Summary
אנו מתארים שיטה יעילה כדי להפריד בין גדילי דנ"א יחיד, כפול גדילי הדנ"א ואת מולקולות רנ"א נגיפי מקהילות הסביבה. חומצות גרעין הם מופרדים באמצעות כרומטוגרפיה hydroxyapatite עם ריכוז גדל והולך של פוספט המכיל הפגושים. שיטה זו מאפשרת בידוד של כל סוגי חומצות גרעין של נגיפי דגימות סביבתיות.
Abstract
וירוסים, במיוחד bacteriophages (phages), הם גורמים ביולוגיים רבים ביותר על כדור הארץ 1,2. וירוסים לווסת את התא המארח השפע והמגוון, לתרום אופניים של חומרים מזינים, לשנות את פנוטיפ התא המארח, וכן להשפיע על האבולוציה של התא המארח הן וקהילות ויראלי באמצעות העברה רוחבית של גנים 3. מחקרים רבים הדגישו את המגוון הגנטי העצום של וירוסים הפוטנציאל הפונקציונלי שלהם במגוון רחב של סביבות טבעיות.
טכניקות Metagenomic שימשו ללמוד את המגוון הטקסונומי ואת הפוטנציאל התפקודי של מכלולים מורכבים ויראלי שחבריה כוללים גדילי דנ"א יחיד (ssDNA), פעמיים תקועים DNA (dsDNA) ו-RNA גנוטיפים 4-9. נוכחי בנייה ספריה פרוטוקולים המשמשים במחקר ה-DNA או RNA המכיל סביבתיים המכילים וירוסים דורשים טיפול ראשוני nuclease כדי להסיר תבניות nontargeted 10. עם זאת, הבנה מקיפה של משלימים את הגן הקולקטיבי של הקהילה וירוס והגיוון וירוס דורשת ידע של כל החברים ללא קשר להרכב הגנום. חלוקה של מטוהרים תת חומצות גרעין מספקת מנגנון יעיל שבאמצעותו ללמוד מכלולים ויראלי מבלי להקריב קבוצת משנה של החתימה הגנטית של הקהילה.
Hydroxyapatite, צורה גבישית של סידן פוספט, כבר מועסקים הפרדה של חומצות גרעין, כמו גם חלבונים חיידקים, מאז 1960 11. על ידי ניצול האינטראקציה בין תשלום Ca חיובי טעון 2 + יונים של hydroxyapatite ואת עמוד השדרה פוספטים טעונים שלילית של תת חומצות גרעין, אפשר מעדיפים elute כל תת חומצות גרעין עצמאי של האחרים. העסקנו לאחרונה באסטרטגיה זו כדי fractionate באופן עצמאי את הגנום של ssDNA, dsDNA ו-RNA המכילים וירוסים בהכנה של רצפי DNA 12. כאן, אנו מציגים שיטה חלוקה ועל התאוששות של חומצות ssDNA, dsDNA ו-RNA גרעין ויראלית של מכלולים ויראלי באמצעות מעורבות chromotography hydroxyapatite.
Protocol
1. ההכנה של פתרונות
לפני ביצוע כרומטוגרפיה hydroxyapatite, מאגרים פוספט חייב להיות מוכן hydroxyapatite חייב להיות hydrated כראוי.
- הפתרון פוספט 1M, pH 6.8: בבקבוק 1 ליטר לפזר 119.98g של פוספט נתרן monobasic ב 1 ליטר של סטרילית, DEPC שטופלו H 2 O. הכן נתרן זרחתי 1M פתרון dibasic בבקבוק 1 ליטר ידי המסת 141.96g של פוספט נתרן dibasic ב 1 ליטר של סטרילית, DEPC שטופלו H 2 O. מערבבים את מונו ו-di פתרונות ביחס של 1:01. מניחים בקבוק על צלחת לבחוש ולערבב בעזרת מוט מגנטי ומערבבים. התאם ל-pH 6.8 ידי הוספת סודיום הידרוקסיד (כדי להגדיל את ה-pH) או חומצה זרחתית (ירידה pH).
- מאגר פוספט 0.12M: בבקבוק 500ml, לשלב 30 מ"ל הפתרון פוספט 1M, pH 6.8, 2.5ml של 10% נתרן dodecyl סולפט (SDS), ו - 5 מ"ל של EDTA 0.5m. הוסף סטרילי, DEPC שטופלו H2O לנפח של 225ml. התאם ל-pH 6.8. הוסף סטרילי, DEPC שטופלו H2O ל 250 מ"ל. החיטוי.
- מאגר פוספט 0.18M: בבקבוק 500ml, 45ml לשלב הפתרון פוספט 1M, pH 6.8, 2.5ml של 10% נתרן dodecyl סולפט (SDS), ו - 5 מ"ל של EDTA 0.5m. הוסף סטרילי, DEPC שטופלו H 2 O לנפח של 225ml. התאם ל-pH 6.8. הוסף סטרילי, DEPC שטופלו H 2 O ל 250 מ"ל. החיטוי.
- מאגר פוספט 0.20M: בבקבוק 500ml, לשלב 50 מ"ל הפתרון פוספט 1M, pH 6.8, 2.5ml של 10% נתרן dodecyl סולפט (SDS), ו - 5 מ"ל של EDTA 0.5m. הוסף סטרילי, DEPC שטופלו H 2 O לנפח של 225ml. התאם ל-pH 6.8. הוסף סטרילי, DEPC שטופלו H 2 O ל 250 מ"ל. החיטוי.
- 0.40 מאגר M פוספט: בבקבוק 500ml, 100ml לשלב הפתרון פוספט 1M, pH 6.8, 2.5ml של 10% נתרן dodecyl סולפט (SDS), ו - 5 מ"ל של EDTA 0.5m. הוסף סטרילי, DEPC שטופלו H 2 O לנפח של 225ml. התאם ל-pH 6.8. הוסף סטרילי, DEPC שטופלו H 2 O ל 250 מ"ל. החיטוי.
- "1.00M פוספט הצפת" (ריכוז בפועל של פוספט בפתרון זה היא 0.91 מ '): בבקבוק 500ml, לשלב 30 מ"ל הפתרון פוספט 1M, pH6.8, 2.5ml של 10% נתרן dodecyl סולפט (SDS), ו - 5 מ"ל של 0.5m EDTA. הוסף סטרילי, DEPC שטופלו H2O לנפח של 225ml. התאם ל-pH 6.8. הוסף סטרילי, DEPC שטופלו H 2 O ל 250 מ"ל. החיטוי.
- הידרציה hydroxyapatite: משקל החוצה 1g של hydroxyapatite ולהוסיף שפופרת 50 מ"ל. הוסף 6ml של חיץ פוספט 0.12M כדי hydroxyapatite לבין להפוך לערבב. לפני השימוש להביא טמפרטורה עד 60 ° צלזיוס ומערבבים היטב. חנות לפרקי זמן 4 ° C.
- לפני השימוש, לאזן את כל מאגרי פוספט hydroxyapatite hydrated על 60 ° C.
2. הכנת Econo-טור
- סגור שסתום. יש לשטוף מספר פעמים בטור עם deionized H 2 O לפי העמודה היפוך שוב ושוב decanting.
- הסר את שסתום מהעמודה-Econo ו החיטוי העמודה לעקר.
- החלף ולסגור שסתום. הוסף 1ml של Sigmacote על סטריליות Econo טור ומעיל כל משטחי זכוכית. פתח את שסתום ו למזוג.
- צרף עמודה אמבט מים במחזור ולהגדיר הטמפרטורה ל 60 ° C. כדי einsure את הכמות המינימלית של אובדן החום על פני העמודה גלישת עמודה סוכן בידוד כגון נייר אלומיניום או צינור קצף בידוד מומלץ.
- שוטפים את Econo טור פעמיים עם סטרילי, נטול RNase H 2 O ואז פעמיים עם הצפת סטרילי RNase חינם, פוספט 0.12M.
3. Hydroxypaptite Chromotography
- וודא שסתום סגור, לאט להוסיף 2ml של hydroxyapatite, מוכנה מראש resuspended לתחתית עמודה Econo בעזרת פיפטה סטרילית סרולוגיות 2ml.
- אפשר hydroxyapatite להתיישב תחת כוח הכבידה במשך 30 דקות.
- מסננים חיץ מן העמודה שסתום קרוב. שילוב חומצות גרעין עם חיץ פוספט 0.12M בנפח סופי של μl 500 ו דגירה ב 60 ° C במשך 10 דקות בתוך גוש חום או אמבט מים.
- להחיל במהירות חומצות גרעין מוכן במאגר פוספט 0.12M כדי hydroxyapatite בעזרת פיפטה סרולוגיות 2ml לוודא שלא להפריע את הטור.
- אפשר חומצות גרעין להיקשר hydroxyapatite במשך 30 דקות.
- הנח צינורית 15 מ"ל תחת העמודה, פתח את שסתום ולאסוף את המדגם הראשוני המכיל ssDNA. סגור שסתום.
- הוסף 6ml של חיץ פוספט 0.12M hydroxyapatite כדי לוודא שלא להפריע את הטור, פתח את שסתום, ולאסוף גדילי דנ"א יחיד בצינור 15ml מהשלב הקודם. סגור שסתום.
- הוסף 1 נפח של פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl (25:25:1 v / v / v) פתרון הצינור, לערבב במרץ צנטריפוגות XG ב 3500 במשך 15 דקות. העברת ssDNA המכיל supernatant לצינור 15 מ"ל חדש.
- חזור על 3.76 ו 3.87 באמצעות 6ml של חיץ פוספט 0.20M דוארקתרוס ו-RNA לטהר מהעמודה לוודא להשתמש בצינור 15 מ"ל חדש לאיסוף.
- חזור על 3.76 ו 3.87 באמצעות 6ml של חיץ פוספט 0.40M כדי elute ולטהר dsDNA מהעמודה לוודא להשתמש שפופרת 15 מ"ל חדש לאיסוף.
- חזור על 3.76 ו 3.87 באמצעות 6ml של חיץ פוספט 1.00M להפשיט את הטור של dsDNA כל שיורית לוודא להשתמש שפופרת 15 מ"ל חדש לאיסוף.
4. Desalting דוגמאות חומצות גרעין
- העברת 4-5 מ"ל של מדגם Amicon Ultra-4 מכשיר מסנן צנטריפוגלי לבוש עם משקל מולקולרי 30,000 לנתק קרום Ultracel.
- תתרכז מדגם <500μl ידי ספינינג ב 6000 XG, 30 ° C, 5 דקות (או עד נפח מרוכז מושגת) בתוך הרוטור בזווית קבועה. בטל לזרום.
- מוסיפים את שאר המדגם (ים) את המכשיר Ultra-4 Amicon מסנן צנטריפוגלי ולהביא את נפח של עד 5 מ"ל-4 עם הצפת Rnase חינם TE 1X.
- תתרכז מדגם <500μl ידי ספינינג ב 6000 XG, 30 ° C, 5 דקות (או עד נפח מרוכז מושגת) בתוך הרוטור בזווית קבועה. בטל לזרום.
- הוסף 4-5 מ"ל של הצפת Rnase חינם TE 1X אל המכשיר Ultra-4 Amicon מסנן צנטריפוגלי. תתרכז מדגם <500μl ידי centrifuging XG ב 6000, 30 ° C, 5 דקות (או עד נפח מרוכז מושגת) בתוך הרוטור בזווית קבועה. בטל לזרום.
- חזור על שלב 4.5 תוספת 5 פעמים לחלוטין desalt מדגם חומצות גרעין (ים).
- העברת דגימת הנותרים (ים) צינור סטרילי Eppendorf 1.7ml. הוסף 1/10th נפח 3M נתרן אצטט, pH 7.0, שני כרכים של 100% אתנול, ו 1μl של Glycoblue. מערבבים היטב על ידי vortexing.
- צנטריפוגה ב 28,000 XG, 4 ° C, 60 דקות. למזוג לוודא לא להפריע גלולה. הוסף 300μl של אתנול 70%. ספין על 28,000 טמפרטורה, XG החדר למשך 10 דקות. למזוג, יבש resuspend כל שבריר בנפח מתאים של חיץ TE Rnase חינם.
5. נציג תוצאות:
איור 1 מסכם את השיטות שהוצגו באמצעות כרומטוגרפיה hydroxyapatite כדי ssDNA fractionate, dsDNA וחומצות גרעין RNA מתוך מכלול ויראלי מעורבת. שיטה זו מנצלת את האינטראקציה בין עמוד השדרה תשלום פוספטים טעונים שלילית של חומצות גרעין ו Ca מטען חיובי 2 + יונים נוכח hydroxyapatite ומאפשר חלוקה יעילה של תת חומצות גרעין (ssDNA, dsDNA ו-RNA) עם ריכוזים חיץ הגדלת פוספט 12.
חלוקה של hydroxyapatite ב "קהילה" מבחנה של ssDNA ידוע (M13mp18), dsDNA (למבדה) ו-RNA (MS2 ו phi6) הגנום הנגיפי מתוארת באיור 2. חומצות גרעין אוחדו בריכוזים שווים, להחיל את הטור hydroxyapatite והיו eluted באמצעות ריכוז גדל והולך של חיץ פוספט. כל תת סוג חומצות גרעין elutes עצמאית של אחרים עם פחות מ -9% לשאת מעל מ - חלק אחד למשנהו.
היישום של טכניקה זו על חומצות גרעין מבודדות מהקהילה ויראלי שנאספו במפרץ צ'ספיק מוצג באיור 3. התשואה הכוללת חומצות גרעין מבודד מפני וירוסים מטוהרים היה מוחל על הטור hydroxyapatite. חומר המורכב ssDNA הגנום, RNA dsDNA היה eluted עצמאי עם 0.12M, 0.20M ריכוזי 0.40M/1.00M של חיץ פוספט בהתאמה. פעמיים גדילי הדנ"א הוא eluted בריכוזים פוספט של 0.40M 1.00M ו - ובמקרה זה, זה שולט הקהילה ויראלי לעומת גנוטיפים ssDNA ו-RNA. תצפית זו עקבית עם הרכב הקהילה מצפה ויראלי של ימית סביבות estuarine שבה רוב של חומצות גרעין ההשבה הם dsDNA 13.
1. תרשים זרימה תרשים של השיטה כרומטוגרפיה hydroxyapatite עבור חלוקה של חומצות גרעין. תערובת של ssDNA, dsDNA ו-RNA מוכן במאגר פוספט 0.12M מחומם ל 60 ° C ו להחיל עמודה hydroxyapatite שמרו על 60 מעלות צלזיוס קבוע באמצעות אמבט מים במחזור. חומצות גרעין (ssDNA, RNA dsDNA) הם eluted מ hydroxyapatite עם ריכוז גדל והולך של חיץ פוספט המכיל. נתון זה שוחזר באישור האגודה האמריקנית למיקרוביולוגיה היה מובלט במקור אנדרוז-Pfannkoch et al. 2010 12.
איור 2. הפרדת ידוע חומצות גרעין ויראלית באמצעות כרומטוגרפיה hydroxyapatite. ריכוזים שווים של M13mp18 ssDNA, MS2 ssRNA, phi6 dsRNA ו למבדה dsDNA (2-5 נתיבים, בהתאמה) אוחדו (מסלול 6) ויישומי לעמודה hydroxyapatite. Singlדואר גדילי דנ"א (M13mp18), רנ"א (MS2/phi6) ו dsDNA (למבדה) היו eluted עצמאי מהעמודה hydroxyapatite באמצעות 0.12M (מסלול 8), 0.18M (סמטה 9) ו 0.40M/1.00M (מסלול 10) . סולם 1kb (מסלולים 1, 7) שימש כדי לאשר בגדלים הגנום. נתון זה שוחזר באישור האגודה האמריקנית למיקרוביולוגיה היה מובלט במקור אנדרוז-Pfannkoch et al. 2010 12.
איור 3. ההפרדה של חומצות גרעין ויראליות מבודד מהקהילה בתוך מפרץ צ'ספיק. חומצות גרעין בודדו ויישומי לעמודה hydroxyapatite. ssDNA (נתיב 0.12M), רנ"א (נתיב 0.20M) ו dsDNA (נתיבי 0.40M/1.0M) היו eluted באופן עצמאי באמצעות חיץ פוספט בריכוז של 0.12M, 0.20M ו 0.40M/1.00M, בהתאמה. ה-DNA היי המוניים סולם (נתיב L1) ו סולם 1kb (נתיב L2) שימשו חזותית לאשר משקל מולקולרי מסה המשוערים של חומצות גרעין. נתון זה שוחזר באישור האגודה האמריקנית למיקרוביולוגיה היה מובלט במקור אנדרוז-Pfannkoch et al. 2010 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המתודולוגיה כרומטוגרפיה hydroxyapatite המוצג כאן הוא כלי יעיל ביותר וחזק עבור חלוקה של חומצות גרעין מ מכלולים ויראלי מעורבת, כאשר המטרה היא ללמוד את הרכב הכולל חומצות גרעין הקהילה. באופן כללי, ssDNA, RNA dsDNA יהיה elute מן הטור פו פוספט בריכוז חיץ גדול יותר כ ~ 0and 0.40M בהתאמה. עם זאת, כל הכנה של hydroxyapatite יכול להיות בהרכב מעט שונה ופרופיל elution ולכן חשוב לבדוק כל הכנה באמצעות חומצות גרעין ידועים (למשל, מתוך הכנה וירוס מעובדים). זה יאפשר למשתמש לקבוע את ריכוזי ספציפי של פוספט המכילים מאגרי צריך elute חומצות גרעין הרצוי.
הגורם המגביל של טכניקה זו היא כמות Ca 2 + יונים זמין נוכח hydroxyapatite שיכול לאגד את עמוד השדרה פוספט של חומצות גרעין. Capacityamount של hydroxyapatite בעמודה יכול להיות scaled למעלה או למטה כדי עמודה (מוכתב על ידי גודל של עמודה מים במעיל וכמות hydroxyapatite בשימוש) והיקף מאגרים המשמשים elution תשודרג כלפי מעלה או מטה כדי להתאים קטן מאוד או כמויות גדולות מאוד של חומצות גרעין קלט, אבל בסופו של דבר הוא מוגבל על ידי גודל של עמודת המים במקטורן.
בנוסף, טכניקה אצווה שבו חומצות גרעין, hydroxyapatite, פוספט המכילים מאגרי משולבים צינור, מעורבים, centrifuged במהירות נמוכה היא דרך חלופית של בידוד חומצות גרעין ממוקדות. אסטרטגיה זו עשויה להועיל במקרים מסוימים, אבל הוא לא אמין כמו שיטות chromatographic שהם מדויקים יותר ולספק חלוקה טובה יותר של חומצות גרעין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי משרד המדע (BER), משרד האנרגיה של ארה"ב, שיתופית הסכם לא. De-FC02-02ER63453, רצף הגנום מיקרוביאלית הקרן הלאומית למדע של התוכנית (מספרים הפרס 0626826 ו 0731916). אנו מודים ג'ון זכוכית עבור המומחיות הטכנית שלו עצות ק 'אריק Wommack עזרתו עם אוסף מדגם הסביבה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Econo-Column | Bio-Rad | 737-0717 | 0.7cm ID package/2 |
| Hydroxyapatite | Bio-Rad | 130-0520 | DNA Grade Bio-Gel HTP Gel, 100g/td> |
| Sodium Phosphate, Monobasic | VWR international | VW1497-01 | Monohydrate, Crystal 500g |
| Sodium Phosphate, Dibasic | VWR international | VW1496-01 | Anhydrous, Powder 500g |
| DEPC-treated Water | Invitrogen | AM9922 | 1L |
| 10% SDS Solution | Invitrogen | 24730-020 | UltraPure, 1L |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9262 | pH 8.0, 1L |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| 2ml serological pippette | VWR international | 89130-884 | Polystyrene, Sterile |
| BD Falcon Centrifuge Tubes | VWR international | 21008-936 | 15ml, Sterile |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1 v/v/v) | Invitrogen | 15593-031 | UltraPure, 100ml |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Device | EMD Millipore | UFC803024 | Ultracel-30 membrane |
| 20X TE Buffer, Rnase free | Invitrogen | T11493 | 100ml |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15mg/ml |
References
- Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The Unseen Majority. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).
- Hendrix, R. W. Bacteriophages: evolution of the majority. Theor Popul Biol. 61, 471-471 (2002).
- Weinbauer, M. G. Bacteriophages: Evolution of the Majority. FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).
- Dinsdale, E. A., Edwards, R. A., Hall, D. Functional Metabolic Profiling of Nine Biomes. Nature. 455, 830-830 (2008).
- McDaniel, L., Breitbart, M., Mobberley, J. Metagenomic Analysis of Lysogeny in Tampa Bay: Implications for Prophage Gene Expression. PLoS ONE. 3, e3263-e3263 (2008).
- Williamson, S. J., Rusch, D. B., Yooseph, S. The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Metagenomic Characterization of Viruses within Aquatic Microbial Samples. PLoS ONE. 3, e1456-e1456 (2008).
- Lang, A. S., Rise, M. L., Culley, A. I. RNA Viruses in the Sea. FEMS Microbiol Rev. 33, 295-295 (2009).
- Ng, T. F., Manire, C., Borrowman, K. Discovery of a Novel Single-Stranded DNA Virus from a Sea Turtle Fibropapilloma by using Viral Metagenomics. J. Virol. 83, 2500-2500 (2009).
- Rosario, K., Duffy, S., Breitbart, M. Diverse Circovirus-like Genome Architectures Revealed by Environmental Metagenomics. J Gen Virol. 90, 2418-2418 (2009).
- Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities. Science. 312, 1795-1795 (2006).
- Bernardi, G. Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite. Nature. 209, 779-779 (1965).
- Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages. Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).
- Wommack, K. E., Colwell, R. R. Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems. Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).
