Summary
La dermatite herpétiforme (DH) est une maladie inflammatoire chronique caractérisée par une réaction auto-immune entre les IgA et épidermique transglutaminase (GTE). DH se développe dans une très petite partie des patients sensibles au gluten et / ou cœliaque. Les résultats de cette étude indiquent que la DH peut aussi se développer chez un hôte singe rhésus avec des symptômes de la dermatite idiopathique.
Abstract
2 transglutaminase tissulaire (tTG2) est une enzyme digestive intestinale qui deamidates déjà partiellement digérés alimentaires peptides de gluten par exemple la gliadine. Chez les individus génétiquement prédisposés, tTG2 déclenche les réponses auto-immune qui se caractérise par la production d'anticorps et leur tTG2 dépôt direct en 1,2 mur de l'intestin grêle. La présence de ces anticorps constitue l'une des caractéristiques majeures de la maladie cœliaque (MC). Epidermal transglutaminase (ETG) est un autre membre de la famille transglutaminase qui peut également fonctionner comme un autoantigène dans une petite minorité de patients CD. Dans ces cas relativement rares, ETG déclenche une réaction auto-immune (une éruption cutanée) cliniquement connu comme la dermatite herpétiforme (DH). Bien que le mécanisme exact de la pathogenèse de CD et de DH n'est pas bien comprise, il est connu que tTG2 et ETG épitopes antigéniques part qui peut être reconnue par les anticorps du sérum de patients atteints de CD et de DH 3,4 fois.
(Macaca mulatta) atteints de dermatite (Tableau 1, Fig. 1 et 2) a été utilisée pour étudier les tissus affectés. Chez un animal (EM96) un chevauchement spectral des anticorps IgA et tTG2 (Fig. 3) a été démontrée. La présence de doubles-positifs tTG2 + cellules + IgA a été concentré dans l'épiderme en profondeur, autour de la papille dermique. Ceci est cohérent avec les lésions décrites chez des patients DH 3. Lorsque EM96 a été placé sur un régime sans gluten, la dermatite, ainsi que tTG2 + IgA + dépôts ont disparu et ne sont plus détectables (fig. 1-3). Dermatite réapparu cependant, basée sur la réintroduction du gluten dans EM96 (non représentée). En d'autres macaques, y compris les animaux sans lien avec la dermatite, l'tTG2 + IgA + dépôts n'ont pas été détectés. Régime sans gluten dépendant rémission de dermatite dans EM96 avec présence de tTG2 + IgA + cellules de sa peau suggèrent une auto-immunes, comme le DH-mécanisme pour le développement de cette condition. C'est le premier rapport du DH-comme la dermatite de quelque primate non humain.
Protocol
1. Collecte des échantillon de biopsie cutanée
- Avant de biopsie cutanée procédure, anesthésier les animaux par voie intramusculaire avec 2,5 mg / kg de chlorhydrate de tilétamine et le mélange de chlorhydrate zolazépam télazol (Fort Dodge Santé Animale, Fort Dodge, IA). Surveiller les animaux de l'administration de l'anesthésique jusqu'au décubitus puis retirer de leur enclos.
- Enlever les poils de la zone de la peau d'intérêt en utilisant une Oster Golden A5 tondeuse vétérinaire Single Speed avec une taille de 40 lames (Oster Professional Products, McMinnville, TN) et aseptique de préparer avec une alternance de Betadine scrub et l'alcool. Fixez un drapé fenêtrée stérile sur le site choisi biopsie.
- En utilisant une technique stérile, placer un 4,0 mm Miltex punch instrument de biopsie cutanée (Miltex, York, Pennsylvanie) contre la peau tout en tournant l'appareil de 180 degrés dans le sens anti-horaire et avec une légère pression jusqu'à ce que la biopsie des transects à travers les couches dermiques dans le ti-cutanéeUMÉRO. Retirer l'échantillon de biopsie et de saisir la partie sectionnée de la peau avec une pince et libre du tissu sous-cutané.
- Fermer le défaut de peau avec des sutures en nylon 3-0 attachée à une aiguille 3 / 8 cercle coupe (Ethilon, Ethicon, Johnson & Johnson Medical Limited, Berkshire, Royaume-Uni) dans un modèle croisé. Donner à tous les animaux 0,01 chlorhydrate de buprénorphine mg / kg (Hospira, Lake Forest, IL) par voie intramusculaire pour l'analgésie post-opératoire.
2. Le traitement des échantillons
- Travailler avec des échantillons de biopsie de peau de dermatite chronique et de contrôle sain macaques rhésus. Procurez-vous deux à trois (4 mm de diamètre) des échantillons de biopsie de chaque animal.
- Fixer le premier échantillon dans le formol zinc (Z-fix, Anatech Ltd, Battle Creek, MI) pendant 24 heures, laver à l'eau pendant 30 min, laver rapidement à l'éthanol 70%, et le placer dans la préparation des tissus ASP300 Leica (Leica Microsystems Inc , Buffalo Grove, KS), où le tissu est déshydraté avec des notes ascendantes de 70%, 80%, 95% et 100% d'éthanol 48minutes chacune (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), suivi par deux changements de xylène (Fisher).
- Intégrer dans les médias de paraffine (Fisher) pour stockage à long terme à température ambiante. Place à-20oC pendant 20 minutes avant la coupe. Préparer 6 sections um aide d'un microtome rotatif (HM325, Microm international, Waldorf, Allemagne). Placez sections sur des lames chargées (Fisher) et l'air sec à 60 ° C la nuit. Colorer à l'hématoxyline et l'éosine (H & E) méthode standard (décrit ci-dessous).
- Fix deuxième échantillon dans du paraformaldéhyde 2% (USB Corp, Cleveland, OH) pendant 30 min à température ambiante, laver trois fois en tampon phosphate salin (PBS, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA), dans 30% de sucrose (Fisher) pour 4 heures, et d'intégrer dans un milieu de congélation OCT (Sakura Finetek, Torrence, CA). Conserver à-80oC pendant 20 minutes avant la coupe. Préparer 15 sections um utilisant le cryostat (HM560, Thermo Scientific, Kalamazoo, MI).
3. Coloration H & E
- Déparaffiner intégrersections du DED à travers trois changements de xylènes (Fisher) et réhydrater travers éthanols graduée: trois changements de 100%, deux changements de 95%, un changement de 80% et d'eau distillée, à 2 min chacune.
- Colorer à l'hématoxyline (Richard-Allan scientifique, Kalamazoo, MI) pendant une minute et suivre par un bref lavage à l'eau courante.
- Contre l'éosine (Sigma) pendant 6 min.
- Déshydrater tissus colorés grâce à 95% et d'éthanol absolu, deux changements de 2 minutes chacun, puis clair dans trois changements de xylènes, à 3 min chacune.
- Lamelle en utilisant le mont Cytoseal milieu de montage (Richard-Allan scientifique) sur le H & E-sections de tissus colorés.
4. L'évaluation histopathologique
Inspectez H & E des sections colorées biopsie de la peau sous un microscope optique en utilisant les 4 - grossissement 40x et d'un microscope Leica avec une caméra SPOT Digital Insight (Digital Instruments Inc, au Michigan, Etats-Unis).
5. Immunofluorescence staiNing
- Travailler avec des sections de peau OCT-embarqué pour la coloration par immunofluorescence. Avant coloration, faire tremper pendant 20 min dans du PBS contenant 0,2% de la peau de gélatine de poisson (FSG, Sigma) à 0,1% Triton X-100 (Sigma) pour enlever les PTOM et pour perméabiliser les tissus.
- Après le lavage des lames, incuber avec 10% sérum normal de chèvre (NGS, Sigma), dilués dans du PBS-FSG pendant 1 heure, à température ambiante, dans une chambre de diapositives humidifié.
- Afin de visualiser les dépôts d'IgA et d'anticorps tTG2, incuber des diapositives avec des IgA anti-rhésus et tTG2 anticorps primaires, dilués dans 10% NGS-PBS-FSG pendant 1 heure.
- Laver avec du PBS-FSG-Triton X-100 (Sigma) pendant 10 min, suivie par PBS-FSG pendant 10 min.
- Incuber avec du secondaire, l'isotype des anticorps spécifiques marqués avec un fluorochrome Alexa Fluor 488 (vert), 568 (rouge) ou 633 (bleu) (Molecular Probes, Invitrogen) à 1:1000 dilution. Utiliser le colorant ToPro-3 pour visualiser l'ADN nucléaire. Utilisez les 10% de NGS-PBS-FSG comme diluant des anticorps.
- Utiliser la solution anti-trempe (Sigma) pour monter les coupes de tissu taché.
6. Imagerie confocale
Effectuer l'imagerie avec un Leica TCS SP2 microscope confocal à balayage laser vrai (Leica, Wetzlar, Allemagne) équipé de trois lasers (six lignes d'excitation disponibles): un laser argon-krypton à 488 nm (vert), un laser à krypton à 568 nm ( rouge) et un laser hélium-néon à 633 nm (bleu), qui couvrent du visible à l'extrémité rouge du spectre. Enregistrement de contraste d'interférence différentiel (DIC) des images pour l'évaluation de la non-étiquetés architecture tissulaire.
7. Les résultats représentatifs
Un exemple de reconnaissance positive de GTE à la fois par tTG2 et IgA est montré dans la Fig. 3A. Conformément à la situation chez les patients humains et en raison de la prévalence beaucoup plus faible de DH-comme la dermatite que les CD-comme la sensibilité au gluten également dans les macaques rhésus, la plupart des échantillons de biopsie de peau sont censés show la réaction positive avec les anticorps tTG2 mais sans la présence d'IgA tTG2 + + double des cellules positives (Fig. 4). Ces cas DH-indépendantes, y compris les cas dermatites d'origine microbienne, va révéler certaines cellules mono-positif + IgA dispersés sous l'épithélium, mais pas de chevauchement spectral entre l'tTG2 et IgA marqué marqueurs (fig. 3B et 4). Par conséquent, il est important de maintenir l'ordre des procédures d'essai proposées, à commencer par l'examen clinique (Fig. 1), suivie par l'évaluation histopathologique (Fig. 2), et seulement si aucune autre, la dermatite causant plus fréquente des agents peuvent être identifiés, confocale examen au microscope des biopsies de peau colorée pour tTG2 et IgA est justifiée. Des évaluations cliniques et / ou histopathologique ne sont pas suffisants pour le diagnostic positif de cette condition. Dans ces cas lorsque vous double-positifs (+ tTG2 IgA +) les cellules sont identifiés autour de la zone des papilles dermiques, le diagnostic dermatite DH-like peut être délivré. Dans de tels cas, le retrait du glutenet l'administration du régime sans gluten est recommandé afin de soulager les symptômes dermatite.
Figure 1. Région inguinale du EM96 macaque avant (A) et après (B) le retrait du gluten pendant 5 semaines. Réintroduction du gluten a coïncidé avec la réapparition de la dermatite (C).
Figure 2. Coloration HE du EM96 biopsies cutanées macaque collectées avant (A) et après (B) le retrait du gluten pendant 9 semaines. A: L'épithélium est épaissi (7-15 couches de cellules épithéliales) avec une croûte épaisse superficielle de cellules infiltrées par des neutrophiles hyperkératosiques dégénérer. Les neutrophiles apparaissent aussi à l'intérieur de l'épithélium et sont mélangés avec un nombre modéré de lymphocytes, de plasmocytes et histiocytes autour des annexes dans la partie supérieure du derme. B: Certains hyperkeratTSO est encore présent, épaisseur de l'épithélium est normalisé (4-7 couches) avec infiltration lymphoplasmocytaire minimal dans la partie supérieure du derme. C: Normal peau abdominale à partir FR56 macaque, sans infiltration lymphoplasmocytaire, est inclus à titre de comparaison. Grossissement 20x.
Figure 3. Images de microscopie confocale du EM96 biopsies cutanées macaque collectées avant (A) et après (B) le retrait du gluten pendant 9 semaines. A: coloration des IgA (vert), tTG2 (rouge) et ToPro-3 marqueurs ADN nucléaire (bleu). Co-localisation des IgA et tTG2 apparaît en jaune autour de la zone d'papilae cutanée. B: échantillon de peau prise après 9 semaines de régime sans gluten ne montre aucun IgA dans l'épithélium alors que certains sous-épithéliale IgA est encore présent (vert), tTG2 (rouge) et ToPro-3 marqueurs ADN nucléaire (bleu).
Figure 4.
| Tag animaux | Sex [M / F] | Âge [Ans] | Les symptômes cliniques | Plasma tTG2 anticorps | Alimentation [1,2] * |
| HJ71 | F | 1.3 | Saine | - | 1 |
| HD13 | M | 1.4 | Sains, la diarrhée occasionnelle | + | 1 |
| FR56 | M | 5.4 | Une diarrhée chronique idiopathique | - | 1 |
| EM96 | F | 5,0 | Dermatite chronique | + / - (Borderline) | 1 et 2 |
| GI24 | F | 4.6 | Dermatite chronique | - | 1 |
Tableau 1. TNPRC macaques rhésus utilisées pour la collecte des biopsies de la peau
* Alimentation 1 - régulière singe Chow (contenant du gluten); régime 2 - régime sans gluten
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Discussion
Notre nouvellement établie non-humain modèle primate de la sensibilité au gluten a été utilisée récemment pour étudier les modifications de la perméabilité intestinale déclenchée par gluten 5,6. Plasma tTG2 anticorps ainsi que intestinale tTG2 + IgA + dépôts ont été détectés dans certains macaques sensible au gluten. Depuis que nous avons récemment identifié rares incidents de dermatite idiopathique dans la colonie de macaques rhésus, où aucune habitude (infectieuses / métabolique) étiologie pourrait être établi, l'objectif de cette étude était d'évaluer si tTG2 + dépôts anticorps IgA + a pu être détecté dans des échantillons de peau de ces rares cas de dermatite (tableau 1).
Prévalence des autoanticorps tTG2 qui sont indicatives des gammes de CD entre 1:70 et 1:200 7. Nos études avec des macaques sensible au gluten indiquent que la prévalence des anticorps tTG2 en captivité macaques rhésus ressemble à celui signalé dans la population humaine. Primaire des facteurs environnementaux et génétiques qui pourraient avoir des répercussions sur l'étendue of prévalence de ces infections à la fois les humains et les macaques sont peu étudiées 8,9. Les facteurs qui sont associés à une prévalence plus faible de DH (1:400 à 1:10.000) que les CD ne sont pas connues. Par conséquent, une recherche plus rigoureuse est nécessaire pour étudier la pathogenèse de CD et de DH. Ce rapport est le premier à démontrer l'existence de DH-comme la dermatite de primate non-humain. Malgré que la prévalence du DH-comme la dermatite semble être beaucoup plus faible que la prévalence de l'entéropathie sensible au gluten également dans les macaques, les résultats présentés permettent d'espérer pour la recherche future, en supposant que les animaux supplémentaires avec DH-comme la dermatite seront identifiés. Détection de double-positifs tTG2 + IgA + cellules de biopsies de peau d'animaux touchés par microscopie confocale sera un élément déterminant dans ces efforts.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Amanda Tardo, Dr Mostafa Bouljihad, Stéphanie Feely, Carol Coyne, le Dr Erin Ribka, le Dr Pete Didier et Dorothy Kuebler pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH R01-DK076653 et 3R01-02S1-DK076653 à KS et la subvention de fonctionnement de base de l'TNPRC RR000164.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Human IgA-FITC * | Sigma-Aldrich | F-5259 | 1:100 working dilution |
| Anti-Human tTG2 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | MS-300-P1ABX | 1:100 working dilution |
| Anti-Mouse IgG1 ** | Invitrogen | A-21124 | 1:1,000 working dilution |
| ToPro-3 DNA probe *** | Invitrogen | T-3605 | 1:1,000 working dilution |
| Zinc Formalin (Z-fix) | Anatech Ltd., Battle Creek, MI | 171 | |
| OCT Freezing Medium | Sakura Finetek | 4583 | |
| Cytoseal Mounting Medium | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Anti-Quenching Solution | Sigma-Aldrich | P 3130 | |
| Ethilon (Nylon Suture) | Ethicon Inc. | 663G | |
| Miltex Punch Dermal Biopsy Instrument | Miltex Inc. | NA | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with a size 40 blade | Oster Professional Products | 78005-050 | |
| Leica Tissue Processor | Leica Microsystems | ASP300 | |
| Rotary Microtome | Microm International | HM325 | |
| Cryostat | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HM560 | |
| Confocal Microscope | Leica, Wetzlar | TCS SP2 | |
| * Fluorescein isothiocyanate ** Secondary (Alexa Fluor 568-conjugated) antibody used after tTG2 primary antibody ** Dye |
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References
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