Summary
Pankreas gibi atalarıdır insülin ifade koloniler içine ayırt etmek için izin veren üç boyutlu clonogenic tahlil açıklanmıştır. Bu yöntem, metilselüloz, Matrigel ve büyüme faktörleri içeren yarı-katı medya yararlanır, tek atalarıdır çoğalırlar ve ayırt
Abstract
Pankreas kök ve progenitör hücre biyolojisi alanında eksikliği, tek bir hücrenin analizi için izin in vitro fonksiyonel ve kantitatif tayinlerde bir engel olmuştur . Su götürmez bir şekilde bireysel progenitörlerin soy potansiyelini göstermek için kesin yollar sağlar, çünkü tek atalarıdır analizi, kritik öneme sahip. Yöntemleri, tek hücre süspansiyon kültüründe "pancreatospheres" oluşturmak için icat edilmiş olmasına rağmen, bazı sınırlamalar mevcuttur. İlk olarak, tek bir hücrenin çok sayıda hücre birikimi, kültür ortamı ve uzay geniş hacimli, dönüş komutları. Gerçekleştirmek için zaman alıcıdır İkincisi, ortaya çıkan pancreatospheres sayılandırma pancreatosphere başlatan atalarıdır sıklığının düşük olduğunu, özellikle emek-yoğun. Üçüncü olarak, pancreatosphere tahlil yeniden, aynı kültürün yayılması ve pankreas atalarıdır farklılaşma hem de izin için etkili bir yöntem değildirtestin yararlılığı stricting.
Bu sınırlamaları aşmak için, pankreas atalarıdır için yarı-katı medya tabanlı koloni tahlil geliştirilmiştir ve bu raporda sunulmuştur. Bu yöntem, farklılaşma yaygınlaşması ve ayrıca tabi olarak progenitör hücreleri üç boyutlu uzayda kalmak için izin metilselüloz medya viskozite sağlamak için kullanıldığı hematopoetik koloni tahlil, mevcut bir kavram yararlanır. Zenginleştirmek için insülin ifade eden heterojen bir nüfus atalarıdır koloni oluşturan hücreleri kullanılan ifade neurogenin (NGN) 3, pankreatik endokrin progenitör hücre belirteci. Murin embriyonik kök (ES), gelişmiş yeşil flüoresan protein muhabiri ile etiketlenmiş Ngn3 ifade hücreleri sıralanır ve başına kadar çok 25.000 hücreleri düşük eki, 24-kuyu kültür kaplarına içine kaplama hücre kökenli. Aşağıdaki ana bileşenleri ile yarı-katı medya her yer 500 mcL: tanıştımhylcellulose, Matrigel, nikotinamid, eksendin-4, aktivin βB ve klimalı medya fare ES hücre kökenli pankreas gibi hücreler toplanır. 8 ila 12 gün sonra kültür, insülin ifade özgü morfolojisi kolonileri kuruldu ve her koloninin soy kompozisyonunu belirlemek için kantitatif RT-PCR ve immunoflourescent boyama kullanarak pankreas gen ekspresyonu için daha fazla analiz edilebilirdi.
Özetle, koloni test kolay algılama ve hücrelerin heterojen bir nüfus içinde fonksiyonel atalarıdır ölçümü sağlar. Buna ek olarak, yarı-katı medya formatı in vitro proliferasyon ve ayırt atalarıdır sağlayan hücrelere ekstraselüler matriks bileşenleri ve büyüme faktörleri tek tip bir sunum sağlar . Bu koloni tahlil tek hücre düzeyinde pankreas progenitör hücrelerin mekanik çalışmalar için eşsiz fırsatlar sağlar.
Protocol
1. Farklılaşma, pankreas-benzeri hücreler in vitro fare ES hücrelerinin koloni tahlil için klimalı ortam oluşturmak için (CM )
Fare ES hücre bakımı için prosedürler, daha fazla farklılaşması için süspansiyon kültür ve ek kültür embriyoid vücut (EB) oluşumu, daha önce 1-3 açıklanan ve bu raporun odak olmuştur. Şematik bir sunum farklılaşma protokolde yer alan adımları Şekil 1'de gösterilmiştir.
Yüksek kaliteli şartlandırılmış ortam elde etmek için, ilk önce, bunların en az% 30-40, en az 150 mm çapları ile olduğu 6 gün eski EBS oluşturmak için önemlidir. Büyük EBS gelişmiş farklılaşma (Şekil 2) öne ışık mikroskobu altında koyu renkli lekeler, içermelidir. Yüksek kalitede fetal buzağı serumu (FCS) seçimi gibi EBS oluşturmak için kritik öneme sahiptir. Yüksek kalite FCS pek çok diferansiye desteklemek için yeteneklerine göre seçilirEBS iyon insülin 1, glukagon ve daha sonraki aşamalarda amilaz 2A gen ekspresyonu (18-20 gün), RT-PCR analizi ile tespit doğru. Hafifçe kuyuların merkezi haline toplamak için gün-6 EBS plakaları döndürmek için önemli Ayrıca, gün-6 EBS süspansiyon kültürünün eklenti kültür (6 kuyucuğu iyi ortalama 100 EBS yaklaşık 80) aktarılır. Sonraki eki kültür aşamasında EBS pankreas gibi hücrelerin daha iyi gelişme hücre-hücre temas sonucu geliştirmek nedenleri bilinmiyor, manevralar için.
- Kültür 13. günde, taze ek kültürü ile eki kültür ortamı (DMEM/F-12 (1:1),% 15 nakavt serum değiştirme, 2 mM L-glutamin, 50 U / ml penisilin, 50 mikrogram / ml streptomisin) yerine medya containing10 mM nikotinamid, 0.1 nM eksendin-4, ve 10 ng / mL insan rekombinant aktivin SSB (tüm konsantrasyonlarda kesindir).
- Kültür günde 16, 1.1 adım medya toplamak ve 0.2 mikron polieterler filtresindenulfone membran. Bu noktadan itibaren toplanan medya klimalı ortam (CM) olarak sevk edilecektir. Kısım 15 ml Falcon tüp içine CM ve -80 ° C 'ye kadar yarı-katı kültür hemen önce (bkz. Bölüm 3).
2. Pankreas gibi bir floresan aktif hücre sıralayıcı kullanarak tek bir hücre süspansiyonu atalarıdır Elde Etme
Knock-fare ES hücre hattı, 4 EGFP muhabiri gen Ngn3 lokus bir alleli, daha önce açıklanan 2 Ngn3 bir temel içeren helix-loop-heliks (bHLH) transkripsiyon faktörü olarak farklılaşmış yerine Ngn3 EGFP, olarak belirlenmiş 5 Gün-16 kültürleri normal gelişimi sırasında pankreatik endokrin atalarıdır ifade farklılaşmış Ngn3 EGFP + ve Ngn3 EGFP elde sıralaması - hücreleri 1,2
- Farklılaşmış hücreler tek bir hücre süspansiyonu çözülmesi.
- Inkübe gün-16 kültürleri with% 0.25 tripsin-EDTA (3 dk, 37 ° C) kültür kuyulardan hücreleri yerinden.
- Tripsin aktivitesi durdurmak için% 10 FCS ekleyin.
- , Magnezyum ve kalsiyum hücre yıkayın fosfat tamponlu salin (PBS) 5 dakika boyunca 300 xg'de% 0.1 sığır serum albumini (BSA) ve santrifüj içeren.
- Süpernatantı ve 4 mg / ml kollajenaz B ve 2000 U / ml deoksiribonükleaz (DNaz) (30 dk, 37 ° C) ile hücre kümeleri, tek bir hücre süspansiyonu üretmek için kuluçkaya yatmaktadır. Hücre pelet ayrışma sürecini hızlandırmak için her 10 dakikada bir bozabilir 1000 mcL pipet kullanın.
- Hücreleri% 0.1 BSA içeren PBS ile yıkayın ve 5 dakika boyunca 300 xg'de santrifüj.
- Süpernatantı ve% 0.1 BSA içeren PBS ile hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin.
- Sıralama için hücrelerin hazırlanması.
- Sıralama sırasında hücre reaggregation önlemek için her türlü mL hücre süspansiyonu için 2 mcL DNaz I (1 MU / ml) ekleyin.
- 40 - 70 mikron m yoluyla Pass tek hücre süspansiyonubüyük hücreli agrega kaldırmak için ESH.
- Tek hücre süspansiyonu DAPI (1 mcg / mL son konsantrasyon) ekleyin.
- Bir hücre sıralayıcı flow sitometri veri elde. MoFlo MLS (Beckman Coulter) hücre sıralayıcı bu rapor için kullanılmıştır.
- Sıralama için hücre popülasyonlarının yolluk. Ngn3-EGFP + ve - Ngn3-EGFP hücreleri forward scatter karşı tarafında dağılım ile ilk kapılı (Şekil 3A), DAPI karşı tarafında dağılım (Şekil 3B), darbe genişliği vs. Tarafında dağılım (Şekil 3C) tarafından takip ve nihayet FL1 vs otomatik floresans (Şekil 3D). Sıralama sırasında hücreler Ngn3-EGFP kirlenmesini sınırlamak amacıyla; Ngn3-EGFP nihai sıralama kapısı + hücreler bilerek hakkı (ok Şekil 3E) taşınır. Negatif kontrol için yolluk Ngn3-ES EGFP çizgi ya da aynı sahnede, gün-16 kültür TL1 ES hücreleri (Şekil 3D, sol panel) gibi transgenik olmayan bir çizgi, kullanılabilir, her iki gün-6 EBS.
- Sıralama Ngn3 EGFP + ve Ngn3 EGFP
3. Sıralanmış hücreleri yarı-katı kültür Kaplama
- Matrigel hazırlanması.
- Tüp başına 1 ml ve kullanmadan önce -20 ° C'de muhafaza kısım Matrigel.
- Donmuş halde 4 konulmalıdır ° C 3 saat kullanımdan hemen önce çözünmesi için gece boyunca ya da buz. Çözülmüş alikotları resolidification önlemek için, yarı-katı kültür hazırlanması sırasında buz üzerinde kalmalıdır.
- Metilselüloz solüsyonu (% 3.3) hazırlanması.
Metilselüloz toz otoklava olamaz. Bakteri serbest metilselüloz çözüm elde etmek için, hazırlık sürecinde temiz ağırlığındaki tekneler ve otoklava heyecan bar, bardak, matara ve diğer donanım kullanın.- Bir gün önce metilselüloz çözeltisi, steril çift distile su deposu 200 mL, 4 ° C Ayrıca, 2x 500 ml ve 100 U / ml penisilin içeren DMEM/F12 medya (toz DMEM / F-12 eriterek hazırlamak distile su iki katına) hazırlamak4 az 100 mcg / ml streptomisin ve mağaza ° C
- Metilselüloz hazırlık gününde, üstüne bir parça alüminyum folyo ile 1000 ml'lik cam behere 500 mL steril çift distile su ekleyin. Hava kabarcıkları su kurtulmak için en az 30 dakika kaynatın.
- 2000 ml'lik cam balona büyük ölçekli bir heyecan bar (uzunluğu en az 3 inç) yerleştirin.
- 300 ml kaynar su ölçün ve erlene aktarın.
- Bir heyecan plaka (ısıtma olmadan) şişesi yerleştirin. Yavaş yavaş hava kabarcıkları oluşturarak önlemek için sıcak su karıştırılır.
- Metilselüloz tozu 33 gram ağırlığında ve çok yavaş sıcak su ekleyin. Sıcak su verimli metilselüloz tozu, ıslak ve soğuk sonraki çözülme yardım etmek için gerekli.
- Toz sıcaklığı yaklaşık 40-45 azalır kadar çırpmaya devam edin ° C
- 200 ml soğuk steril çift distile su soğutma metilselüloz karışıma ekleyin. Hemensonra, bu metilselüloz sulu fazına çözme gösteren, çözüm saydam ve viskoz açmak görmek için başlamalıdır. Çözüm sağlamak için El girdap şişeyi iyice karıştırılır.
- 500 ml soğuk 2x DMEM/F12 medya ekleyin. Karıştırmak için elle girdap devam edin.
- Soğuk bir odaya heyecan plaka şişesi koyun ve yavaş yavaş 24-48 saat metilselüloz çözüm karıştırın.
- Depolama şişe başına 125 ml, ve -20 ° C'de saklayın içine kısım çözüm Bir örnek steril bir petridish boşaltılan ve 37 ° C inkübatör sterilite test konulmalıdır. Çözülmüş metilselüloz çözüm 2 aya kadar buzdolabında saklanabilir.
- Koşullu ortam hazırlanması.
Çözülme CM (bkz. Bölüm 1) hemen önce kullanın. CM yarı katı kültür hazırlama boyunca buz üzerinde tutun. - Aşağıdaki büyüme faktörleri hazırlayın: 1.0 M nikotinamid, 0.1 mcM eksendin-4, 10 mcg / ml rekombinant insan aktivin βB, ve 10 & mu, g / ml VEGF-A. ° C ve aktivin βB ve VEGF-A -80 ° C -20 nikotinamid ve eksendin-4 saklayın ve kullanmadan önce bunları hemen Çözülme. Bütün yarı katı kültür ortamı bileşenleri kaplama sırasında buz üzerinde tutulmalıdır. Ayrıca VEGF-A daha sonra koloni oluşumu için gerekli olduğunu belirtmek gerekir. 2
- Fetal buzağı serumu hazırlanması. FCS kullanım önce inaktive ısı olmalıdır. 30 dakika boyunca FCS inkübe 56 ° C kompleman proteinleri inaktive bir su banyosu. Ilk FCS stok şişe fazla 500 ml kısım 125 ml flakon içine tutar. Tüm hacim, yüzey alanı artırılmış ve hatta iyi bir ısıtma sağlayacaktır. -20 ° C'de saklamadan önce şişe en az 1 saat oda sıcaklığında soğumaya bırakın Çözülmüş FCS 0.2μm kullanmadan önce filtre edilir.
- Sıralanmış hücreler kültür bileşeninin karıştırın.
Katılaşma önlemek için her zaman hazırlanması sırasında buz üzerinde hücreleri ve tüm yarı-katı ortam bileşenleri tutunMatrigel. Dahil olmak üzere Matrigel ile temas eden tüm kaynakları, pipet uçları, şırıngalar ve iğneler, soğuk olmalıdır. -20 ° C ile en az yarım saat kullanmadan önce bu malzemeleri koyun.- Kişi başına 24 plaka numaralı seribaşı olması hücrelerin miktarı belirleyin. 24-de ortalama 25.000 hücrelere kaplama olabilir. Bir optimal tohumlama hücre sayısını belirlemek için ilk deneylerde hücre yoğunluğu bir titrasyon gerçekleştirebilir.
- Tablo 1'de açıklanan sıra bir çırpıda kapağı (hücrelerin erken uyarılması önlemek için son eklenen olduğunu unutmayın) ile 5 ml polistiren tüp kültür bileşenlerini ekleyin. Ilk polistiren tüpler için% 3.3 metilselüloz ekleyin ve sıralaması hücreleri son. % 3.3 metilselüloz çözüm hazırlanan ve 16 ½ gauge iğne ve yeterli işaretlenmiş mezun şırınga ile polistiren tüpler eklenecek ihtiyacı olduğunu unutmayın. Için doğru bir biçimde genel olarak,% 3.3 metilselüloz sol gibi, viskoz çözümleri hacmini ölçmek içinution ve nihai bir kültür karışımı, ilk şırınga bazı çözüm aspirat için önemli, ve hemen ardından havayı dışarı atmak için çözüm dışarı itmek. Çizmek için çok zor ise% 3.3 metilselüloz çözüm oda sıcaklığına kadar ısıtılmalıdır. Ancak, polistiren tüp içine ve Matrigel ek önce reçete sonra buz üzerinde soğutulur sağlar.
- Sıralanmış hücreleri içeren yarı-katı medya Plate.
- Polistiren tüplerin kapakları olduktan sonra sıkıca yerinde, güçlü ve tüpler ellerinizi iyice sallayın. Hava kabarcıkları bu işlem sırasında oluşturulur.
- 5 dakika boyunca buz üzerinde veya küçük hava kabarcıkları yüzeyine kadar tüpler yerleştirin.
- Içeriğini aspire 16 ½ veya 18 ½ iğne ile 1 ml şırınga kullanın. Şırınga hava olmadan viskoz çözüm doğru hacmi çekmek için 3.6.2 tavsiyelerine uyun.
- Yavaş yavaş her 24-iyi medya 500 uL dağıtmak. Kullanımdüşük ek 24 kuyucuğu sadece. Medya iyi merkezine doğrudan ekleyin. Yarı-katı medya kuyularda otomatik olarak yayıldı. Her deneysel örnek için, quadruplicated kuyu rutin istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek amacıyla kullanılır. Sadece yatay odaklı bir 24 plaka 4 içteki sütun kültür için kullanılmaktadır. Içeren hücre kültürü nemlendirme yardım etmek için, steril su ile kalan kuyuları doldurun.
- 37 ° C ve% 5 CO 2 hava hücreleri inkübe edin.
- Büyüme faktörlerinin yanı sıra Gecikmeli. Kültür başlandıktan sonra büyüme faktörleri eklemek mümkündür. Bu tür manevraları bazı büyüme faktörlerinin sağkalım etkileri gidermek için kullanılan olabilir. 26 G 3 / 8 iğne ile 1 ml şırınga ile damladı iyi ortalama 100 mcL büyüme faktörü çözümleri ve yarı-katı ortama diffüz olabilir.
4. Işık mikro altında koloni oluşumu Gözlembaşa çıkmak
Hücreler tek hücre rastgele ve kuyulardan dışarı boyunca eşit olarak dağıtılmasını sağlamak için kaplama sonrası hemen dikkat edilmelidir. Hücreleri veya ortaya çıkan koloniler en kuyuların marjı dağıtılır, bu kuyuların içine yarı-katı medya dağıtım (bkz. bölüm 3.7.4) çok zorlayıcı olduğunu gösterecektir. Kültür kuyuların marjları menisküs etkisi koloni yoğunluğu nedeniyle merkezde ikamet edenlere göre daha yüksek olabilir.
- Koloni sayısı kantifikasyon. 3-boyutlu medya özelliği nedeniyle, koloniler farklı odak noktaları belirir. Böylece, her koloni için odak bir ayarlama, ışık mikroskobu ile gözlem sırasında gerekli olabilir. Iki kez aynı koloni kayıt önlemek için sayarken 24 altında bir ızgara takın. Bir ızgara, bir Nunc petridish (Kat. No.169558) duvar kesim tarafından elde edilebilir. Işık mikroskobu 10x objektif lens atıl olarak kullanılan olmalıdırerve ve kolonilerin sayısı.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Önceki deneyler, 2.5 x 10 5 fare R1 ES hücrelerinin (50 ml medya toplam) ile başlayan biri yaklaşık 5000 uygun büyüklükte gün-6 EBS oluşturmak için bekliyor olabilir göstermişti . Ngn3 EGFP ES hücrelerinin daha az verimli; 6 gün 4 kat daha fazla hücre oluşturmak için benzer büyüklükte EBS istendi. 25 gün-6 EBS içerdiğinden 1.88, ortalama ± 0.67 x 10 5 hücreleri, 1 yaklaşık olarak 37.6 x 10 6 hücre, 5000 EBS elde edilebilir . Ekin kültür sırasında hücreler 2.72 ± 0.32 kat artması beklenmektedir. 1 Bu nedenle, 5000 gün-6 EBS sıralamadan önce yaklaşık 100 x 10 6 gün-16 hücreleri verecektir. Yolluk sonra, Ngn3 EGFP + hücrelerin toplam 16 gün hücre popülasyonu (Protokol Metin Bölüm 2.2.5 ve Şekil 3) yaklaşık% 10 kadar yapacak.
Örnek photomicrogrfare ES hücrelerinin insülin ifade koloniler APHS Şekil 4'te gösterilmiştir. Bu koloniler belirgin bir morfoloji; koloniler küçük, karanlık ve yansıtıcı ışık değil, tek tek hücrelerin (~ 60-100 mm) ile küçük yuvarlak koloniler. Daha önceki yayın, 2 real-time RT-PCR ve tek tek elle toplanır koloniler çift immunofluorescent boyama, C-peptid ve glukagon insülin ifade saptandı. Bu sonuçlar, endokrin hücreler gibi ilkel ilk dalga benzeyen, aynı anda en az iki adacık hormon içeren hücrelerin içine ayırt etmek için tek Ngn3-EGFP + hücreler yeteneğini göstermektedir .
Dağınık tek hücreler için koloni testi in vitro (Şekil 5) çoğalması ve farklılaşması başlatmak için kapasitesine sahip olanlar atalarıdır için çalışma sağlar. Böylece, bu içsel bireysel progenitör hücrelerin işlevini ölçebilirsiniz bir testtir. Capabi atalarıdırinsülin ifade koloniler olma vasıflı denir insülin ifade koloni oluşturan birim (ICFUs) (Şekil 5). MES hücre kökenli nüfus hücreleri ICFUs zenginleştirilmiş 2 Ancak, bu atalarıdır frekans hala gelişmekte olan pankreas Ngn3 işaretleri endokrin progenitör hücreler, 5 Ngn3-EGFP +, ama Ngn3 EGFP değil fikri tutarlı düşük; 16 gün kültürden izole edilen toplam Ngn3-EGFP + nüfusun yaklaşık% 0.1 -% 0.6 ICFUs 2 Ne olursa olsun, açık bir fark koloni oluşturan verimlilik, en yüksek Ngn3-EGFP + hücreler tarafından takip bekleniyor . sonra presorted hücreleri ve Ngn3 EGFP hücreler.
Şekil 1 pankreas benzeri hücreler in vitro fare ES hücrelerinin farklılaşma Timeline. Klimalı ortam (CM) üretimi için, fare ES cells EBS oluşturmak için monotiyogliserol azalan dozlarda (ilk iki gün ve 6.0 x 10 -4 M 6.0 x 10 -3 M aşağıdaki dört gün süreyle) ile ilk altı gün için% 15 FCS ile süspansiyon yetiştirilmektedir. Gün-6 EBS (iyi ortalama 80-100) sonra Eke aktarılır 6-iyi% 15 nakavt serum değiştirme içeren yemekler. % 5 FCS EBS eki hızlandırmak için kültür 6-10 gün arasında olabilir. Nikotinamid, eksendin-4 ve insan rekombinant aktivin βB sonra medya kültürü gün 13 (bkz. bölüm 1.1) eklenir. Medya kültürünün gün 16 toplanan ve bu noktada klimalı ortam haline gelmiştir. Gün 16 hücreler daha sonra sıralanır ve koloni tayini için yarı-katı ortama kaplanmıştır.
Şekil 2 fare embriyonik kök hücrelerinden elde edilen büyük gün-6 embriyoid organları Temsilcisi yüzey elde. İdeal günlük 6 EBS çapı en az 150 mikronaçmak mümkündür ve karanlık merkezleri (oklar). İfade erken pankreas progenitör belirteçleri (Pdx-1 ve Sox9) bu EBS (veriler gösterilmemiştir). 3 geliştirilmiş
Şekil 3. MES hücre kökenli gün-16 Ngn3 EGFP ifade hücrelerin kapıları Sıralama. (A) scatter kapıları, hücre boyutu ve sırasıyla taneciklik göstergesi İleri ve yan, hücresel olmayan bir enkaz ortadan kaldırır. (B) DAPI 450/40 bir filtre ile tespit 405-413 nm ve emisyon heyecanlı pozitif boyanmış olacaktır ölü hücreleri tanımlamak için kullanılır. (C) Darbe genişliği, elektronik forward scatter darbe genişliği, çiftlerin, floresan aktif hücre sıralayıcı geçirilerek önce ortadan kaldırılması gerektiğini ortaya koymaktadır. (D) EGFP Ayırıcı (kanal FL1) karşı TL1 (sol panel) gibi bir kontrol ebeveyn hücre hattı otofloresans gün-16 hücreleri kullanarak gerçek floresans ve böylece Ngn3-EGFP aydınlatan <> + hücre popülasyonu (sağ panel) destek. (E) Kırmızı ok sadece yanlış pozitif hücrelerin mesafeyi artırmak için sıralama önce EGFP + kapı manuel sağ-shift gösterir. Olaylar her iki (D) ve (E) bölgelere göre kapılı olan (R1 - R3) (AC) gösterilir.
Şekil 4 Temsilcisi fotomikrografı insülin ifade yarı katı kültür koloniler. Koloniler rastgele dağıtılan ve küçük, karanlık, ışık yansıtıcı olmayan kümeleri olarak görünür. Bireysel koloniler daha sonra, RT-PCR ve immünohistokimyasal analizler, (videoyu görmek gösterilmemiştir) tarafından, gen ve protein ekspresyonu için çalışılmalıdır.
Şekil 5, tek progenitör hücrelerin fonksiyonel ve kantitatif değerlendirmelere olanak sağlayan bir koloni tahlil . Kolonilerin sayılandırma frekans hesaplamak için kullanılırtoplam kaplı hücreler arasındaki progenitör hücrelerin uency. Her bir koloni içindeki hücrelerin oluşumu başlatan progenitör soyundan potansiyelinin göstergesidir. Bu testte, fare embriyonik kök hücrelerinden elde edilen Ngn3 EGFP + hücreler insülin ifade koloni oluşturan birim (ICFUs), içine ayırt etmek yeteneğine sahip progenitör hücrelerin insülin ifade koloniler 2 için zenginleştirilmiş olduğu bulundu.
(Tablo 1). Yarı-katı Kültür Medya Bileşenleri ve Toplama Düzeni.
Discussion
Bireysel pankreas atalarıdır kantitatif ve fonksiyonel değerlendirmeler izin Colony deneyleri pankreas kök ve progenitör hücre biyolojisi çalışmalarında ilerleme büyük ölçüde engellendiği, şimdiye kadar sınırlı kalmıştır. Bir koloni testinin özünü progenitör hücrelerin işlevselliğini ve soy potansiyelleri uyulması gereken izin, progenitör hücrelerin içsel yeteneği değil, sadece kendi fenotip ölçen. Aynı zamanda, belirli bir nüfus progenitörlerin sayısını belirlemek nicel bir araçtır. Hematopoetik kök hücre alanında, koloni deneyleri tanımlanmasında önemli rol oynadı, hem de bu hücrelerin köken taahhüt düzenleyen büyüme faktörü gereksinimleri, etkileşimleri, ve mekanizmaları deşifre var. 6 pankreas progenitör hücre biyolojisi, pankreas organı 7 alanında 8 veya toplu kültürleri 9-13 icat edilmiştir, ancak, bu tür testlerin biyolojik soru adresi yoktek hücre düzeyinde eklentileri. Tek hücre analizi olmadan, çok potansiyel pankreas kök / progenitörlerin varlığı su götürmez bir şekilde kanıtlanmıştır. 14
Burada olduğunu göstermektedir insülin ifade koloni oluşturan atalarıdır üç boyutlu Matrigel içeren, yarı katı kültür sistemi kullanılarak test edilmelidir. Bir süspansiyon kültürü sistemi 15,16 çoğalmalı ve "pancreatospheres" içine ayırt etmek için tek yetişkin pankreas atalarıdır izin geliştirilmiş olmasına rağmen, koloni tahlil ek avantajlar sağlar. İlk olarak, yarı-katı kültür medya sistemi, 24-de başına 500 mcL kültür ortamı başına 25.000 sıralanmış hücreler kadar kaplama lineer aralıkta meydana gelen koloni oluşumu korurken, 2 aksine, süspansiyon pancreatosphere testi tek kullanımını gerektirir sağlar hücre sıralayıcı hücre birikimi yöntemi tek bir hücre analizleri, izin ve böylece kültür ortamı ve inkübatör alanı daha büyük bir hacimgereklidir. Bu nedenle, bizim koloni tahlil progenitör faaliyetleri için aynı anda çok sayıda farklı hücreler karşılaştırıldığında gerekir yapmak için nispeten kolay ve uygun maliyetli. İkincisi, bizim yarı-katı medya ekstraselüler matriks bileşenleri ve büyüme faktörleri, hem proliferasyonu ve farklılaşması, aynı kuyuda meydana sağlar tekdüze dağılım sağlar. Aksine, hücre süspansiyon kültürü böyle bir ortamda, özellikle de matris sağlamak için daha zordur. Biz iki atalarıdır rastgele birbirlerine ve bir koloni yakın konumlandırılmış olabilir yöntemi ile kesin olarak, her koloninin tek bir hücrenin türetilmiş olduğunu ispat edilemez olduğunu farkındayız. Ancak bu sorun, tek bir hücre manipülasyonu kullanarak ikincil analizi ile üstesinden gelinebilir. Kesin sıralaması tek hücreleri doğrudan el toplama Her koloninin tek bir hücre kökenli göstermelidir.
Özet olarak, koloni oluşturan yanlısı aktivite insülin ifadeyarı-katı medya genitors burada açıklanan tek hücre düzeyinde pankreas atalarıdır mekanik çalışmalar için eşsiz fırsatlar sağlar. Örneğin, bir önceki raporda, medya kültürü içine insülin ifade ekstraselüler matriks düşündüren Ngn3-EGFP + hücreler, 2 koloniler oluşumu için gerekli olan Matrigel bu ek, ekstrasellüler matriks proteinleri ham karışımı bulundu . bu atalarıdır için önemlidir. Bu koloni testi kullanılarak, şimdi daha da inceleyecek ve bu tür faaliyet için özel matriks gereksinimleri tanımlamak mümkün olacaktır. Fare embriyonik kök hücrelerinden elde edilen atalarıdır eğitimi için ek olarak, şu anda bu in vitro test sisteminde ayrıca diğer ayırt edici perinatal ve yetişkin farelerin pankreas ve karaciğer türetilmiş koloniler yanı sıra yoksun insan kadavra pankreas dokusundan oluşumu desteği olup olmadığını araştırıyoruz adacık.
Disclosures
Biz ifşa etmek başka bir şey var.
Acknowledgments
Yazarlar, Dr Klaus Kaestner Ngn3-EGFP fare embriyonik kök hücre hattı, Bayan Lucy Brown ve hücre sıralama yardım için Analitik Sitometri Core hediye için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, MW ve LS verilen eğitim hibeleri HTK için verilen NIH hibe R21DK069997 ve R01DK081587 ve Rejeneratif Tıp (CIRM) için California Institute of kısmen finanse edildi
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X DMEM/ F-12 (1:1) | Mediatech, Inc. | 15-090-CV | |
| Fetal Calf Serum | Tissue Culture Biologicals | 201 | Refer to Section 1.1 |
| L-glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| 1X Dulbecco’s PBS | Mediatech, Inc. | 21-031-CV | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8412 | 7.5 % |
| Matrigel | BD Biosciences | 356231 | Reduced Growth Factor |
| Methylcellulose | Sinetsu Chemical | 1,500 centipoise (high-viscosity) | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human Recombinant Activin βB | R&D Systems | 659-AB-025 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich | E7144 | |
| Human Recombinant VEGF-A | R&D Systems | 293-VE-010 | |
| 24-well plates | Costar | 3473 | Ultra-low Attachment |
| 60mm Petri Dish with Grid | Nalge Nunc international | 169558 |
References
- Ku, H. T. Committing embryonic stem cells to early endocrine pancreas in vitro. Stem cells. 22, 1205-1217 (2004).
- Ku, H. T. Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors. Diabetes. 56, 921-929 (2007).
- Chen, C. Characterization of an in vitro differentiation assay for pancreatic-like cell development from murine embryonic stem cells: detailed gene expression analysis. Assay. Drug. Dev. Technol. 9, 403-419 (2011).
- Lee, C. S., Perreault, N., Brestelli, J. E., Kaestner, K. H. Neurogenin 3 is essential for the proper specification of gastric enteroendocrine cells and the maintenance of gastric epithelial cell identity. Genes. 16, 1488-1497 (2002).
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129, 2447-2457 (2002).
- Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81, 2844-2853 (1993).
- Gittes, G. K., Galante, P. E., Hanahan, D., Rutter, W. J., Debase, H. T. Lineage-specific morphogenesis in the developing pancreas: role of mesenchymal factors. Development. 122, 439-447 (1996).
- Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2. J. Cell. Biol. 143, 827-836 (1998).
- Bonner-Weir, S. In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 7999-8004 (2000).
- Gao, R. Characterization of endocrine progenitor cells and critical factors for their differentiation in human adult pancreatic cell culture. Diabetes. 52, 2007-2015 (2003).
- Gao, R., Ustinov, J., Korsgren, O., Otonkoski, T. In vitro neogenesis of human islets reflects the plasticity of differentiated human pancreatic cells. Diabetologia. 48, 2296-2304 (2005).
- Suarez-Pinzon, W. L., Lakey, J. R., Brand, S. J., Rabinovitch, A. Combination therapy with epidermal growth factor and gastrin induces neogenesis of human islet beta-cells from pancreatic duct cells and an increase in functional beta-cell mass. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 3401-3409 (2005).
- Hao, E. Beta-cell differentiation from nonendocrine epithelial cells of the adult human pancreas. Nature Medicine. 12, 310-316 (2006).
- Ku, H. T. Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies. Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).
- Seaberg, R. M. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nature Biotechnology. 22, 1115-1124 (2004).
- Rovira, M. Isolation and characterization of centroacinar/terminal ductal progenitor cells in adult mouse pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 75-80 (2010).
