Summary
Herpetiformis דרמטיטיס (DH) היא מחלה דלקתית כרונית המאופיינת תגובה אוטואימונית בין IgA ו אפידרמיס transglutaminase (eTG). ד"ה מפתחת בחלק קטן מאוד של חולים הרגישים לגלוטן ו / או צליאק. תוצאות המחקר הזה מצביעים על כך ד"ה יכול גם להתפתח לארח רזוס קוף עם סימפטומים של אטופיק idiopatic.
Abstract
Transglutaminase רקמות 2 (tTG2) הוא אנזים העיכול במעיים אשר deamidates כבר מעוכל חלקית תזונתיים כגון פפטידים gliadin גלוטן. אצל אנשים נטייה גנטית, tTG2 מעורר תגובות אוטואימונית מאופיינים בייצור נוגדנים tTG2 בתצהיר ישירה שלהם לתוך 1,2 קטן בקיר המעי. נוכחות נוגדנים כאלה מהווה את אחד המאפיינים העיקריים של המחלה צליאק (CD). עוריות transglutaminase (eTG) הוא חבר אחר של המשפחה transglutaminase זה יכול לפעול גם autoantigen במיעוט קטן של חולים CD. אלה מקרים נדירים יחסית, eTG מעורר תגובה אוטואימונית (פריחה בעור) ידוע קליני herpetiformis דרמטיטיס (DH). למרות שהמנגנון המדויק של הפתוגנזה CD ו-DH אינה מובנת היטב, ידוע כי tTG2 ו eTG antigenic לשתף epitopes כי יכול להיות מוכר על ידי נוגדנים בסרום של חולים הן CD ו-DH 3,4.
ילדה = "jove_content"> במחקר זה, בדיקה מיקרוסקופית של דגימות ביופסיה confocal של נגעים בעור של שני קופי רזוס (Macaca המולאטית) עם דרמטיטיס (טבלה 1, איור. 1 ו -2) שימש כדי ללמוד את רקמות המושפעים. בשנת חיה אחת (EM96) חפיפה ספקטרלית של נוגדנים IgA ו tTG2 (איור 3) הודגם. נוכחות של פעמיים חיובי tTG2 + IgA תאים + היה ממוקד האפידרמיס עמוק, גבשושיות סביב עורי. זה עולה בקנה אחד עם נגעים המתוארים חולים DH 3. כאשר EM96 הושם על דיאטה נטולת גלוטן, דרמטיטיס, כמו גם tTG2 IgA + + פיקדונות נעלם כבר לא היו לגילוי (איורים 1-3). דרמטיטיס והופיע עם זאת, על סמך היכרות מחדש של גלוטן תזונתיים ב EM96 (לא מוצג). ב קופי אחרים, כולל בעלי חיים עם דרמטיטיס קשור, + + פיקדונות tTG2 IgA לא התגלו. דיאטה ללא גלוטן תלויי הפוגה של אטופיק ב EM96 יחד עם נוכחות של IgA tTG2 + + תאים בעור שלה להציע אוטואימוניות, כמו DH-מנגנון התפתחות של מצב זה. זהו הדו"ח הראשון של דרמטיטיס-DH כמו פרימטים לא אנושיים כלשהם.
Protocol
1. העור ביופסיה אוסף מדגם
- לפני הליך ביופסיה בעור, להרדים בעלי חיים לתוך שריר עם 2.5 מ"ג / ק"ג של hydrochloride tiletamine ו hydrochloride zolazepam תערובת telazol (Fort Dodge לבריאות בעלי חיים, Fort Dodge, IA). צג החיות מהממשל של הרדמה עד שכיבה ולאחר מכן להסיר מן המתחם שלהם.
- הסרת שיער מאזור העור של עניין ניצול הזהב אוסטר קליפר A5 מהירות יחיד וטרינרי עם להב בגודל 40 (אוסטר מקצועיים מוצר, Mcminnville, TN) וגם בסביבה נקייה מחיידקים, להכין עם לסירוגין לשפשף בבטאדין ואלכוהול. Secure וילון fenestrated סטרילי על האתר ביופסיה שנבחר.
- באמצעות טכניקה סטרילית, במקום 4.0 מ"מ Miltex Punch Dermal מכשיר ביופסיה (Miltex, יורק, פנסילבניה) על העור תוך כדי סיבוב המכשיר 180 מעלות בכיוון השעון נגד כוון השעון עם לחץ קל עד אגרוף ביופסיה transects דרך שכבות הדרמיס לתוך טי תת עוריתssue. הסר את דגימת ביופסיה ולתפוס את החלק transected של העור עם מלקחיים, פטורה הרקמה התת עורית.
- סגירת פגם עור עם תפר 3-0 ניילון קשור מחט חיתוך 08/03 מעגל (Ethilon, Ethicon, חברת Johnson & Johnson Medical בע"מ, ברקשייר, בריטניה) בדפוס הצולבות. תן את כל החיות 0.01 מ"ג / ק"ג hydrochloride עצירות (Hospira, בלייק פורסט, אילינוי) לתוך שריר עבור שיכוך כאבים שלאחר הניתוח.
2. לדוגמא עיבוד
- עבודה עם דגימות ביופסיה של העור מפני דלקת עור כרונית ושליטה בריא קופי רזוס. השג 02:58 (4 מ"מ קוטר) דגימות ביופסיה כל חיה.
- תקן במדגם הראשון פורמלין אבץ (Z-לתקן, Anatech בע"מ, Battle Creek, MI) למשך 24 שעות, לשטוף במים למשך 30 דקות, לשטוף בקצרה אתנול 70%, ואת המקום לתוך מעבד לייקה ASP300 רקמות (לייקה מיקרוסיסטמס , באפלו גרוב, KS) שבו הרקמה מיובש עם ציונים בסדר עולה של 70%, 80%, 95% ו 100% אתנול 48דקות כל אחד (פישר סיינטיפיק, פיטסבורג, פנסילבניה), ואחריו שני שינויים של קסילן (פישר).
- הטמע בתקשורת פרפין (פישר) עבור אחסון לטווח ארוך בטמפרטורת החדר. מקום ב-20oC במשך 20 דקות לפני חתך. הכן 6 חלקים מיקרומטר באמצעות microtome סיבובית (HM325, Microm הבינלאומי, וולדורף, גרמניה). מקום בסעיפים בשקופיות טעונים (פישר) ואוויר יבש ב 60oC לילה. הכתם עם hematoxylin ו eosin (H & E) שיטה סטנדרטית (המתואר להלן).
- תקן במדגם השני paraformaldehyde 2% (USB קורפ, קליבלנד, OH) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף שלוש פעמים שנאגרו מלוחים פוספט (PBS, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA), מקום סוכרוז 30% (פישר) עבור 4 שעות, להטביע במדיום הקפאת אוקטובר (סאקורה Finetek, Torrence, CA). שמור ב-80oC במשך 20 דקות לפני חתך. הכן 15 סעיפים מיקרומטר באמצעות cryostat (HM560, Thermo Scientific, Kalamazoo, MI).
3. H & E מכתים
- Deparaffinize להטביעסעיפים ded דרך שלושה שינויים של xylenes (פישר) ו רעננותם דרך ethanols מדורגים: שלושה שינויים של 100%, שני שינויים של 95%, שינוי אחד של 80% מים מזוקקים, 2 דקות כל אחד.
- הכתם עם hematoxylin (ריצ'רד אלן, מדעי, Kalamazoo, MI) דקות אחד אחר על ידי שטיפה קצרה במים זורמים מהברז.
- Counterstain עם eosin (Sigma) במשך 6 דקות.
- מייבשים רקמות מוכתמת דרך 95% אתנול ו המוחלט, שני שינויים של 2 דקות כל אחד ולאחר מכן נקה שלושה שינויים של xylenes, 3 דקות כל אחד.
- הר coverglass באמצעות הרכבה בינונית Cytoseal (ריצ'רד אלן, מדעי) על H & E מוכתם סעיפים רקמות.
4. Histopathological הערכה
בדיקת H & E מוכתם סעיפים העור ביופסיה תחת מיקרוסקופ אור באמצעות 4 - הגדלה 40X ו מיקרוסקופ הלייקה עם נקודה Insight מצלמה דיגיטלית (Digital מכשירים בע"מ, מישיגן, ארה"ב).
5. Immunofluorescent staiנינג
- עבודה עם אוקטובר, משובצים קטעים העור כתמים immunofluorescent. לפני מכתים, יש להשרות למשך 20 דקות ב PBS המכיל 0.2% עור הדג ג'לטין (FSG, Sigma) עם 0.1% טריטון X-100 (Sigma) כדי להסיר את אוקטובר ועד permeabilize הרקמה.
- אחרי כביסה את השקופיות, דגירה עם 10% עז בסרום נורמלי (NGS, Sigma), בדילול מלא PBS-FSG שעה 1, בטמפרטורת החדר, בחדר שקופיות humidified.
- על מנת להמחיש את בתצהיר של IgA ו tTG2 נוגדנים, דגירה שקופיות עם אנטי רזוס IgA ו tTG2 נוגדנים ראשוניים, מדולל ב -10% NGS-PBS-FSG שעה 1.
- לשטוף עם PBS-FSG-Triton X-100 (Sigma) במשך 10 דקות, ואחריו PBS-FSG במשך 10 דקות.
- דגירה עם משנית, אלוטיפ נוגדנים ספציפיים מתוייגים עם אלקסה פלואוריד fluorochrome 488 (ירוק), 568 (אדום) או 633 (כחול) (בדיקות מולקולריות, Invitrogen) בדילול 1:1,000. השתמש צבע ToPro-3 כדי להמחיש את ה-DNA גרעיני. השתמש ב -10% NGS-PBS-FSG diluent כמו נוגדן.
- השתמש פתרון אנטי מרווה (Sigma) לעלות את הסעיפים רקמה צבעונית.
6. Confocal הדמיה
ביצוע הדמיה עם TCS לייקה SP2 נכון מיקרוסקופ סורק לייזר Confocal (לייקה, Wetzlar, גרמניה) מצויד בשלושה לייזרים (שש שורות עבור עירור זמין): ארגון, קריפטון לייזר ב 488 ננומטר (ירוק), לייזר קריפטון ב 568 ננומטר ( אדום) לייזר הליום ניאון ב 633 ננומטר (כחול), כי ההיקף מן הגלוי לצד מרחיקות אדום של הספקטרום. ההפרש שיא הפרעה בניגוד (DIC) תמונות להערכת הארכיטקטורה אי שכותרתו רקמות.
7. נציג תוצאות
דוגמה חיובית להכרה של eTG ידי שני tTG2 ונוגדנים IgA מוצג באיור. 3A. בקנה אחד עם המצב בחולים אנושיים, בשל שכיחות נמוכה בהרבה של אטופיק ד"ה כמו מ CD-כמו רגישות לגלוטן גם קופי רזוס, רוב דגימות ביופסיה של העור צפויים show התגובה החיובית עם tTG2 נוגדנים אך ללא נוכחות של IgA tTG2 + + תאים חיובי כפול (איור 4). אלה DH-קשור המקרים, כולל במקרים דרמטיטיס ממוצא מיקרוביאלי, יגלה כמה חד תאים IgA חיובי + מפוזרים מתחת האפיתל אך לא חפיפה ספקטרלית בין tTG2 IgA ו-שכותרתו סמנים (איורים 3 ב ו - 4). לכן, חשוב לשמור על סדר הליכי הבדיקה הציע, החל בדיקה קלינית (איור 1), ואחריו הערכה histopathological (איור 2) ורק אם לא דרמטיטיס הגורמים אחרים, נפוצים יותר סוכנים ניתן לזהות, confocal בדיקה מיקרוסקופית של ביופסיות עור מוכתם עבור tTG2 ו IgA היא מוצדקת. הערכה קלינית ו / או histopathological לבדן אינן מספיקות לצורך אבחון חיובי של מצב זה. במקרים אלה, כאשר פעמיים חיובי (tTG2 + IgA +) תאים מזוהים מסביב לאזור של ואדומות עורי, ד"ה כמו אבחון דרמטיטיס ניתן להנפיק. במקרים כאלה, נסיגה של גלוטן תזונתייםוהמינהל של דיאטה נטולת גלוטן מומלץ על מנת להקל על הסימפטומים דרמטיטיס.
באיור 1. לאזור המפשעה של מקוק EM96 לפני (A) ואחרי (ב) הנסיגה של גלוטן תזונתיים במשך 5 שבועות. חידוש של גלוטן תזונתיים בקנה אחד עם הופעתו של דרמטיטיס (C).
באיור 2. HE מכתים של EM96 ביופסיות עור מקוק שנאספו לפני (A) ואחרי (ב) הנסיגה של גלוטן תזונתיים במשך 9 שבועות. ת: הוא אפיתל מעובה (7-15 שכבות לתאי האפיתל) עם קרום עבה של תאים שטחית hyperkeratotic הסתננו עם נויטרופילים המתנוונת. נויטרופילים להופיע גם בתוך האפיתל ו מעורבבים עם מספרים מתונה של לימפוציטים, תאים פלזמה ו היסטיוציטים סביב adnexa בדרמיס העליון. B: חלק hyperkeratosis עדיין קיים, עובי האפיתל הוא מנורמל (4-7 שכבות) עם חדירה מינימלית lymphoplasmacytic בדרמיס העליון. C: עור בטן רגיל מן מקוק FR56, עם חדירה לא lymphoplasmacytic, נכלל להשוואה. הגדלה 20x.
באיור 3. תמונות מיקרוסקופיה confocal של EM96 ביופסיות עור מקוק שנאספו לפני (A) ואחרי (ב) הנסיגה של גלוטן תזונתיים במשך 9 שבועות. ת: IgA מכתים (ירוק), tTG2 (אדום) ToPro-3 סמן דנ"א גרעיני (כחול). Co-לוקליזציה של IgA ו tTG2 מופיע צהוב מסביב לאזור של papilae עורי. ב ': מדגם העור נלקח לאחר 9 שבועות של דיאטה ללא גלוטן לא מראה IgA בתוך האפיתל בעוד כמה IgA subepithelial עדיין קיים (ירוק), tTG2 (אדום) ToPro-3 סמן דנ"א גרעיני (כחול).
איור 4.
| בעלי חיים תג | מין [ז / נ] | גיל [שנה] | תסמינים קליניים | פלזמה tTG2 נוגדנים | דיאטה [1,2] * |
| HJ71 | F | 1.3 | בריא | - | 1 |
| HD13 | M | 1.4 | בריאות, מדי פעם שלשולים | + | 1 |
| FR56 | M | 5.4 | שלשול כרוני אידיופטית | - | 1 |
| EM96 | F | 5.0 | דלקת עור כרונית | + / - (גבולי) | 1 ו 2 |
| GI24 | F | 4.6 | דלקת עור כרונית | - | 1 |
טבלה 1. TNPRC קופי רזוס המשמש לאיסוף ביופסיות עור
* דיאטה 1 - קבוע קוף צ'או (המכיל גלוטן); 2 דיאט - דיאטה ללא גלוטן
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שהוקם שלנו לא אנושיים מודל הפרימטים של רגישות לגלוטן היה בשימוש לאחרונה ללמוד את השינויים חדירות המעי מופעלות על ידי גלוטן בתזונה 5,6. פלזמה tTG2 נוגדנים, כמו גם במעיים tTG2 IgA + פיקדונות + התגלו כמה גלוטן רגיש קופי מקוק. מאז זיהינו לאחרונה מקרים נדיר של דרמטיטיס אידיופטית במושבה קופי רזוס, שם לא האטיולוגיה הרגיל (זיהומית / מטבולית) יכול להיות שהוקמה, מטרת המחקר הנוכחי הייתה להעריך אם tTG2 + IgA + פיקדונות נוגדן ניתן היה לזהות דגימות העור מפני אלה במקרים נדירים של דרמטיטיס (טבלה 1).
השכיחות של נוגדנים עצמיים tTG2 המעידים על טווחי תקליטור בין 1:70 לבין 1:200 7. המחקרים שלנו עם קופי גלוטן רגיש עולה כי השכיחות של נוגדנים tTG2 בשבי קופי רזוס דומה לזה שדווח מן האוכלוסייה האנושית. גורמים סביבתיים וגנטיים ראשי שעשוי להיות המשפיעים על היקף of שכיחות כגון בשני בני אדם קופי מקוק הם understudied 8,9. גורמים הקשורים לשכיחות נמוכה יותר של DH (1:400 עד 1:10,000) מ CD הם גם לא ידוע. לכן, מחקר קפדני יותר יש צורך ללמוד את CD ו-DH בפתוגנזה. דו"ח זה הוא הראשון להוכיח את קיומו של דרמטיטיס-DH כמו פרימטים לא אנושיים. למרות השכיחות של דלקת עור ד"ה כמו שנראה הרבה יותר נמוך מאשר השכיחות של enteropathy לגלוטן רגיש גם קופי מקוק, התוצאות המוצגות לספק תקווה למחקר עתידי, בהנחה שבעלי חיים נוספים עם דרמטיטיס ד"ה כמו יזוהו. גילוי פעמיים חיובי tTG2 + + IgA תאים ביופסיות עור של בעלי חיים מושפע מיקרוסקופיה confocal יהיה אינסטרומנטלי מאמצים כאלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות אמנדה Tardo, ד"ר מוסטאפה Bouljihad, סטפני פילי, קרול קוין, ד"ר ארין Ribka, ד"ר פיט דידייה ודורותי Kuebler לקבלת סיוע טכני שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים R01-DK076653 ו-3R01 DK076653-02S1 כדי KS ועל ההפעלה הבסיסית מענק של TNPRC RR000164.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Human IgA-FITC * | Sigma-Aldrich | F-5259 | 1:100 working dilution |
| Anti-Human tTG2 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | MS-300-P1ABX | 1:100 working dilution |
| Anti-Mouse IgG1 ** | Invitrogen | A-21124 | 1:1,000 working dilution |
| ToPro-3 DNA probe *** | Invitrogen | T-3605 | 1:1,000 working dilution |
| Zinc Formalin (Z-fix) | Anatech Ltd., Battle Creek, MI | 171 | |
| OCT Freezing Medium | Sakura Finetek | 4583 | |
| Cytoseal Mounting Medium | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Anti-Quenching Solution | Sigma-Aldrich | P 3130 | |
| Ethilon (Nylon Suture) | Ethicon Inc. | 663G | |
| Miltex Punch Dermal Biopsy Instrument | Miltex Inc. | NA | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with a size 40 blade | Oster Professional Products | 78005-050 | |
| Leica Tissue Processor | Leica Microsystems | ASP300 | |
| Rotary Microtome | Microm International | HM325 | |
| Cryostat | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HM560 | |
| Confocal Microscope | Leica, Wetzlar | TCS SP2 | |
| * Fluorescein isothiocyanate ** Secondary (Alexa Fluor 568-conjugated) antibody used after tTG2 primary antibody ** Dye |
|||
References
- Diosdado, B., Wijmenga, C. Molecular mechanisms of the adaptive, innate and regulatory immune responses in the intestinal mucosa of celiac disease patients. Expert. Rev. Mol. Diagn. 5 (5), 681-700 (2005).
- Schuppan, D., Dennis, M. D., Kelly, C. P. Celiac disease: epidemiology, pathogenesis, diagnosis, and nutritional management. Nutr. Clin. Care. 8 (2), 54-69 (2005).
- Sardy, M. Epidermal transglutaminase (TGase 3) is the autoantigen of dermatitis herpetiformis. J. Exp. Med. 195 (6), 747-757 (2002).
- Rose, C. Autoantibodies against epidermal transglutaminase are a sensitive diagnostic marker in patients with dermatitis herpetiformis on a normal or gluten-free diet. J. Am. Acad. Dermatol. 61 (1), 39-43 (2009).
- Bethune, M. Transepithelial transport and enzymatic detoxification of gluten in gluten-sensitive rhesus macaques. PLoS ONE. 3 (3), e1857-e1857 (2008).
- Mazumdar, K. Visualization of transepithelial passage of the immunogenic 33-residue peptide from α-2 gliadin in gluten-sensitive macaques. PLoS ONE. 5 (4), e10228-e10228 (2010).
- Schuppan, D., Junker, Y., Barisani, D. Celiac disease: from pathogenesis to novel therapies. Gastroenterol. 137 (6), 1912-1933 (2009).
- Hunt, K. Newly identified genetic risk variants for celiac disease related to the immune response. Nature Genet. 40 (4), 395-402 (2008).
- Abadie, V. Integration of genetic and immunological insights into a model of celiac disease pathogenesis. Annu. Rev. Immunol. 29, 493-525 (2011).
