Summary
Descrevemos o processo de isolamento de DNA de alta pureza herpesvirus nucleocapsídeo das células infectadas. O DNA final capturada a partir de solução é de alta concentração e pureza, tornando-a ideal para high-throughput seqüenciamento de alta fidelidade reações PCR e transfections para produzir novos recombinantes viral.
Abstract
Vírus são parasitas obrigatórios do interior celular e, assim, o estudo do seu DNA requer material isolante viral longe de contaminantes da célula hospedeira e DNA. Várias aplicações a jusante exigem grandes quantidades de DNA viral puro, que é fornecido por este protocolo. Estas aplicações incluem o seqüenciamento do genoma viral, onde a remoção do DNA do hospedeiro é fundamental para otimizar a saída de dados para seqüências virais, ea produção de novas linhagens recombinantes viral, onde co-transfecção de plasmídeos purificados e DNA viral linear facilita a recombinação. 1,2, 3
Este procedimento utiliza uma combinação de extrações e densidade baseado centrifugação para isolar DNA purificado herpesvirus linear nucleocapsídeo das células infectadas. 4,5 As etapas de purificação inicial visam isolar purificada capsídeos virais, que contêm e protegem o DNA viral durante a extração e as etapas de centrifugação que removem as proteínas celulares e DNA. Lise de nucleocapsids então libera DNA viral, e duas finais fenol-clorofórmio passos eliminar as proteínas restantes. O DNA final capturada a partir de solução é altamente concentrada e pura, com uma média de 260/280 OD de 1,90. Dependendo da quantidade de células infectadas utilizado, os rendimentos da faixa DNA viral 150-800 mg ou mais. A pureza deste DNA torna-se estável durante armazenamento a longo prazo em 4C. Este DNA é, portanto, ideal para high-throughput seqüenciamento de alta fidelidade reações PCR e transfections.
Antes de iniciar o protocolo, é importante saber o número médio de células por prato (por exemplo, uma média de 8 x 10 6 células PK-15 em um prato centímetros confluentes 15), eo título do estoque viral a ser usado ( por exemplo, 1 x 10 8 unidades formadoras de placas por ml). Estes são necessários para calcular a multiplicidade adequada de infecção (MOI) para o protocolo. 6 Por exemplo, para infectar um prato de 15 cm de PK-15 células com o estoque acima viral, em um MOI de 5, você usaria 400 mL de ações virais e diluir com 3,6 ml de meio (volume de inoculação total de 4 ml para uma placa de 15 cm).
Várias preparações de DNA viral podem ser preparados ao mesmo tempo. O número de preparações simultâneas é limitado apenas pelo número de tubos de posse do rotor ultracentrífuga (um por vírus; veja o passo 3.9). Aqui nós descrevemos o procedimento de como se está sendo feito por um vírus.
Protocol
1. Dia primeiro: Infecção viral e Preparação de Buffers
- Preparar pratos 50-10 (15 cm de diâmetro) de células de cultura de tecidos para a infecção, por exemplo, PK-15 células por vírus pseudo-raiva (PRV) ou células Vero para o vírus herpes simplex (HSV).
- Quando as células são 95 - confluentes 100%, infectá-los em um (MOI) de 10/05. Para fazer isso, inocular cada placa usando o estoque de vírus em um volume total de 4 ml por placa, em seguida, incubar as placas por 1 hora a 37 ° C. Placas de rocha suavemente a cada 15 minutos para garantir que a monocamada de células permanece totalmente revestida pela inóculo do vírus. Enquanto isso, aqueça o meio para a próxima etapa.
- Após uma hora de infecção, aspirado inóculo viral das placas, adicione 15 ml de meio quente, e incubar a 37 ° C por 12-20 horas em uma incubadora umidificada.
- Prepare buffers LCM (ver Tabela 1) e rock durante a noite a 4 ° C para homogeneização da mistura. Prepare TNE para a ressuspensão de DNA viral (ver Tabela 2).
2. Segundo dia, Fase 1: Lise Celular e Ultracentrifugação
- Confirmar visualmente que a infecção de células causou efeito citopático uniforme (CPE). Permitir a infecção progredindo até que todas as células têm arredondado para cima, mas ainda não decolou no prato.
- Raspe as células infectadas no meio, e combinar as células e médio em 50 ml tubos cônicos. O número de tubos cônicos necessários para esta etapa vai depender do número de pratos utilizados para a infecção no Passo 1.2 acima, por exemplo, um tubo de 50 ml cônica pode ser usado para pellet um máximo de 3 pratos de 15 ml de meio de cada Opcional:. Lave o placas com 10 ml de PBS e combinam com as células e médias empresas.
- Células centrífuga e médio por 10 minutos a 2000 centifugal força relativa (RCF) em temperatura ambiente, em seguida, aspire o sobrenadante e ressuspender cada pellet em 10 ml de PBS. Se o pellet de uma infecção viral foi espalhada em vários tubos cônicos na Etapa 2.2, estes podem ser recombinados em um tubo cônico nesta etapa. Repetir a centrifugação e aspiração Opcional:. Este pellet podem ser armazenadas a -20 ° C e do protocolo continuou em um momento posterior.
3. Segundo dia, Fase 2: Ultracentrifugação
Mantenha o pellet celular e buffers LCM no gelo sempre que possível durante as etapas seguintes.
- Adicionar β-mercaptoetanol para 0% de glicerol - buffer de LCM. Começar a resfriar a ultracentrífuga (para o passo 3.9), definindo-a 4 ° C e ligar o vácuo.
- Ressuspender o pellet celular em 5 ml de glicerol 0% - tampão LCM até que não é mais clumpy. Se necessário, o tubo de vórtice para quebrar qualquer célula não dissolvido pellet.
- Extrato, adicionando 1,5 ml Freon (1,1,2-tricloro-1 ,2,2-trifluoroetano) e vórtex vigorosamente. Imediatamente centrifugar por 10 min a 2000 rcf a uma temperatura de 4 ° C. Coletar a camada superior com uma ponteira de grande furo (evitando a interface) e transferir para um novo tubo Opcional:. Se o pellet é um sólido gelatinoso, você pode rapidamente despeje a camada superior para um tubo novo.
- Repetir a extracção Freon e centrifugar novamente.
- Coletar a camada superior (~ 5 ml) e transferir para um novo tubo polyallomer ultracentrífuga. Adicionar β-mercaptoetanol para o glicerol dois restantes - buffers LCM.
- Prepare um gradiente no tubo de ensaio polyallomer por underlaying o extrato Freon (camada superior) com 3 ml de glicerol 5% - LCM (camada intermediária), e depois underlaying novamente com 2,5 ml de glicerol 45% - LCM (camada inferior). Use uma pipeta fina para evitar o transbordamento do conteúdo do tubo.
- Se necessário, prepare um tubo de equilíbrio equivalente usando as mesmas proporções de buffers LCM.
- Transferência de tubos em baldes ultracentrífuga. Equilíbrio baldes para dentro de 0,1 g do outro, suavemente adicionando glicerol 0% extra - buffer de LCM para a camada superior (~ 5-10 mL de cada vez).
- Usando uma ultracentrífuga frio com um rotor horizontal balde ou balançando, spin amostras equilibrada durante 1 hora a 77.000 rcf (por exemplo, 25.000 rpm para um rotor SW41Ti) a uma temperatura de 4 ° C.
- Durante ultracentrifugação, fazer um gancho para capturar DNA de vidro flutuante na etapa de precipitação de etanol (4.6). Segure ambas as extremidades de uma pipeta Pasteur de vidro e suspender a parte do meio sobre uma chama. Quando uma seção de vidro é quase derretido, retire com cuidado para esticar o copo, dobre-o suavemente para criar um gancho bem anguladas (<90 graus), e puxe bruscamente para selar o fim. Se a ponta do anzol de vidro está aberto, segure a ponta sobre a chama para que o vidro derrete o suficiente para a fechar.
- Após a ultracentrifugação, você deve ver uma fina opaco pellet com uma mancha escura no meio. Aspirar cuidadosamente o líquido do tubo, incluindo drippings ao longo dos lados, mas evitando a pelota no fundo do tubo.
- Adicionar 0,5 ml TNE em temperatura ambiente.
- Deixe o pellet sentar-se por pelo menos 10 minutos para permitir a hidratação do sedimento. Optional: O pellet também pode ressuspender em TNE durante a noite, se for mantida a 4 ° C.
4. Terceiro Dia: "Ghost" Precipitação DNA
- Quebrar o pellet por pipetagem com uma ponteira de pequeno calibre (por exemplo, um p200 ponta da pipeta). Não se preocupe com corte nesta etapa, porque o DNA viral ainda está contida em capsídeos neste momento. Adicionar os reagentes a seguir ao tubo contendo o pellet viral, à temperatura ambiente, para destruir capsídeos:
- 4,25 ml TNE
- 0,25 ml SDS 10%
- 2 mg de proteinase K
Cuidado com corte a partir de agora, por exemplo, uso de grande calibre pipetas e não vortex o material viral
- Extrato de proteínas virais, adicionando 5 ml de fenol-clorofórmio e imediatamente começar a inverter ou vórtex para manter uma emulsão. Misture por 10 segundos, em seguida, centrifugar a emulsão de 5 minutos a 2000 rcf à temperatura ambiente. Coletar a camada superior com uma ponteira de grande diâmetro, evitando a interface, e transferir para um novo tubo Opcional:. Use fase de bloqueio de gel (PLG) tubos nesta etapa para evitar a contaminação a partir da interface.
- Repita a extração fenol-clorofórmio e centrifugar novamente.
- Após a extração do fenol-clorofórmio segundo, coletar a camada superior em um vidro de 30 ml tubo Corex e descontrair o tubo a -20 ° C por 10-15 minutos, tomando cuidado para que não congela.
- Adicionar 10 ml de etanol gelado, cobrir o tubo (por exemplo, que se estende um pedaço de Parafilm M sobre a parte superior), e inverta para misturar imediatamente. Assistir a um DNA "fantasma" para aparecer, que consiste de um precipitado ropy fina. Inverter o tubo suavemente para misturar mais e fazer com que o DNA sticky precipita a se agrupar.
- Use um gancho de vidro para capturar o fantasma DNA (s). Cuidadosamente blot o DNA para remover o excesso de líquido, em seguida, coloque o gancho (ponta para baixo) em um tubo de 1,5 ml e deixar secar. Adicionar ,25-,5 ml de TE para dissolver o fantasma DNA. Permitir a ressuspensão de DNA para continuar por pelo menos uma hora. DNA armazenar a 4 ° C. Opcional: Para maximizar o rendimento de DNA, romper o gancho de vidro dentro do tubo de 1,5 ml, de modo que a ressuspensão fora os fragmentos de vidro podem continuar ao longo do tempo.
5. Resultados representante
Com uma alta suficientemente MOI, as células devem atingir CPE total dentro ~ infecção pós 18 horas (hpi) para as estirpes do tipo selvagem PRV, e ~ hpi 24 para tipo selvagem HSV-1 amostras (Figura 1). Uma vez que o pellet celular infectado é colhido, os passos do protocolo restante pode ser completa em um dia inteiro ou realizadas durante dois dias (Figura 2).
Ao preparar anzóis de vidro para capturar o fantasma DNA, é importante fazer o ângulo de gancho ser inferior a 90 graus, para que mais tarde pode caber na base de um tubo de 1,5 ml (Figura 3). Vedação a ponta deste gancho impede a perda de DNA no interior da pipeta.
Fantasmas DNA formam durante a etapa de precipitação e vai aparecer como o branco, threads ropy (Figura 4). Estes agregados e ficar uns aos outros e / ou o gancho de vidro usado para capturar o DNA. Assim, o gancho mesmo vidro pode ser usado para juntar vários segmentos de DNA a partir da solução de precipitação.
| Escolha coluna com base no volume desejado: | 10 ml | 15 ml | 20 ml | 40 ml |
| KCL 1M | 1,3 ml | 1,9 ml | 2,5 ml | 5 ml |
| 1M Tris (pH 7,4) | 300 ml | 450 mL | 600 mL | 1,2 ml |
| 1M MgCl 2 | 50 ul | 75 mL | 100 l | 200 mL |
| EDTA 0,5 | 10 ml | 15 mL | 20 l | 40 mL |
| NP40/IGEPAL | 50 ul | 75 mL | 100 l | 200 mL |
| β-mercaptoetanol (adicione imediatamente antes da utilização) | 4,3 mL | 6,5 mL | 8,6 mL | 17,2 mL |
| Use proporções nas pesquisas de glicerol por cento desejado (0, 5 ou 45%) | ||||
| 0% de glicerol | Nenhum | Nenhum | Nenhum | Nenhum |
| água | 8,3 ml | 12,5 ml | 16,7 ml | 33,4 ml |
| Glicerol 5% | 0,5 ml | 0,8 ml | 1,0 ml | 2,0 ml |
| água | 7,8 ml | 11,7 ml | 15,7 ml | 31,4 ml |
| 45% glycerol | 4,5 ml | 6,8 ml | 9,0 ml | 18,0 ml |
| água | 3,8 ml | 5,7 ml | 7,7 ml | 15,4 ml |
Tabela 1. Receitas para a preparação de buffers LCM
| Para 50 ml |
| 5 ml NaCl 1M |
| 2,5 ml 1M Tris, pH 7.5 |
| 1 ml de EDTA 0,5 |
| 41,5 ml H 2 O |
Tabela 2. Preparação de TNE (0,1 M NaCl, 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM EDTA)
| Para 1 volume L |
| 0,2 g KCl |
| 0,2 g KH 2 PO 4 |
| 8 g de NaCl |
| 1.15g Na 2 HPO 4 |
| H 2 O para 1L |
Tabela 3. Preparação de PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4; 137 mM NaCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, pH 7,0)
Figura 1. Células PK15 (A) antes da infecção, (B) no meio de infecção, e (C) no efeito citopático (CPE), depois de uma multiplicidade de infecção.
Figura 2. Visão geral do protocolo.
Figura 3. Três exemplos representativos de vidro ganchos utilizados para recolher os fantasmas DNA viral.
Figura 4. Exemplo representativo de uma bem-formados e abundantes de DNA "fantasma".
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Discussion
Partes deste protocolo foram originalmente desenvolvidos para o isolamento do DNA viral no BSL4 condições, mas adapta-se igualmente bem a não-BSL condições. 4 Nós geralmente usam este protocolo para isolar o DNA do PRV alfa-herpesvírus e HSV-1, que têm genomas de DNA fechado em um capsídeo protéico e cercado por um envelope lipídico. 7,8 No entanto, é provável diretamente adaptável a outros vírus DNA de grande porte, incluindo beta-e gama-herpesvírus e adenovírus. Extrações semelhantes são comumente usados em busca de vírus RNA e 9.
A robustez deste resultado provável DNA preparação dos métodos múltiplos de purificação que estão incluídos. Inicial Freon extrações membranas lipídicas desnaturar, separando componentes celulares e também liberando o envelope lipídico e proteínas do tegumento externo que cercam capsídeos herpesvirus. Isto é seguido por ultracentrifugação, onde o nucleocapsids pesados viral pellet através de duas almofadas de gradiente, efetivamente separando-os da maioria dos outros componentes celulares. Estes são capsídeos ressuspenso, eo DNA viral nucleocapsídeo é liberado pela ruptura das capsídeos com proteinase K e detergente. Duas extrações com fenol-clorofórmio completamente remover componentes nucleocapsídeo e quaisquer proteínas restantes celular. Finalmente, a precipitação das grandes genomas de DNA viral em solução reduz transição de sais ou contaminantes particulados.
Este procedimento para isolar DNA viral nucleocapsídeo fornece abundante, material de alta pureza para aplicações a jusante. A combinação da extração de múltiplos passos de centrifugação e distingue este protocolo a partir de simples extração de um único protocolos que deixam restos celulares ou mais produtos de proteína degradada com o DNA 10. Contaminantes de proteína pode diminuir a estabilidade do DNA viral, e reduzir a eficiência de transfecção em células. Contaminantes DNA celular impactar negativamente as reações de PCR e protocolos de alto rendimento seqüenciamento. Um rendimento O DNA deste protocolo é também elevado, tornando-o adequado para restriction fragment length polymorphism (RFLP) e análise de Southern blotting. 5,11 Uma preparação nucleocapsídeo fornece suficiente material para todas essas análises.
A quantidade de células utilizadas para a infecção afeta a produção eventual de DNA viral. Para as estirpes PRV com uma taxa de crescimento do tipo selvagem, a entrada de pratos 5-10 de PK-15 células (um prato de 15 cm de diâmetro detém aproximadamente 8 x 10 6 células) tipicamente rendimentos 250-500 mg de DNA viral. Para os mutantes viral com um rendimento menor de virions infecciosos, o material de entrada deve ser escalado para cima em conformidade. Dobrar o número de entrada de pratos será aproximadamente o dobro do rendimento, e podem ser processados com as mesmas quantidades de reagentes descritos aqui. Para aumentar a entrada para além deste ponto, é recomendável separar o material de entrada em duas correntes paralelas manuseio (por exemplo, dois pellets de células e dois tubos de extracção) até a etapa 3.13. Dois pellets ultracentrifugação da mesma estirpe viral podem ser combinadas em um tubo nesta etapa de ressuspensão. Se o DNA não limpa forma de um fantasma no final do procedimento, a abordagem resolução de problemas principal é aumentar a quantidade de entrada de células, o que aumentará a produção de DNA e melhorar a sua precipitação.
Outras condições também podem afetar o sucesso da formação de fantasma. Por exemplo, é importante o tempo de colheita de infecções em um ponto quando nucleocapsids viral são abundantes, mas são na sua maioria intracelular ou associados a células. Vírions liberados para o meio não será capturado por este procedimento e, portanto, a colheita de células muito tarde na infecção (por exemplo, quando CPE progrediu ao ponto onde as células destacar do prato) vai reduzir o rendimento potencial de DNA e formação de fantasma. Também é importante para dissolver completamente o pellet celular colhidas no LCM buffer (Passo 3.2) para tirar o máximo proveito da etapa de extração seguinte; este ressuspensão requer mais tempo e cuidado se o pellet de células foi congelada na etapa anterior. Menores detalhes processuais afetar o rendimento de DNA também. Enquanto as etapas 3 e 4 podem ser realizados sem o uso de soluções de refrigerados e manter todos os tubos em gelo, a taxa de sucesso de fantasmas DNA é muito maior quando os reagentes são mantidos frio. Da mesma forma, a estabilidade da β-mercaptoetanol na solução diminui ao longo do tempo e, portanto, adicionando-o ao LCM soluções imediatamente antes da utilização otimiza sua capacidade de reduzir, melhorando a interrupção de proteínas e aumento da produção de DNA e formação de fantasma. Muita atenção a estes detalhes irá melhorar a saída de DNA viral de alta qualidade.
Como o DNA viral é viscoso, a solução resultante pode ser heterogêneo. Permitindo mais tempo para a ressuspensão do gancho de vidro aumenta o rendimento DNA útil e melhora a homogeneidade da solução. Espectrofotometria padrãopodem ser usados para quantificar o rendimento de DNA e pureza. Fluorimetria DNA fornece medidas ainda mais preciso da produção de DNA (por exemplo, Invitrogen PicoGreen dsDNA mancha).
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores agradecem as contribuições de Greg Smith, Pomeranz Lisa, Matt Lyman, Eldridge Marlies, Staniszewska Halina Goraczniak, e os membros do laboratório Enquist in fine-tuning protocolo isso.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freon (1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluor–thane) | Fisher Scientific | T178-4 | Check with your institution for guidelines on appropriate disposal of Freon-containing waste, or see Mendez et al. for potential Freon alternatives.9 |
| Phase lock gel tubes, Heavy 15ml capacity | 5 PRIME | 2302850 | Optional |
| Polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 331372* | *Select tubes appropriate for your own ultracentrifuge; these are included as an example only |
| NP-40 / IGEPAL | Sigma-Aldrich | I-3021 | |
| PK-15 cells | ATCC | CCL-33 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| PBS | Hyclone | SH30028.03 |
References
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