Summary
एक तीन आयामी clonogenic परख है कि अग्नाशय की तरह progenitors इंसुलिन व्यक्त कालोनियों में अंतर करने के लिए अनुमति देता है वर्णित है. इस विधि अर्द्ध ठोस methylcellulose Matrigel, और वृद्धि कारकों से युक्त मीडिया का लाभ लेता है, जिसमें एकल progenitors पैदा करना और अंतर
Protocol
1. इन विट्रो में अग्नाशय की तरह कोशिकाओं को murine ES कोशिकाओं के भेदभाव कॉलोनी परख के लिए वातानुकूलित मीडिया (मुख्यमंत्री) को उत्पन्न करने के लिए
Murine ES सेल रखरखाव के लिए प्रक्रियाओं, आगे भेदभाव embryoid शरीर के लिए (EB) निलंबन, संस्कृति, और अनुलग्नक संस्कृति में गठन के पहले किया गया है 1-3 वर्णित है और इस रिपोर्ट का ध्यान केंद्रित नहीं कर रहे हैं. हमारे भेदभाव प्रोटोकॉल में शामिल कदम के एक योजनाबद्ध प्रस्तुति चित्र 1 में दिखाया गया है.
आदेश में उच्च गुणवत्ता वाले वातानुकूलित मीडिया को प्राप्त करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है करने के लिए पहली बार 6 दिन पुरानी ईबीएस जिसमें कम से कम उनमें से 30-40% कम से कम 150 सुक्ष्ममापी के diameters के साथ कर रहे हैं उत्पन्न. बड़ा ईबीएस प्रकाश खुर्दबीन के नीचे काले धब्बे, बढ़ाया भेदभाव (चित्रा 2) सुझाव शामिल करना चाहिए. उच्च गुणवत्ता भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) का चयन करने के लिए ऐसे ईबीएस उत्पन्न करने के लिए महत्वपूर्ण है. उच्च गुणवत्ता FCS बहुत उनके differentiat का समर्थन करने की क्षमता के आधार पर चयन कर रहे हैं1 इंसुलिन, ग्लूकागन और बाद के चरणों में एमिलेज 2A जीन अभिव्यक्ति (18-20 दिन) के रूप RT-पीसीआर विश्लेषण से पता लगाया की ओर ईबीएस के आयन. इसके अलावा, जब 6 दिन ईबीएस निलंबन संस्कृति से लगाव संस्कृति (लगभग 80 - 6 अच्छी तरह से प्लेट में अच्छी तरह से प्रति 100 ईबीएस) को हस्तांतरित कर रहे हैं यह महत्वपूर्ण है करने के लिए धीरे प्लेटों को बारी बारी से करने के लिए कुओं के केंद्र में दिन 6 ईबीएस इकट्ठा. कारणों अज्ञात युद्धाभ्यास है कि सेल सेल बाद लगाव संस्कृति मंच में अग्नाशय की तरह ईबीएस से कोशिकाओं के बेहतर विकास में संपर्क परिणाम बढ़ाने के लिए.
- संस्कृति 13 दिन, नए सिरे से लगाव संस्कृति के साथ लगाव संस्कृति मीडिया (DMEM/F-12 (01:01), 15% पीटा सीरम प्रतिस्थापन, 2 मिमी एल glutamine, 50 यू / एमएल पेनिसिलिन, 50 स्ट्रेप्टोमाइसिन / μg एमएल) की जगह मीडिया containing10 मिमी nicotinamide, 0.1 एनएम exendin 4, और 10 एनजी / एमएल मानव रीकॉम्बीनैंट activin SSB (सभी सांद्रता अंतिम हैं).
- संस्कृति 16 दिन, 1.1 कदम से मीडिया को इकट्ठा करने और इसे 0.2 सुक्ष्ममापी polyethers के माध्यम से फिल्टरulfone झिल्ली. इस बिंदु से आगे एकत्र मीडिया वातानुकूलित मीडिया (मुख्यमंत्री) के रूप में संदर्भित किया जाएगा. अशेष भाजक 15 एमएल फाल्कन ट्यूबों में मुख्यमंत्री और यह -80 में दुकान डिग्री सेल्सियस तक सिर्फ अर्द्ध ठोस संस्कृति से पहले (3 नीचे खंड देखें).
2. प्राप्त करने अग्नाशय की तरह एक प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टर का उपयोग एकल कक्ष निलंबन में progenitors
एक दस्तक murine ES सेल लाइन, 4 Ngn3-EGFP, जहां EGFP रिपोर्टर जीन की जगह Ngn3 बिन्दुपथ के एक एलील पहले वर्णित है. Ngn3 2 है एक बुनियादी प्रतिलेखन (bHLH) हेलिक्स पाश - हेलिक्स युक्त कारक के रूप में भेदभाव किया गया था के रूप में नामित अग्नाशय के विकास के दौरान endocrine progenitors द्वारा व्यक्त 5 दिन 16 संस्कृतियों सामान्य रूप से विभेदित Ngn3 EGFP + और Ngn3 EGFP प्राप्त हल किया गया - कोशिकाओं 1,2.
- हदबंदी में विभेदित कोशिकाओं की एक एकल कक्ष निलंबन.
- सेते वाई दिन 16 संस्कृतियोंवीं 0.25% trypsin EDTA (3 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस) संस्कृति कुओं से कोशिकाओं को बेदखल करने के लिए.
- Trypsin गतिविधि को रोकने के 10% एफसीएस जोड़ें.
- मैग्नीशियम और कैल्शियम मुक्त के साथ कोशिकाओं धो फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) 0.1% गोजातीय सीरम albumin (BSA) अपकेंद्रित्र, और 5 मिनट के लिए 300 XG पर युक्त.
- निकालें सतह पर तैरनेवाला और 4 मिलीग्राम / एमएल collagenase बी और 2000 यू / एमएल deoxyribonuclease मैं (DNase) (30 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस) के साथ सेल clumps सेते एक एकल कक्ष निलंबन का उत्पादन. 1000 μL विंदुक प्रयोग सेल छर्रों को हर 10 मिनट पृथक्करण की प्रक्रिया की रफ्तार बढ़ बाधित.
- धो PBS युक्त 0.1% BSA के साथ कोशिकाओं, और 5 मिनट के लिए 300 XG अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और पीबीएस में कोशिकाओं 0.1% BSA युक्त resuspend.
- छँटाई के लिए कक्षों की तैयारी.
- हर एमएल सेल छँटाई के दौरान सेल reaggregation को रोकने के निलंबन के लिए 2 μL DNase मैं (1 म्यू / एमएल) जोड़ें.
- एक 40 से 70 सुक्ष्ममापी मीटर के माध्यम से एकल कक्ष निलंबन दर्राबड़े सेल समुच्चय को हटाने के लिए esh.
- एकल कक्ष निलंबन DAPI (1 μg / एमएल अंतिम एकाग्रता) जोड़ें.
- एक सेल सॉर्टर पर प्रवाह cytometry डेटा मोल. एक MoFlo MLS (Beckman कल्टर) सेल सॉर्टर इस रिपोर्ट के लिए इस्तेमाल किया गया था.
- छँटाई के लिए सेल आबादी के Gating. Ngn3-EGFP + और Ngn3 EGFP कोशिकाओं gated आगे तितर बितर बनाम ओर तितर बितर साथ पहली बार कर रहे हैं (चित्र 3A), DAPI बनाम ओर तितर बितर (3B चित्रा), पल्स चौड़ाई बनाम ओर तितर बितर (चित्रा 3C) द्वारा पीछा किया, और अंत में FL1 बनाम ऑटो प्रतिदीप्ति (चित्रा 3 डी). Ngn3-EGFP की अंतिम सॉर्ट गेट + कोशिकाओं को जानबूझकर (चित्रा 3E, तीर) सही क्रम में Ngn3-EGFP के संदूषण की सीमा - छंटाई के दौरान कोशिकाओं के लिए ले जाया जाता है. नकारात्मक नियंत्रण gating के लिए, या तो Ngn3 EGFP-ES लाइन या एक ही मंच, दिन 16 संस्कृति जैसे TL1 ES कोशिकाओं (चित्रा 3 डी, बाएं पैनल) एक गैर ट्रांसजेनिक लाइन से इस्तेमाल किया जा सकता से दिन 6 ईबीएस.
- Ngn3-EGFP क्रमबद्ध करें + और Ngn3-EGFP
3. चढ़ाना अर्द्ध ठोस संस्कृति करने के लिए सॉर्ट किया गया कोशिकाओं
- Matrigel तैयारी.
- अशेष भाजक Matrigel ट्यूब प्रति 1 एमएल और -20 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग करने से पहले की दुकान.
- जमे हुए aliquots 4 में रखा जाना चाहिए ° सी रात या पर बर्फ के 3 घंटे के लिए सिर्फ पहले पिघलना उपयोग करने के लिए. Thawed aliquots बर्फ पर अर्द्ध ठोस संस्कृति की तैयारी के दौरान रहने के लिए resolidification से बचने चाहिए.
- Methylcellulose (3.3%) समाधान तैयारी.
Methylcellulose पाउडर autoclaved नहीं किया जा सकता है. आदेश में बैक्टीरिया मुक्त methylcellulose समाधान प्राप्त करने के लिए तैयार करने की प्रक्रिया के दौरान साफ वजन नौकाओं और autoclaved हलचल सलाखों, beakers, बोतल और अन्य हार्डवेयर का उपयोग करें.- Methylcellulose समाधान तैयार करने से पहले एक दिन, दुकान 4 बजे बाँझ दोहरा आसुत जल के 200 एमएल डिग्री सेल्सियस इसके अलावा, 2x के 500 एमएल DMEM/F12 (में पाउडर DMEM / F-12 भंग करके तैयार आसुत जल दोगुनी) मीडिया युक्त 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और तैयार100 / μg एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस
- Methylcellulose तैयारी के दिन पर, शीर्ष पर एल्यूमीनियम पन्नी की एक टुकड़ा के साथ एक 1000 एमएल कांच बीकर बाँझ दोहरा आसुत जल के 500 एमएल जोड़ें. कम से कम 30 मिनट के लिए उबाल लें करने के लिए हवा के बुलबुले के पानी से बाहर निकालने के लिए.
- 2000 एमएल कांच फ्लास्क में एक बड़े आकार हलचल पट्टी (लंबाई में कम से कम 3 इंच) रखें.
- उबलते पानी की 300 एमएल उपाय और यह फ्लास्क को हस्तांतरण.
- हलचल प्लेट (हीटिंग के बिना) पर फ्लास्क रखें. धीरे धीरे गर्म पानी हलचल हवाई बुलबुले पैदा करने से बचने के लिए.
- Methylcellulose पाउडर के 33 ग्राम वजन और बहुत धीरे धीरे गर्म पानी जोड़ने. गर्म पानी methylcellulose पाउडर कुशलता गीला और ठंडे तापमान में बाद विघटन सहायता के लिए आवश्यक है.
- पाउडर हलचल जारी रखें जब तक तापमान लगभग 40-45 करने के लिए कम है डिग्री सेल्सियस
- Methylcellulose मिश्रण ठंडा करने के लिए 200 एमएल ठंड बाँझ दोहरा आसुत जल जोड़ें. तुरंतके बाद, आप करने के लिए देखने के लिए समाधान पारदर्शी और चिपचिपा बारी शुरू, यह दर्शाता है कि methylcellulose चरण में जलीय भंग है चाहिए. हाथ ज़ुल्फ़ फ्लास्क समाधान सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से मिश्रित है.
- 500 एमएल ठंड 2x DMEM/F12 मीडिया जोड़ें. मिश्रण हाथ द्वारा ज़ुल्फ़ के लिए आगे बढ़ें.
- एक ठंडे कमरे में हलचल थाली पर प्लेस फ्लास्क, और धीरे धीरे 24-48 घंटे के लिए methylcellulose समाधान हलचल.
- भंडारण प्रति बोतल 125 एमएल, और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान में समाधान अशेष भाजक एक नमूना एक बाँझ petridish में तिरस्कृत किया जाना चाहिए और 37 में रखा डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर बाँझपन का परीक्षण करने के लिए. Thawed methylcellulose समाधान रेफ्रिजरेटर में 2 महीने के लिए रखा जा सकता है.
- वातानुकूलित मीडिया तैयारी.
पिघलना मुख्यमंत्री (खंड 1 देखें) से ठीक पहले का उपयोग करने के लिए. अर्द्ध ठोस संस्कृति तैयारी भर बर्फ पर मुख्यमंत्री रखें. - निम्न वृद्धि कारकों की तैयारी: 1.0 एम nicotinamide, 0.1 सुक्ष्ममापी exendin 4, 10 μg / एमएल पुनः संयोजक मानव activin βB, और 10 और मीटरयू, छ / एमएल VEGF-A. स्टोर और -20 पर nicotinamide exendin-4 ° सी और activin βB और VEGF -80 में एक डिग्री सेल्सियस, और उन्हें तुरंत उपयोग करने से पहले पिघलना. सभी अर्द्ध ठोस संस्कृति मीडिया घटकों चढ़ाना के दौरान बर्फ पर रखा जाना चाहिए. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इसके अलावा VEGF एक बाद में कॉलोनी के गठन के लिए आवश्यक नहीं पाया गया था 2.
- भ्रूण बछड़ा सीरम तैयारी. FCS उपयोग करने से पहले निष्क्रिय गर्मी होना चाहिए. 30 मिनट के लिए 56 एफसीएस सेते ° सी में एक पानी स्नान करने के लिए पूरक प्रोटीन निष्क्रिय. यदि प्रारंभिक FCS शेयर बोतल से अधिक 500 एमएल विभाज्य यह 125 एमएल शीशियों में रखती है. वृद्धि की सतह क्षेत्र पूरी मात्रा का भी और पूरी तरह से हीटिंग सुनिश्चित करेगा. -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से पहले बोतलें कमरे के तापमान पर कम से कम 1 घंटे के लिए शांत करने के लिए अनुमति दें Thawed FCS 0.2μm उपयोग करने से पहले फ़िल्टर्ड है.
- सॉर्ट किया गया कोशिकाओं के साथ संस्कृति घटकों का मिश्रण.
हर समय तैयारी के solidification को रोकने के दौरान कोशिकाओं और बर्फ पर सभी अर्द्ध ठोस मीडिया घटकों रखेंMatrigel. कि सभी आपूर्ति सहित Matrigel के साथ संपर्क में आते हैं, विंदुक युक्तियाँ, सीरिंज और सुई, ठंडा किया जाना चाहिए. -20 सी कम से कम आधा ° एक घंटे में उपयोग करने से पहले इन की आपूर्ति रखें.- प्रति अच्छी तरह से 24 अच्छी तरह से एक थाली में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की मात्रा का निर्धारण करते हैं. +२५,००० कोशिकाओं तक 24 अच्छी तरह से प्रति चढ़ाया जा सकता है. एक सेल घनत्व के प्रारंभिक प्रयोगों में टाइट्रेट करना प्रदर्शन के लिए इष्टतम बोने सेल नंबर निर्धारित सकता है.
- तालिका 1 में वर्णित अनुक्रम में एक तस्वीर टोपी (कृपया ध्यान दें कि कोशिकाओं के लिए समय से पहले उत्तेजना से बचने के पिछले जोड़ रहे हैं) के साथ एक 5 एमएल polystyrene ट्यूब संस्कृति घटक जोड़ें. Polystyrene ट्यूबों पहले 3.3% methylcellulose जोड़ें और सॉर्ट किया गया कोशिकाओं पिछले. ध्यान दें कि 3.3% methylcellulose समाधान के लिए तैयार हो सकता है और 16 आधा गेज एक सुई और एक पर्याप्त रूप से चिह्नित स्नातक की उपाधि प्राप्त की सिरिंज के साथ polystyrene ट्यूबों करने के लिए जोड़ा की जरूरत है. सामान्य में, क्रम में सही ढंग से चिपचिपा समाधान की मात्रा को मापने के लिए 3.3% methylcellulose प के रूप में,ution और अंतिम संस्कृति मिश्रण, यह महत्वपूर्ण है पहली सिरिंज में कुछ समाधान महाप्राण (व्यंजन), और फिर तुरंत समाधान बाहर धक्का हवा निष्कासित. 3.3% methylcellulose समाधान कमरे के तापमान पर गर्म किया जा सकता है अगर यह भी बाहर निकालना मुश्किल है. हालाँकि, सुनिश्चित करने के लिए, यह बर्फ पर ठंडा के बाद यह polystyrene ट्यूबों में और Matrigel के अलावा पहले तिरस्कृत है.
- अर्द्ध ठोस प्लेट सॉर्ट किया गया कोशिकाओं से युक्त मीडिया.
- Polystyrene ट्यूबों के टोपियां सुनिश्चित करने के बाद जगह में मजबूती से कर रहे हैं, हाथों से ट्यूबों को सख्ती से और अच्छी तरह हिला. वायु बुलबुले इस प्रक्रिया के दौरान उत्पन्न हो जाएगा.
- 5 मिनट के लिए बर्फ पर या छोटे हवाई बुलबुले की सतह जब तक ट्यूबों रखें.
- साढ़े 16 या 18 साढ़े गेज सुई के लिए सामग्री महाप्राण (व्यंजन) के साथ एक 1ml सिरिंज का प्रयोग करें. सीरिंज में हवा के बिना चिपचिपा समाधान की सटीक मात्रा आकर्षित 3.6.2 में सलाह का पालन करें.
- धीरे धीरे प्रत्येक-24 कुएं में मीडिया के 500 उल बग़ैर. उपयोगकम लगाव 24 अच्छी तरह से केवल प्लेटें. मीडिया सीधे जोड़ें अच्छी तरह से केंद्र के लिए. अर्द्ध ठोस मीडिया स्वचालित रूप से कुओं में बाहर फैल जाएगा. प्रत्येक प्रयोगात्मक नमूना के लिए, quadruplicated कुओं नियमित रूप से क्रम में इस्तेमाल किया सांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिणाम प्राप्त करने के. केवल एक क्षैतिज उन्मुख 24 अच्छी तरह से थाली के 4 अंतरतम स्तंभों संस्कृति के लिए उपयोग किया जाता है. सेल युक्त संस्कृति के आर्द्रीकरण सहायता बाँझ पानी के साथ शेष कुओं भरें.
- 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 हवा में कोशिकाओं को सेते हैं .
- वृद्धि कारकों के अलावा विलंबित. यह संभव है संस्कृति की दीक्षा के बाद वृद्धि कारकों जोड़ने. ऐसे युद्धाभ्यास के लिए कुछ वृद्धि कारकों के प्रभाव अस्तित्व का पता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ग्रोथ अच्छी तरह से 100 प्रति μL कारक समाधान एक 26 3 जी / 8 सुई के साथ एक एमएल सिरिंज के माध्यम से dripped किया जा सकता है और अर्द्ध ठोस मीडिया में फैलाना की अनुमति दी.
4. प्रकाश माइक्रो के तहत कॉलोनी गठन अवलोकनसामना
कक्ष चढ़ाना के तुरंत बाद मनाया जाना चाहिए कि एकल कक्षों बेतरतीब ढंग से कर रहे हैं और समान रूप से कुओं से बाहर भर में वितरित करने के लिए सुनिश्चित करें. यदि कोशिकाओं या परिणामस्वरूप कालोनियों के अधिकांश कुओं के मार्जिन पर वितरित कर रहे हैं, यह संकेत मिलता है कि कुओं में अर्द्ध ठोस मीडिया वितरण भी सशक्त किया गया था (3.7.4 अनुभाग देखें). संस्कृति कुओं के हाशिये पर meniscus प्रभाव कॉलोनी घनत्व के कारण उच्च केंद्र में रहने वालों की तुलना में किया जा सकता है.
- कालोनी नंबर मात्रा का ठहराव. 3 आयामी मीडिया की सुविधा के कारण, कालोनियों विभिन्न फोकल प्वाइंट पर दिखाई देगा. इस प्रकार, प्रत्येक कॉलोनी के लिए ध्यान देने की एक समायोजन प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा निरीक्षण के दौरान आवश्यक हो सकता है. -24 अच्छी तरह के तहत एक ग्रिड संलग्न जब क्रम में करने के लिए एक ही कॉलोनी में दो बार दर्ज से बचने के लिए गिनती. एक ग्रिड एक NUNC petridish (No.169558 Cat.) की दीवार को काटने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. एक रोशनी खुर्दबीन पर एक 10x उद्देश्य लेंस OBS के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिएकालोनियों erve और गिनती.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
पिछले प्रयोगों से पता चला था कि 2.5 x 10 5 murine R1 ES कोशिकाओं (50 एमएल मीडिया कुल में) के साथ शुरू एक के लिए लगभग 5000 उपयुक्त आकार दिन-6 ईबीएस उत्पन्न करने के लिए उम्मीद कर सकता है. Ngn3-EGFP ES कोशिकाओं कम कुशल थे, 4 गुना अधिक कोशिकाओं को 6 दिन से समान आकार ईबीएस उत्पन्न करने के लिए आवश्यक थे. क्योंकि 25 दिन 6 ईबीएस 1.88 की एक औसत होते 0.67 ± x 10 5 कोशिकाओं, लगभग एक 37.6 x 10 6 कोशिकाओं 5000 ईबीएस से प्राप्त किया जा सकता है है . कोशिकाओं को लगाव संस्कृति के दौरान 2.72 ± 0.32 गुना विस्तार करने की उम्मीद कर रहे हैं 1 इस प्रकार, 5000 दिन-6 ईबीएस सॉर्ट करने से पहले लगभग 100 x 10 6 दिन-16 कोशिकाओं निकलेगा.. Gating के बाद, Ngn3-EGFP + कोशिकाओं कुल दिन 16 सेल की आबादी (प्रोटोकॉल पाठ खंड 2.2.5 और चित्रा 3) के लगभग 10% कर देगा.
Photomicrogr के उदाहरणइंसुलिन व्यक्त murine ES कोशिकाओं से व्युत्पन्न कालोनियों के aphs चित्रा 4 में दिखाया गया है. इन कालोनियों को एक विशिष्ट आकारिकी है, छोटे (~ 6-10 सुक्ष्ममापी) कालोनियों है कि छोटे, काले, और प्रकाश चिंतनशील नहीं कर रहे हैं में व्यक्ति की कोशिकाओं के साथ गोल कालोनियों. हमारे पिछले प्रकाशन में, 2 वास्तविक समय RT-पीसीआर और व्यक्तिगत हाथ उठाया कालोनियों की डबल immunofluorescent धुंधला इंसुलिन की अभिव्यक्ति, सी - पेप्टाइड और ग्लूकागन का पता चला. इन परिणामों एकल Ngn3-EGFP + कोशिकाओं की क्षमता को कम से कम दो आइलेट हार्मोन के साथ युक्त कोशिकाओं में अंतर, endocrine कोशिकाओं की तरह आदिम पहली लहर जैसी प्रदर्शित करता है .
छितरी एकल कक्षों के लिए कॉलोनी परख उन progenitors कि प्रसार और इन विट्रो में भेदभाव (चित्र 5) आरंभ करने के लिए क्षमता है के लिए अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है. इस प्रकार, यह एक परख है कि व्यक्तिगत पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के आंतरिक कार्य उपाय कर सकते है. progenitors कि capabi हैइंसुलिन इंसुलिन व्यक्त कालोनियों बनने के रूप में lity कहा जाता है व्यक्त कॉलोनी के गठन इकाइयों (ICFUs) (चित्रा 5). ICFUs लिए एमईएस सेल व्युत्पन्न आबादी से कोशिकाओं को समृद्ध कर रहे हैं 2 हालांकि, इन progenitors की आवृत्ति अभी भी विचार है कि विकासशील अग्न्याशय में Ngn3 endocrine पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के निशान, 5 Ngn3 EGFP-+, लेकिन नहीं Ngn3 EGFP अनुरूप कम, लगभग 0.1 कुल Ngn3 EGFP + दिन 16 संस्कृति से अलग आबादी के 0.6% ICFUs कर रहे हैं 2 बावजूद, कॉलोनी के गठन दक्षता में एक स्पष्ट अंतर है Ngn3-EGFP + कोशिकाओं के साथ उम्मीद की है, उच्चतम, द्वारा पीछा किया. presorted कोशिकाओं, और तब Ngn3-EGFP कोशिकाओं.
चित्रा 1 इन विट्रो murine ES कोशिकाओं अग्नाशय तरह की कोशिकाओं के लिए भेदभाव की समयरेखा . वातानुकूलित मीडिया पीढ़ी (मुख्यमंत्री) के लिए, murine ES celरास monothioglycerol की कम खुराक (6.0 x 10 के बाद चार दिनों के लिए पहले दो दिन और 6.0 x 10 -4 एम के लिए -3 एम) ईबीएस उत्पन्न के साथ पहले छह दिनों के लिए निलंबन में 15% FCS के साथ बड़े हो रहे हैं. ईबीएस दिन 6 (अच्छी तरह से प्रति 8-10) तब अनुलग्नक को हस्तांतरित कर रहे छह अच्छी तरह से 15% पीटा सीरम प्रतिस्थापन युक्त व्यंजन. 5% एफसीएस संस्कृति के 6-10 दिनों के बीच जोड़ा जा सकता है है ईबीएस की कुर्की की रफ्तार बढ़. Nicotinamide, 4-exendin, और मानव रीकॉम्बीनैंट activin βB तो संस्कृति 13 दिन (1.1 अनुभाग देखें) पर मीडिया के लिए जोड़ रहे हैं. मीडिया संस्कृति 16 दिन पर एकत्र की है और इस बिंदु पर वातानुकूलित मीडिया बन गया है. दिवस 16 कोशिकाओं तो हल कर रहे हैं और कॉलोनी परख के लिए अर्द्ध ठोस मीडिया में मढ़वाया.
चित्रा 2 बड़े दिन 6 embryoid murine भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न निकायों के प्रतिनिधि सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़. 6 ईबीएस आदर्श दिन diam में कम से कम 150 सुक्ष्ममापी हैंeter और अंधेरे केन्द्रों (तीर). जल्दी अग्नाशय के पूर्वज मार्कर (जैसे PDX-1 और Sox9 के रूप में) की अभिव्यक्ति इन ईबीएस (नहीं दिखाया डेटा है). 3 में बढ़ाया है
चित्रा 3 छंटनी एमईएस सेल व्युत्पन्न दिन 16 Ngn3 EGFP व्यक्त की कोशिकाओं के लिए द्वार. (ए) फॉरवर्ड और पक्ष स्कैटर फाटक, सेल आकार और क्रमश: granularity का संकेत है, गैर - सेलुलर मलबे को खत्म करने. (बी) DAPI मृत कोशिकाओं को, जो सकारात्मक दाग हो जाएगा जब 405-413 एनएम और उत्सर्जन एक 450/40 फिल्टर के साथ पाया पर उत्साहित की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है. पल्स चौड़ाई (सी), इलेक्ट्रॉनिक आगे तितर बितर नाड़ी की चौड़ाई, दोहरी, जो प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टर के माध्यम से पारित कर दिया किया जा रहा से पहले समाप्त किया जाना चाहिए पता चलता है. EGFP Gating (डी) (FL1 चैनल) बनाम autofluorescence का उपयोग TL1 (बाएं पैनल) के रूप में एक नियंत्रण पैतृक कोशिका लाइन से दिन-16 कोशिकाओं सच प्रतिदीप्ति और इस प्रकार Ngn3 EGFP illuminates <> + सेल की आबादी (सही पैनल) का समर्थन . (ई) लाल तीर पुस्तिका सिर्फ झूठी सकारात्मक कोशिकाओं की जुदाई में वृद्धि की छँटाई पहले EGFP + फाटक के सही पारी से पता चलता है. दोनों (डी) और (ई) क्षेत्रों पर आधारित gated हैं घटनाक्रम (R1 - R3) (एसी) में दिखाया गया है.
चित्रा 4 के प्रतिनिधि photomicrographs इंसुलिन अर्द्ध ठोस संस्कृति में कालोनियों व्यक्त. कालोनियों और बेतरतीब ढंग से वितरित कर रहे हैं छोटे अंधेरे, गैर प्रकाश चिंतनशील समूहों के रूप में दिखाई देते हैं. व्यक्तिगत कालोनियों बाद जीन और प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए RT-पीसीआर और immunohistochemistry विश्लेषण, क्रमशः (वीडियो देखने के लिए नहीं दिखाया गया है) द्वारा assayed किया जा सकता है.
5 चित्रा एक कॉलोनी परख है कि एकल पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के कार्यात्मक और मात्रात्मक आकलन की अनुमति देता है. परिणामस्वरूप कालोनियों के संख्यान freq की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता हैकुल मढ़वाया कोशिकाओं के बीच पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की uency. प्रत्येक कॉलोनी के भीतर कोशिकाओं की संरचना की शुरुआत पूर्वज के वंश की क्षमता का संकेत है. इस परख का प्रयोग, हमने पाया है कि Ngn3-EGFP + murine भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न कोशिकाओं के लिए 2 इंसुलिन व्यक्त कॉलोनी के गठन इकाइयों (ICFUs), पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं है कि क्षमता में अंतर है इंसुलिन व्यक्त कालोनियों . समृद्ध थे
तालिका 1 अर्ध ठोस संस्कृति मीडिया उपकरणों और संवर्द्धन के आदेश.
Discussion
कालोनी assays कि व्यक्ति अग्नाशय के progenitors के मात्रात्मक और कार्यात्मक मूल्यांकन की अनुमति अभी तक सीमित किया गया है, जो बहुत अग्नाशयी स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिका जीव विज्ञान की पढ़ाई में प्रगति में बाधा है. एक कॉलोनी परख का सार यह है कि यह पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की आंतरिक क्षमता है, बजाय केवल अपने phenotype के उपाय, पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की कार्यक्षमता और वंश क्षमता में मनाया जा करने के लिए अनुमति है. यह भी एक मात्रात्मक उपकरण है कि एक दिया आबादी में progenitors की संख्या निर्धारित कर सकते है. Hematopoietic स्टेम सेल के क्षेत्र में, कॉलोनी assays पहचान करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वृद्धि कारक आवश्यकताओं, बातचीत, और तंत्र इन कोशिकाओं के वंश प्रतिबद्धता शासी गूढ़ रहस्य अग्नाशय के पूर्वज कोशिका जीव विज्ञान, अग्नाशय 7 अंग के क्षेत्र में 6 . , 8 या थोक संस्कृतियों 9-13 तैयार किया गया है, तथापि, ऐसे assays जैविक questi नहीं पता नहींएकल कोशिका के स्तर पर ons. एकल कक्ष विश्लेषण के बिना, बहु संभावित अग्नाशय स्टेम / progenitors के अस्तित्व को स्पष्ट नहीं किया जा सिद्ध कर सकते हैं. 14
यहां हम बताते हैं कि इंसुलिन व्यक्त कॉलोनी बनाने progenitors एक तीन आयामी, Matrigel युक्त, संस्कृति अर्द्ध ठोस प्रणाली का उपयोग assayed किया जा सकता है. हालांकि निलंबन संस्कृति 15,16 प्रणाली विकसित किया गया है जो एक वयस्क अग्नाशय के progenitors पैदा करना और "pancreatospheres" में अंतर परमिट, हमारी कॉलोनी परख अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है है . सबसे पहले, हमारी संस्कृति अर्द्ध ठोस मीडिया प्रणाली की अनुमति देता है इसके विपरीत, 25,000 24 अच्छी तरह से प्रति हल प्रति 500 μL संस्कृति मीडिया कोशिकाओं जबकि रेखीय श्रृंखला में जिसके परिणामस्वरूप कॉलोनी गठन को बनाए रखने के चढ़ाना 2. निलंबन pancreatosphere परख एकल उपयोग की आवश्यकता सेल सेल सॉर्टर से बयान विधि एकल कक्ष विश्लेषण करने की अनुमति है, और इस प्रकार संस्कृति मीडिया और इनक्यूबेटर अंतरिक्ष की एक बड़ी मात्राआवश्यक हैं. इसलिए, हमारी कॉलोनी परख अपेक्षाकृत आसान और लागत प्रभावी है आचरण के लिए जब विभिन्न कक्षों की एक बड़ी संख्या पूर्वज गतिविधियों के लिए एक साथ तुलना करने की आवश्यकता है. दूसरा, हमारे अर्द्ध ठोस मीडिया बाह्य मैट्रिक्स घटक और वृद्धि कारक है, जो प्रसार और भेदभाव दोनों एक ही कुएं में होने के लिए अनुमति देता है के समान वितरण की अनुमति देता है. इसके विपरीत, इसे और अधिक कठिन है निलंबन संस्कृति में कोशिकाओं को ऐसे माहौल, विशेष रूप से मैट्रिक्स, प्रदान. हम जानते हैं कि हमारे विधि के साथ यह निश्चित नहीं किया जा साबित कर दिया कि प्रत्येक उपनिवेश एक एकल कोशिका से ली गई है सकते हैं, के रूप में दो progenitors बेतरतीब ढंग से एक दूसरे को और फार्म का एक कॉलोनी के पास तैनात किया जा सकता है. हालांकि, इस समस्या को माध्यमिक एकल कक्ष हेरफेर का उपयोग विश्लेषण द्वारा दूर किया जा सकता है. सॉर्ट किया गया एकल कोशिकाओं के प्रत्यक्ष हाथ उठा निश्चित प्रत्येक कॉलोनी के एकल कक्ष मूल का प्रदर्शन कर सकता है.
सारांश में, इंसुलिन व्यक्त समर्थक की कॉलोनी के गठन गतिविधिअर्द्ध ठोस मीडिया में genitors वर्णित इस के साथ साथ एकल कोशिका के स्तर पर अग्नाशय के progenitors के यंत्रवत अध्ययनों के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, एक पूर्व रिपोर्ट में हम Matrigel, बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन की एक कच्चे मिश्रण की है कि अतिरिक्त पाया, मीडिया संस्कृति में इंसुलिन Ngn3-EGFP + कोशिकाओं, 2 से व्यक्त कालोनियों बाह्य मैट्रिक्स का सुझाव दे के गठन के लिए आवश्यक है उन progenitors के लिए महत्वपूर्ण है. इस कॉलोनी परख का प्रयोग, यह अब संभव हो सकता है आगे टुकड़े करना और इस तरह की गतिविधि के लिए विशिष्ट मैट्रिक्स आवश्यकताओं को परिभाषित करेगा. माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न progenitors का अध्ययन करने के अलावा, हम वर्तमान में जांच कर रहे हैं कि इस में इन विट्रो परख प्रणाली भी अन्य विशिष्ट कालोनियों प्रसवकालीन और वयस्क चूहों के अग्न्याशय और जिगर से व्युत्पन्न के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मानव शव का अग्नाशय रहित ऊतकों से के गठन का समर्थन करता है islets की.
Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों murine Ngn3-EGFP भ्रूण स्टेम सेल लाइन, श्रीमती लूसी ब्राउन और सेल छँटाई में सहायता के लिए विश्लेषणात्मक Cytometry कोर के उपहार के लिए डा. क्लाऊस Kaestner धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम के हिस्से में एनआईएच R21DK069997 अनुदान और R01DK081587 HTK के लिए सम्मानित किया गया और पुनर्योजी चिकित्सा (सीआईआरएम) के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट से प्रशिक्षण मेगावाट और लोकसभा के लिए सम्मानित किया अनुदान से वित्त पोषित किया गया
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X DMEM/ F-12 (1:1) | Mediatech, Inc. | 15-090-CV | |
| Fetal Calf Serum | Tissue Culture Biologicals | 201 | Refer to Section 1.1 |
| L-glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| 1X Dulbecco’s PBS | Mediatech, Inc. | 21-031-CV | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8412 | 7.5 % |
| Matrigel | BD Biosciences | 356231 | Reduced Growth Factor |
| Methylcellulose | Sinetsu Chemical | 1,500 centipoise (high-viscosity) | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human Recombinant Activin βB | R&D Systems | 659-AB-025 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich | E7144 | |
| Human Recombinant VEGF-A | R&D Systems | 293-VE-010 | |
| 24-well plates | Costar | 3473 | Ultra-low Attachment |
| 60mm Petri Dish with Grid | Nalge Nunc international | 169558 |
References
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