Summary
Een live fluorescentie imaging techniek om de aanvulling en de mobilisatie van specifieke synaptische vesicles (SV) zwembaden in het centrum van zenuwuiteinden te kwantificeren wordt beschreven. Twee rondes van SV recycling worden bewaakt in dezelfde zenuwuiteinden die een interne controle.
Abstract
Na het vrijkomen van neurotransmitters in het centrum van zenuwuiteinden, zijn SVS snel opgehaald door endocytose. Opgehaalde SVS worden dan gevuld met neurotransmitter en weer aan de recycling zwembad, gedefinieerd als SVS die beschikbaar zijn voor exocytose 1,2. De recycling pool kan in het algemeen onderverdeeld worden in twee verschillende zwembaden - de gemakkelijk losneembaar zwembad (RRP) en de reserve zwembad (RP). Zoals hun naam impliceert, de adviesprijs bestaat uit SVS die onmiddellijk beschikbaar zijn voor fusie, terwijl RP SVS worden pas vrijgegeven tijdens intense stimulatie 1,2. Het is belangrijk om een betrouwbare test die het verschil aanvulling van deze SV zwembaden rapporten om een te begrijpen) hoe SVS-verkeer na verschillende vormen van endocytose (zoals clathrine-afhankelijke endocytose en activiteit-afhankelijke bulk endocytose) en 2) de mechanismen het beheersen van de mobilisatie van zowel de RRP en RP in reactie op verschillende stimuli.
FM kleurstoffen worden routinematig werked naar SV omzet kwantitatief rapport in het centrum van zenuwuiteinden 3-8. Ze hebben een hydrofobe koolwaterstof staart die omkeerbaar wanden maken het mogelijk in de lipide bilaag, en een hydrofiele kopgroep die blokken passage over membranen. De kleurstoffen hebben weinig fluorescentie in waterige oplossing, maar hun quantum opbrengst drastisch toe wanneer opgedeeld in membraan 9. Zo FM kleurstoffen zijn ideaal fluorescerende probes voor het opsporen van actieve recycling SVS. Het standaard protocol voor het gebruik van FM-kleurstof is als volgt. Eerst worden ze toegepast op de neuronen en worden opgenomen tijdens de endocytose (figuur 1). Na de niet-geïnternaliseerde kleurstof wordt weggespoeld uit het plasma membraan, gerecycled SVS verdelen binnen de recycling zwembad. Deze SVS worden vervolgens uitgeput met het lossen stimuli (figuur 1). Omdat FM kleurstof etikettering van SVS is quantale 10, de resulterende fluorescentie daling is evenredig aan de hoeveelheid vrijgekomen blaasjes. Zo, de recycling en de fusie van SVS gegenereerd uit de previous ronde van endocytose betrouwbaar kan worden gekwantificeerd.
Hier presenteren we een protocol dat is aangepast om twee bijkomende elementen van de informatie te verkrijgen. Ten eerste worden sequentiële lossen stimuli gebruikt om differentieel lossen het RRP en de RP, tot kwantificering van de aanvulling van specifieke SV zwembaden mogelijk te maken. Ten tweede, elke zenuw klem ondergaat het protocol twee keer. Zo kan de reactie van dezelfde zenuw terminal op de S1 worden vergeleken met de aanwezigheid van een teststof in fase S2 (Figuur 2), het verstrekken van een interne controle. Dit is belangrijk, omdat de omvang van SV recycling in verschillende zenuwuiteinden is zeer variabel 11.
Alle aanhangend primaire neuronale culturen kan worden gebruikt voor dit protocol, maar de plating dichtheid, oplossingen en stimulatie voorwaarden zijn geoptimaliseerd voor de kleine hersenen granule neuronen (CGNs) 12,13.
Protocol
1. Cerebellaire Granule Neuron Voorbereiding
- Autoclaaf van ongeveer 100 diameter van 25 mm dekglaasjes (tabel 1).
- Plaats coverslips in een 50 ml steriel buisje met steriele poly-D-lysine-oplossing (tabel 2). Leg ze op een draaiend platform gedurende 2 uur op de vacht van de dekglaasjes.
- Droge beklede dekglaasjes op steriele papier in een laminaire stroming kap (tabel 1).
- Plaats coverslips in steriele 6-well platen en warm in een CO 2 incubator (tabel 1). Dekglaasjes kunnen worden opgeslagen voor een maand bij 4 ° C voor voor gebruik.
- Euthanaseren een zeven dagen oude Sprague Dawley rattenpup volgens de lokale ethische commissie richtlijnen. We gedood pups met behulp van cervicale dislocatie.
- Ontleden het cerebellum en plaats het in een steriele petrischaal met daarin een fosfaat-gebufferde zout-oplossing (oplossing B, tabel 3).
- Herhaal de stappen 1,5 en 1,6 voor 4-6 ratten pups.
- Cerebella worden dan geplaatst op de steriele stadium van een McIlwain Tissue Chopper (tabel 1). Weefsel wordt gehakt bij 375 micrometer tijdstippen voor het draaien van de etappe over 90 ° en het herhalen van het proces.
- De gehakte cerebella worden overgebracht naar een trypsine (oplossing T, tabel 4), die eerder was verwarmd tot 37 ° C.
- Incubeer cerebella bij 37 ° C gedurende 20 minuten onder zacht schudden ongeveer elke 5 minuten.
- Tijdens de tryptische spijsvertering, vlam polish drie steriele glazen pipetten (tabel 1) met behulp van een Bunsen-vlam. Gebruik de vlam om een boete boring, een medium boring en een wijde boring op de respectieve monden van de pipetten te creëren.
- Na 20 min incubatie in oplossing T, voeg 20 ml van een trypsine / DNase-remmer (oplossing W, tabel 5) tot de cerebellaire schorsing en pellet-cellen bij 1.000 g gedurende 1 minuut in een benchtop centrifuge (tabel 1).
- Giet het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 1,5 ml van een geconcentreerde trypsine / DNase-remmer (oplossing C, tabel 6) met behulp van de grootste boring pipet.
- Laag de celsuspensie op de top van 10 ml van een voorverwarmde (37 ° C) bovine serum albumine aangevuld Earles Balanced Salts Solution (tabel 7) in een steriele 15 ml buis.
- Centrifugeer de schorsing voor 5 min bij 1500 g en resuspendeer de cel pellet in 2 ml van voorverwarmde (37 ° C) kweekmedium (tabel 8).
- Schat het aantal cellen met behulp van een hemocytometer (tabel 1) en verdun de celsuspensie tot een uiteindelijke dichtheid van 3,3 x 10 6 cellen per ml.
- Cellen worden uitgeplaat door het toevoegen van 75 pi van de celsuspensie naar het centrum van poly-D-lysine-gecoate dekglaasjes (einddichtheid 2,5 x 10 5).
- De cultuur platen met de dekglaasjes worden geplaatst in de CO 2 incubator voor 60 min om de cellen te laten eendhere.
- Voeg 1,5 ml van het kweekmedium in elk putje zorg ervoor dat u de geïllustreerde cellen verstoren en de cultuur platen terug te keren naar de CO 2-incubator.
- De volgende dag vervangen door het kweekmedium met vers kweekmedium aangevuld met de mitotische remmer cytosinearabinoside (tabel 8). Arrestaties proliferatie van gliacellen in cultuur.
2. Experimentele opstelling
- Basis experimentele opstelling moet bestaan uit de volgende (zie tabel 1 en 9 voor specifieke apparatuur en software gebruikt):
- Omgekeerde epi-fluorescentie microscoop
- Gekoelde CCD-camera
- TL-lichtbron (monochromator of filter wiel)
- Gravity perfusie apparaat
- Imaging kamer met parallelle platina-elektroden
- Elektrische stimulator
- Computer
- Beeldacquisitie software
- Experimenten moeten worden uitgevoerd in het donker of onder rood licht conditions met een minimum fluorescerende verlichting van het monster naar de FM-kleurstof te vermijden bleken.
- Experimenten worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. Als fysiologische temperatuur nodig is, kan een temperatuur-gecontroleerde perfusie-systeem worden gebruikt.
3. Monstervoorbereiding
- Culturen moeten worden gebruikt na 8-12 dagen in vitro.
- Overdracht van een dekglaasje op zoutoplossing (Tabel 10) gedurende 10 min bij kamertemperatuur tot de stabilisatie toestaan in nieuwe medium.
- Verwijder het dekglaasje, droog de onderzijde en het gebied rond de bijgevoegde cellen met een klein stukje papier handdoek of een absorberend papier.
- Met behulp van siliconenvet (tabel 2), het dekglaasje lijm aan de onderkant van de beeldvorming kamer. De cellen moeten worden tussen de twee parallelle draden. Voldoende siliconenvet moet worden gebruikt om sluit de kamer, maar zonder vet die in het centrum van het bad kamer.
- Voorzichtig te vullen van het bad kamer met ~ 260 ul salijn oplossing en vul vervolgens de input slang met dezelfde oplossing.
- Lijm een schoon dekglaasje met siliconenvet naar de top van de kamer om het te verzegelen. De input en output buizen kunnen worden gebruikt om eventuele luchtbellen opgesloten in de kamer te verwijderen. Het is belangrijk dat het elektrische circuit niet onderbroken wordt door luchtbellen.
- Blokkeer de beeldvorming kamer in een roestvrij stalen platform en controleer op lekkage door voorzichtig perfuseren zoutoplossing via de ingang slang.
- Monteer de samengestelde kamer op het toneel van een omgekeerde microscoop, en sluit de kamer naar een zwaartekracht perfusie-systeem, na eerst geprimed de inlaat met een zoutoplossing.
- Bevestig de aansluitdraden van de kamer van de elektrische stimulator.
- Voeg een druppel immersie olie aan de doelstelling als een olie-objectief wordt gebruikt. Focus op de cellen in het midden van de kamer met behulp van helderveld verlichting.
4. S1 Fase
- Perfuseren neuronen met 1,5 mlvan de FM-kleurstof (tabel 2) verdund in zoutoplossing.
- Stimuleren van neuronen te verven opname op te roepen met behulp van de bijgevoegde stimulator.
- Na stimulatie, perfuseren neuronen met verse zoutoplossing gedurende 2 minuten om weg te wassen overtollige kleurstof FM (debiet 7 ml / min). Gliale vervuiling in het CGN cultuur systeem is minder dan 5% 14, dus deze periode is voldoende om kleurstof te verwijderen .
- Laat neuronen rusten 8 minuten.
- Tijdens dit interval, zoekt axonale netwerken waarin individuele FM dye-loaded zenuwuiteinden zijn zichtbaar met behulp van fluoresceïne golflengten (excitatie, 480 nm, emissie,> 550 nm). Vermijd gebieden met clusters van cellen. Keep verlichting tot een minimum bij deze stap, omdat intense opwinding kan leiden tot kleurstof fototoxiciteit. Duidelijke tekenen hiervan zijn blebbing van axonen en een gebrek aan kleurstof lossen (als gevolg van de vaststelling kleurstof).
- Re-focus image direct voordat de foto overname aangezien een lichte drift kan hebben plaatsgevonden tijdens de rustperiode. Begin time-lapse beeldacquisitie met een snelheid van 1 frame per 4 s.
- Na het verwerven van 5-10 baseline foto's, roepen exocytose van de RRP door het leveren van een 30 Hz stimulatie voor 2 s (60 actiepotentialen) 8 Begin stimulatie handmatig direct na het beeld vast te leggen..
- Na het verwerven van nog eens 10 beelden, roepen SV exocytose van de RP met behulp van drie stimulations van 40 Hz gedurende 10 s (400 actiepotentialen), die elk 30 seconden uit elkaar 8.
- Acquire nog 5 - 10 Beelden en dan pauzeren beeldacquisitie.
5. Herstelfase (zie figuur 2)
- Laat neuronen te herstellen over ten minste 20 minuten.
- Optioneel - Als het effect van een geneesmiddel op endocytose is te testen, perfuseren neuronen met drugs oplossing in deze periode (Figuur 2b) 3,8.
6. S2 Fase
- Herhaal de S1-fase protocol (deel 4) voor een controle-experiment met hetzelfde gezichtsveld alsin S1.
- Optioneel - Als het effect van een geneesmiddel op endocytose is te testen, neuronen perfuseren met het geneesmiddel oplossing aangevuld met FM kleurstof (Figuur 2b) 3,8.
- Optioneel - alternatief als medicijn effecten op de exocytose van belang zijn, perfuseren neuronen met het geneesmiddel oplossing zowel voor als tijdens de RRP en RP lossen stimuli (figuur 2c) 3.
7. Data Analysis
- Gebruik ImageJ en Microsoft Excel of vergelijkbare software voor data-analyse.
- Voor de analyse, is een beeld sequence in stack vereiste vorm. Sommige imaging software kan exporteren sequenties als afzonderlijke beelden. Als dit het geval is, om te zetten beelden naar een stack met behulp van een ImageJ ingebouwde functie Afbeelding> Stacks> Afbeeldingen te stapelen.
- Pas de helderheid en het contrast van de stapel om het dynamische bereik te maximaliseren. Afbeelding> Aanpassen> Helderheid / Contrast (figuur 3a).
- Indien er zich belangrijke horizontale drift heeft plaatsgevonden tijdens de tHij experiment, run StackReg ( http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ ) en TurboReg ( http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ ) plugins op ImageJ om beeld stack (Figuur 3b) af te stemmen .
- Run Time Series Analyzer plugin ( http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html ) (figuur 3c).
- Definieer regio's van belang (ROI) over ten minste 90 zenuwuiteinden. Deze moeten identiek zijn (rond ROI met 1,5 micrometer diameter) Het is nuttig om tussen de beelden schakelen voor en na het lossen van kleurstof om actieve zenuwuiteinden (als alternatief een pre-stimulatie beeld kan worden afgetrokken van een post-stimulatie afbeelding) te onthullen. Een ideale ROI grootte is er een die is iets groter dan een typische zenuw terminal (figuur 3c).
- Verkrijgen van het totaal / geïntegreerde fluorescentie-intensiteit van elke ROI meer dan time en exporteren naar Microsoft Excel (Figuur 3d en 4a).
- Normaliseer ROI sporen om dezelfde willekeurige waarde door het af te sporen in het vlak van de Y-as voor de eerste lossing stimulus in zowel S1 en S2 fasen (figuur 4b-c). Dit is om te controleren voor kleine variaties in de achtergrond fluorescentie-intensiteit.
- Meet de absolute afname in fluorescentie opgeroepen door elke lossing stimulus in willekeurige fluorescentie-eenheden voor S1 en S2 als volgt (Figuur 4d):
- RRP = Verandering in fluorescentie (AF) ingezet door 30 Hz 2 s
- RP = Som van AF veroorzaakt door 3 x 40 Hz 10 s
- Totale recycling zwembad = RRP + RP
- Voor elke relevante parameter in 7.9, berekent de gemiddelde waarde over alle zenuwuiteinden van een enkel experiment.
- Voor statistische analyse, de gemiddelde waarden die zijn verkregen uit meerdere onafhankelijke experimenten kunnen worden gemiddeld. Het aantal dekglaasjes in plaats van het aantal zenuwuiteinden moet worden gebruikt als de Statistical n.
8. Representatieve resultaten:
Een controle-experiment, waar CGNs onderging twee rondes van identieke laden en lossen stappen is weergegeven in figuur 5. Bij het begin van een reeks experimenten, is het essentieel dat een controle-experiment als dit wordt uitgevoerd elke dag om te bevestigen dat de S1 en S2 zijn vergelijkbaar voor de verschillende experimentele omstandigheden tijdens de S2.
In dit voorbeeld werden CGNs geladen met 10 uM FM1-43 met behulp van een 80 Hz 10 s stimulatie (figuur 5a). Figuur 5b toont FM1-43-loaded zenuwuiteinden vertegenwoordigd door TL-puncta. ROI werden gedefinieerd dan 90 zenuwuiteinden zoals weergegeven in figuur 5c. Dezelfde set van ROI werd gebruikt voor zowel de S1 en S2. Tijdens beide lost, was het RRP eerste gelost met een 30 Hz (2 s) stimulatie, gevolgd door RP lossen met drie opeenvolgende 40Hz (10 s) stimuli (figuur 5a). De fluorescentie druppel tijdens elke stimulus kan duidelijk worden waargenomen en gekwantificeerd (figuur 5d-e). Toen onderzocht, de fluorescentie druppels dat overeenkomt met het RRP, RP en de totale recycling zwembad waren vergelijkbaar in beide S1 en S2. Daarnaast is 20% van gerecycled SVS verbleven in het RRP, terwijl 80% verbleef in de RP in zowel S1 en S2.
Figuur 1 Schematische weergave van een typisch FM experiment. A) SV endocytose wordt geactiveerd in de aanwezigheid van FM kleurstof (vertegenwoordigd in het groen). De kleurstof wordt ingenomen door invaginating membraan (een SVS of bulk endosomen). B) Niet-geïnternaliseerd kleurstof op de plasmamembraan is weggespoeld door perfusie. C) op verzoek van een stimulus lossen, gelabeld SVS die beschikbaar zijn gekomen voor release fuseren met de plasmamembraan resulteert in een verlies van fluorescentie. D) De verandering in fluorescentie (AF), die evenredig is met de hoeveelheid vrijgekomen gelabeld SVS kan vervolgens worden gekwantificeerd.
_upload/3143/3143fig2.jpg "/>
Figuur 2 Schematische diagrammen van mogelijke experimentele protocollen. A) Stroomdiagram van een controle-experiment waarbij cellen ondergaan twee rondes van de FM-kleurstof laden en lossen (S1 en S2). Cellen kunnen worden geladen met behulp van een scala van verschillende stimuli. Lossen stappen zijn identiek in dat het RRP is gelost met 30 Hz voor 2 s, gevolgd door RP te lossen met behulp van drie keer 40 Hz voor 10 s. RRP en reserve zwembad lossen stimuli werden van elkaar gescheiden door 40 sec, alle andere stimuli met 30 sec. Cellen worden overgelaten om te herstellen voor 20 min tussen S1 en S2. Stroomschema's van mogelijke wijzigingen van het effect van een stof aan beide B-test) endocytose of C) exocytose worden ook getoond. Desbetreffende test geneesmiddel kan worden doorbloed in de kamer tijdens de aangegeven periodes.
Figuur 3 Screenshots van data-analyse in Image J. Screenshots worden getoondvoor A) helderheid en contrast aanpassen, B) frame alignment, C) ROI selectie, en D) intensiteitswaarden extractie met behulp van Image J.
Figuur 4 Screenshots van data-analyse in Microsoft Excel. Screenshots worden getoond voor A), het importeren van ruwe data van Image J (1 ste kolom = framenummer, de resterende kolommen = gegevens van individuele zenuwuiteinden) B) aanpassing van S1 uitgangswaarden (frame 10) om een willekeurige waarde (200) bij de start van de eerste stimulus, C) aanpassing van de S2 uitgangswaarden op frame 55 met behulp van een identiek protocol om S1, en D) het meten van fluorescentie daalt het gebruik van Microsoft Excel. Merk op dat de gemiddelde spoor getoond in D wordt gebruikt om de tijd punten te definiëren voor en na elke druppel. De grootte van de fluorescentie druppels voor elke ROI moet worden vastgesteld op basis van waarden op het werkblad weergegeven in C.
Figuur 5. Vertegenwoordiger van controle-experiment. A) Stroomdiagram van een controle-experiment, waar CGNs waren geladen met 10μM FM1-43 met behulp van 80 Hz (10 s) stimulatie. De S1 en S2 fasen zijn identiek. RRP en reserve zwembad lossen stimuli werden van elkaar gescheiden door 40 sec, alle andere stimuli met 30 sec. B) Een beeld met zenuwuiteinden geladen met FM1-43. C) hetzelfde beeld als B met 90 genummerde ROI geselecteerd voor analyse. D) Foto's van een gebied afgebeeld met een rood vak in B op geselecteerde tijdstippen. Basale = voor stimulatie; 30 Hz = na 30 Hz 2 s stimulatie; 40 Hz 1,2,3 = na elke 40 Hz 10 s stimulatie. Deze beelden worden gepresenteerd in pseudocolor op veranderingen in fluorescentie (spectrum balk wordt weergegeven aan de rechterkant) te illustreren. E) De gemiddelde ± SEM spoor afkomstig van 90 zenuwuiteinden afgebeeld in C. Afzonderlijke stimuli worden vertegenwoordigd door horizontale balken. Schaal bars = 10 micrometer.
Discussion
FM kleurstoffen worden op grote schaal gebruikt voor het zenuwuiteinde functioneren in veel neuronale voorbereidingen te onderzoeken. Ze zijn voornamelijk gebruikt om de omvang van een van beide SV endocytose, SV omzet of de kinetiek van exocytose 6 monitor. De beschreven protocol breidt deze studies te onderzoeken of het differentieel lossen van specifieke SV zwembaden. Dit biedt extra informatie met betrekking tot de aanvulling van SV zwembaden en ook hun mate van mobilisatie.
FM-kleurstoffen kunnen worden gebruikt om meerdere rondes van SV-label recycling binnen dezelfde zenuwuiteinden. We hebben benut deze eigenschap en ontworpen protocollen waarin de SV omzet in elke terminal twee keer kan worden gecontroleerd in dezelfde zenuwuiteinden. Dit zorgt voor een nauwkeurige interne controle, die is hoofdzakelijk te wijten aan de heterogene aard van de SV recycling in parallel zenuwuiteinden 11. Via het gebruik van de S1-fase als een interne controle, het vullen van het RRP, RP en de totaleSV zwembad in de aanwezigheid van drugs betrouwbaar en rechtstreeks worden vergeleken.
Naast het verstrekken van informatie over de absolute omvang van de recycling, RRP en RP zwembaden onder verschillende stimulatie omstandigheden kan dit protocol ook gegevens voor de volgende - 1) De verdeling van SVS tussen de RRP en RP als functie van de recyclage-pool voor S1 en S2, 2) de relatieve omvang van de S2 zwembaden (RRP en RP) als een functie van in totaal S1 recycling zwembad en 3) de relatieve omvang van een gedefinieerde SV zwembad in S2 als een functie van hetzelfde zwembad in S1. Deze bijzondere protocol zal echter niet informatie over lossen kinetiek, sinds de overname te langzaam is (voor de kinetische metingen acquisitie keer moet zo snel mogelijk en lossen automatisch gesynchroniseerd om de afbeelding vast te leggen).
Onze 30 Hz 2 s stimuli roept een identieke omvang van RRP lossen om hypertoon sucrose 8. Aangezien de grootte van de RRPwordt bepaald door hypertone sucrose lossen 15, kunnen we stellen dat dit protocol alle RRP SVS ontlaadt, in overeenstemming met studies in hippocampale neuronen 16. De reserve zwembad is bijna volledig uitgeput door drie treinen van 400 stimuli (40 Hz 10 s per stuk) omdat dit de stimulatie lost een identieke hoeveelheid kleurstof aan een paradigma (2 stimuli met 50 mM KCl) dat 95% van alle dye-label SVS uitput 8,17. Nauwkeurige kwantificering van de omvang van zowel het RRP en reserve zwembad is ook afhankelijk van het verwerven van informatie binnen de lineaire dynamische bereik van de CCD-camera.
Deze eenvoudige protocol kan ook verder worden gewijzigd. De kracht van het laden stimuli kan ook worden gevarieerd om te bepalen hoe neuronale activiteit en de verschillende modi endocytose invloed SV zwembad aanvulling. Bovendien kan meer dan twee cycli van laden en lossen ook uitgevoerd worden indien nodig. Dit protocol kan ook gebruikt worden in cellen getransfecteerd met ofwel overexpressie ofshRNA vectoren. Door de lage transfectie-efficiëntie van de primaire neuronale culturen, moet tot expressie gebrachte eiwitten worden gelabeld met fluorescerende eiwitten. Het is essentieel dat deze fluorescerende labels niet interfereren met het FM-signaal kleurstof (gebruik cyaan of rood eiwitten, bijvoorbeeld). In dit geval kan zenuwuiteinden van de getransfecteerde en niet-getransfecteerde cellen in hetzelfde gezichtsveld ook vergeleken worden als een extra controle acht. In dergelijke experimenten een vergelijking van de mate van belasting tussen de S1 en S2 lasten is van weinig waarde, omdat de storing aanwezig is tijdens beide belastingen. Verdeling van kleurstof tussen SV zwembaden kunnen echter nog steeds acht in beeld worden gebracht.
Genetische verslaggevers genoemd pHluorins kan ook worden gebruikt om SV exocytose en endocytose in primaire neuronale cultuur monitor. Deze probes gebruik van een pH-gevoelige groen fluorescerend eiwit om de pH-omgeving van luminale domeinen van gelabeld SV eiwitten zoals VAMP, synaptofysine en VGLUT1 18 19. De FM-kleurstof gebaseerde aanpak hier beschreven heeft een aantal voordelen ten opzichte van de pHluorin techniek, Ten eerste, FM-kleurstoffen informatie waarop SV endocytose-modus vult het RRP en reserve zwembaden 8. Ten tweede specifieke SV zwembaden kunnen gelabeld worden met FM kleurstoffen die verschillende spectrale eigenschappen hebben 20 en ten slotte is er geen vereiste voor transfectie. FM kleurstoffen kunnen geen informatie over SV verkeer tussen de rust-en recycling SV zwembaden echter (in tegenstelling tot pHluorins 19), omdat per definitie SVS te worden geladen met kleurstof tijdens de endocytose zichtbaar moeten zijn. Dus zowel de FM-kleurstoffen en pHluorins hebben sterke en zwakke punten en zijn zeer krachtig wanneer deze gebruikt worden in onafhankelijke experimenten op dezelfde vraag te pakken.
Beelden van hoge kwaliteit zijn essentieel voor geldige analyse en reproducible resultaten. Terwijl de horizontale drift kan gemakkelijk worden gecorrigeerd, kunnen experimenten waar sprake is van een drift in de Z-as niet meer worden hersteld. Om deze reden is het belangrijk om foto's opnieuw te richten alvorens de S1 en S2 laadt. In gevallen waarin een belangrijke tl-verval is opgetreden, kan verval correcties worden toegepast (meestal door het aftrekken van een eerder opgenomen spoor van de FM-geladen cellen in de afwezigheid van stimulatie). Het is echter gesuggereerd dat verval correctie alleen wordt uitgevoerd voor de grafische weergave en niet om gebruikt te worden voor een kwantitatieve analyse.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de Wellcome Trust (Ref: 084277).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AxioCam MRm Rev. 3 Digital Camera | Carl Zeiss, Inc. | 4265099901000 | |
| Axio Observer.A1 Microscope | Carl Zeiss, Inc. | 4310040000000 | |
| Cell culture plates (6 wells) | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Centrifuge (Universal 32R) | Hettich Zentrifugen | 1610 | |
| CO2 incubator | Heraeus Instruments | 51014042 | |
| Falcon tubes (15/50 ml) | Greiner Bio-One | 188271/210261 | |
| Fluar 20X /0.75 ∞/0.17 Objective | Carl Zeiss, Inc. | 4401459901000 | |
| Glass coverslips (25mm) | VWR international | 631-1584 | |
| Glass pasteur pipettes (230 nm) | Greiner Bio-One | 612-1799 | |
| Haemocytometer | VWR international | 15170-170 | |
| Imaging chamber | Warner Instruments | RC-21 BRFS | |
| Laminar flow hood | BIOHIT | VLF BHS 1200 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd. | MTC/2 | |
| Mercury lamp | Carl Zeiss, Inc. | HBO 103 | |
| MultiStim System Electrical Stimulator (100mV, 1ms pluse width) |  Digitimer Ltd. |
D330 | |
| Perfusion pump | Watson-Marlow Pumps Group | 313S | |
| Serological Pipettes (5/10/25 ml) | Greiner Bio-One | 606180/607180/760180 | |
| Shutter controller | Carl Zeiss, Inc. | MAC5000 | |
| Syringe (20 ml) | BD Biosciences | ST01-B002 | |
| Syringe Filters (Minisart -– 0.20 μm) | Sartorius AG | 16532 | |
| VC-6 Six Channel valve controller | Warner Instruments | 64-0135 | |
| YFP Filter set (Set 46) | Carl Zeiss, Inc. | 1196-681 | |
| Table 1. Specific equipment and apparatus used | |||
| FM1-43 | Cambridge BioScience | BT70021 | 10 μM |
| FM2-10 | Cambridge BioScience | BT70044 | 100 μM |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7886 | 15 μg/ml |
| Silicone grease | Sigma-Aldrich | 85403 | - |
| Table 2. Specific reagents used | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | 0.3% |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 0.25% |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | 1.5 mM |
| D-PBS | GIBCO, by Life Technologies | 21300 | 960 mg/100 ml |
| -make 100ml fresh for each preparation -sterile filter before use |
|||
| Table 3. Solution B for CGN preparation | |||
| Solution B | 19 ml | ||
| Trypsin (5 mg/ml stock, -20°C) | Sigma-Aldrich | T9201 | 1 ml |
| Table 4. Solution T for CGN preparation | |||
| Solution C | 3.2 ml | ||
| Solution B | 16.8 ml | ||
| Table 5. Solution W for CGN preparation | |||
| Deoxyribonuclease (DNase, 500 U per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.5 ml |
| MgSO4· 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | 1.5 mM |
| Solution B | 10 ml | ||
| Soybean trypsin inhibitor (SBTI, 0.5 mg per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma-Aldrich | T9003 | 0.5 ml |
| Table 6. Solution C for CGN preparation | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | 4% |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) | GIBCO, by Life Technologies | 24010 | 10 ml |
| MgSO4· 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | 3 mM |
| Table 7. EBSS Solution for CGN preparation | |||
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) * | Sigma-Aldrich | C1768 | 10 μM |
| F–tal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 10106 | 10 % |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 30 mM |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | 2 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 25 mM |
| Minimal Essential Medium (MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 21090 | 500 ml |
| Penicillin (P)/Streptomycin (S) | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | 100 U/ml (P), 100 μg/ml (S) |
| *Ara-C should be added to medium from 1 DIV onwards | |||
| Table 8. Culture Media for CGN preparation | |||
| AxioVision Rel. | Carl Zeiss, Inc. | 4.8 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.42q | |
| Microsoft Excel | Microsoft | 2003 | |
| Table 9. Specific computer software used | |||
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 1.3 mM |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 5 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.5 mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | 0.4 mM |
| MgCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | 1.2 mM |
| NaCl | Fluka | 71378 | 170 mM |
| NaHCO3 | Fluka | 71627 | 5 mM |
| Na2SO4 | VWR | 10264 | 1.2 mM |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | 20 mM |
| Table 10. Saline Solution (pH 7.4) | |||
References
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat. Rev. Neurosci. 6, 57-69 (2005).
- Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle revisited. Neuron. 28, 317-320 (2000).
- Evans, G. J., Cousin, M. A. Activity-dependent control of slow synaptic vesicle endocytosis by cyclin-dependent kinase 5. J. Neurosci. 27, 401-411 (2007).
- Clayton, E. L., Cousin, M. A. Differential labelling of bulk endocytosis in nerve terminals by FM dyes. Neurochem. Int. 53, 51-55 (2008).
- Clayton, E. L., Evans, G. J., Cousin, M. A. Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation. J. Neurosci. 28, 6627-6632 (2008).
- Cousin, M. A. Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2-Unit 2 (2008).
- Clayton, E. L. The phospho-dependent dynamin-syndapin interaction triggers activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicles. J. Neurosci. 29, 7706-7717 (2009).
- Cheung, G., Jupp, O. J., Cousin, M. A. Activity-dependent bulk endocytosis and clathrin-dependent endocytosis replenish specific synaptic vesicle pools in central nerve terminals. J. Neurosci. 30, 8151-8161 (2010).
- Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. Imaging exocytosis and endocytosis. Curr. Opin. Neurobiol. 6, 365-371 (1996).
- Ryan, T. A., Reuter, H., Smith, S. J. Optical detection of a quantal presynaptic membrane turnover. Nature. 388, 478-482 (1997).
- Murthy, V. N., Sejnowski, T. J., Stevens, C. F. Heterogeneous release properties of visualized individual hippocampal synapses. Neuron. 18, 599-612 (1997).
- Tan, T. C. Cdk5 is essential for synaptic vesicle endocytosis. Nat. Cell. Biol. 5, 701-710 (2003).
- Anggono, V., Cousin, M. A., Robinson, P. J. Styryl dye-based synaptic vesicle recycling assay in cultured cerebellar granule neurons. Methods. Mol. Biol. 457, 333-345 (2008).
- Gallo, V. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).
- Stevens, C. F. Neurotransmitter release at central synapses. Neuron. 40, 381-388 (2003).
- Mozhayeva, M. G. Development of vesicle pools during maturation of hippocampal synapses. J. Neurosci. 22, 654-665 (2002).
- Cousin, M. A., Evans, G. J. O. Activation of silent and weak synapses by cAMP-dependent protein kinase in cultured cerebellar granule neurons. J. Physiol. 589, 1943-1955 (2011).
- Kim, S. H., Ryan, T. A. Synaptic vesicle recycling at CNS synapses without AP-2. J. Neurosci. 29, 3865-3874 (2009).
- Kim, S. H., Ryan, T. A. Cdk5 serves as a major control point in neurotransmitter release. Neuron. 67, 797-809 (2010).
- Groemer, T. W., Klingauf, J. Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same pool. Nat. Neurosci. 10, 145-147 (2007).
