, D) ontleed embryo's op E8.5 voorafgaand aan de hele embryo cultuur (B, E) Embryo's op E10 met de dooierzak nog steeds intact, na 36hrs van rol cultuur. (C, F) De dooierzak is verwijderd om succesvol te draaien en neurale buis sluiting illustreren. Embryo's die werden behandeld met de Rho kinase remmer Y-27632 (E, F) niet naar behoren convergente uitbreiding ondergaan en illustrereneen verkorte lichaamsas.

Figuur 2. Effect van RhoA kinase remmer op craniale neurale buis sluiting en as rek. (A) Het percentage van de embryo's die in staat waren om met succes sluiten hun craniale plooien (NTC% = percentage neurale buis sluiting) wordt vergeleken met de dosis van Y-27632 toegevoegd aan cultuur media. (B) De afstand tussen de otic blaasje en voorpoot was significant lager bij hogere doseringen van Y-27632 (p <0,05).

Discussion

De mogelijkheid om de moeder, intra-uteriene factoren die los van degenen die inherent zijn aan het embryo zijn tijdens de ontwikkeling is een belangrijk instrument voor het bestuderen van alle stadia van de embryogenese. Hier hebben we hebben de effecten van een kleine molecule inhibitor van RhoA kinase op de schedel neurulatie ex utero, waardoor het verwijderen van de variabele van de maternale metabolisme van het geneesmiddel. Deze farmacologische manipulatie heeft een diepgaand effect op craniale neurulatie en convergente extensie. Gevoeligheid voor deze stof is te vergelijken tussen verschillende genetische muizenmutanten. De methode hier gepresenteerde kan ook toegepast worden op studies van andere moleculaire pathways in ontwikkeling, waardoor de directe manipulatie van cellulaire functie in embryo's met behulp van een verscheidenheid van reagentia.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope for Dissection	Leica Microsystems	M165
Precision Incubator	BTC Engineering	BTC 001
Rotating Bottle Culture Unit	BTC Engineering	BTC 003
Glass Bottles for Rotating Unit	BTC Engineering	BTC 005
Silicone Rubber Bung	BTC Engineering	BTC 007
Silicone Rubber Cork	BTC Engineering	BTC 008
Gas Bubbler Inlet	BTC Engineering	BTC 012
Gas Bubbler Inlet Trap	BTC Engineering	BTC 013
Gas Bubbler Outlet	BTC Engineering	BTC 014
Gas Cylinder	Tech Air		20% O2, 5% CO2
Gas Regulator	Tech Air
Male Rat Serum	Harlan Laboratories	4520
DMEM w/o phenol red	Invitrogen	31053
10 mL Syringe	BD Biosciences	309604
Syringe Filter	Nalge Nunc international	190-2545
Large Dissecting Scissors (Blunt tip)	VWR international	82027-594
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Dumot #5 forceps	Fine Science Tools	11252-50
Tyrode’s Saline			As described in Cockroft 1990
10 cm Disposable Petri Dish	BD Biosciences	351029