Summary
La dermatitis herpetiforme (DH) es una enfermedad inflamatoria crónica caracterizada por una reacción autoinmune entre IgA y la epidermis transglutaminasa (ETG). DH se desarrolla en una porción muy pequeña de los pacientes con sensibilidad al gluten y / o enfermedad celíaca. Los resultados de este estudio indican que DH también puede desarrollarse en una gran mono rhesus con síntomas de la dermatitis idiopática.
Abstract
Transglutaminasa tisular 2 (tTG2) es una enzima digestiva intestinal que deamidates ya parcialmente digerido la dieta gluten péptidos de la gliadina por ejemplo. En individuos genéticamente predispuestos, tTG2 desencadena la respuesta autoinmune que se caracteriza por la producción de anticuerpos y tTG2 su deposición directa en 1,2 pequeña pared intestinal. La presencia de anticuerpos de ese tipo constituye una de las características principales de la enfermedad celiaca (EC). Transglutaminasa epidérmica (ETG) es otro miembro de la familia de la transglutaminasa, que también puede funcionar como un autoantígeno en una pequeña minoría de los pacientes con EC. En estos casos relativamente raros, ETG desencadena una reacción auto inmune (una erupción de la piel) clínicamente se conoce como dermatitis herpetiforme (DH). Aunque el mecanismo exacto de la patogenia de CD y DH no se entiende bien, se sabe que tTG2 y ETG epítopos antigénicos compartir que pueden ser reconocidos por los anticuerpos de suero de los pacientes de CD y DH 3,4.
(Macaca mulatta) con dermatitis (tabla 1, fig. 1 y 2) se utilizó para estudiar los tejidos afectados. En un animal (EM96) una superposición espectral de IgA y anticuerpos tTG2 (Fig. 3) se demostró. La presencia de doble positivas tTG2 + IgA + células se centró en la epidermis de profundidad, alrededor de las papilas dérmicas. Esto es consistente con las lesiones descritas en pacientes con DH 3. Cuando EM96 fue colocado en una dieta libre de gluten, dermatitis, así como tTG2 + IgA + depósitos desaparecido y ya no eran detectables (Fig. 1-3). Dermatitis reapareció sin embargo, sobre la base de re-introducción del gluten de la dieta en el EM96 (no mostrado). En los macacos otros como animales no relacionados con la dermatitis, la tTG2 + IgA + depósitos no fueron detectados. Dieta libre de gluten-dependiente de la remisión de la dermatitis en el EM96 junto con la presencia de tTG2 + IgA + células en la piel indican una enfermedad autoinmune, como DH-mecanismo para el desarrollo de esta condición. Este es el primer informe de DH-como la dermatitis en los primates no humanos.
Protocol
1. La biopsia de piel la recogida de muestras
- Antes de la biopsia de piel, anestesiar a los animales por vía intramuscular con 2,5 mg / kg de clorhidrato de tiletamina y zolazepam mezcla de clorhidrato de Telazol (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA). Monitor de los animales de la administración de anestesia hasta postración y retire de su gabinete.
- Eliminar el vello de la piel del área de interés utilizando un Oster A5 de Oro Clipper velocidad Veterinaria individual con un tamaño de 40 cuchillas (Oster Professional Products, McMinnville, TN) y preparar asépticamente con alternancia de matorral Betadine y alcohol. Asegurar un paño fenestrado estéril sobre el sitio de la biopsia seleccionado.
- Usando una técnica estéril, coloque un 4,0 mm Miltex instrumento perforación cutánea Biopsia (Miltex, York, PA) contra la piel mientras se gira el instrumento 180 grados en sentido horario y antihorario con una ligera presión hasta que la biopsia por punción de transectos a través de la dermis en el ti subcutáneaCUESTIÓN. Retire la muestra de la biopsia y agarre la parte seccionada de la piel con pinzas y sin el tejido subcutáneo.
- Cierre el defecto de la piel con sutura de nylon 3-0 unido a una aguja 3 / 8 círculo de corte (Ethilon, Ethicon, Johnson & Johnson Medical Limited, Berkshire, Reino Unido) en un patrón cruzado. Dar a todos los animales de 0,01 mg / kg de hidrocloruro de buprenorfina (Hospira, Lake Forest, IL) por vía intramuscular para la analgesia postoperatoria.
2. Procesamiento de la muestra
- Trabajar con muestras de biopsia de la piel dermatitis crónica y controles sanos macacos rhesus. La obtención de dos a tres (4 mm de diámetro) las muestras de biopsia de cada animal.
- Fix primera muestra en formol zinc (Z-fix, Anatech Ltd., Battle Creek, MI) durante 24 horas, lave en agua durante 30 minutos, lave brevemente en etanol al 70%, y el lugar en ASP300 procesador de tejidos Leica (Leica Microsystems Inc. , Buffalo Grove, IL), donde los tejidos se deshidratan con los grados de ascenso de 70%, 80%, 95% y 100% de etanol 48minutos cada uno (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), seguido por dos cambios de xileno (Fisher).
- Insertar en los medios de parafina (Fisher) para almacenamiento a largo plazo a temperatura ambiente. Lugar a -20 º C durante 20 minutos antes de cortar. Prepare 6 secciones micras con un micrótomo rotatorio (HM325, Microm Internacional, Waldorf, Alemania). Se colocan en las diapositivas cargada (Fisher) y aire seco a 60 º C durante la noche. Tinción con hematoxilina y eosina (H & E) método estándar (descrito más adelante).
- Fix segunda muestra en paraformaldehído al 2% (USB Corp, Cleveland, OH) durante 30 min a temperatura ambiente, lavar tres veces en tampón fosfato salino (PBS, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA), lugar en el 30% de sacarosa (Fisher) para 4 horas, e incluir en el medio de congelación octubre (Sakura Finetek, Torrence, California). Mantener a los 80 ° C durante 20 minutos antes de cortar. Prepare 15 secciones micras utilizando el criostato (HM560, Thermo Scientific, Kalamazoo, MI).
3. H & E tinción
- Desparafinar incrustarsecciones ded a través de tres cambios de xileno (Fisher) y rehidratar a través de etanoles clasificados: tres cambios de 100%, dos cambios de 95%, un cambio del 80% y agua destilada, a 2 minutos cada uno.
- Tinción con hematoxilina (Richard Allan-Científico, Kalamazoo, MI) durante un minuto y seguir por un breve lavado en agua corriente del grifo.
- Contratinción con eosina (Sigma) durante 6 minutos.
- Deshidratar los tejidos teñidos a través del 95% y etanol absoluto, dos cambios de 2 minutos cada uno y claro en tres cambios de xileno, a 3 minutos cada uno.
- Monte cubre objetos usando Medio Cytoseal de montaje (Richard Allan-científico) en el H & E-manchado secciones de tejido.
4. Evaluación histopatológica
Inspeccione H & E-manchado secciones biopsia de la piel bajo un microscopio óptico con el 4 - 40 aumentos y un microscopio Leica con un punto penetración de cámaras digitales (Digital Instruments Inc., Michigan, EE.UU.).
5. Inmunofluorescencia staiNing
- Trabajar con secciones de piel octubre embebido para la tinción de inmunofluorescencia. Antes de la tinción, en remojo durante 20 min en PBS que contenía 0,2% de gelatina de piel de pescado (FSG, Sigma) con 0,1% Triton X-100 (Sigma) para eliminar los PTU y para permeabilizar el tejido.
- Después de lavar las diapositivas, se incuban con 10% de suero normal de cabra (NGS, Sigma), diluido en PBS-FSG durante 1 hora a temperatura ambiente, en una cámara de diapositivas humidificado.
- Para poder visualizar el depósito de IgA y anticuerpos tTG2, Incubar los portaobjetos con anti-rhesus IgA y anticuerpos primarios tTG2, diluido en un 10% NGS-PBS-FSG durante 1 hora.
- Lavar con PBS-FSG-Triton X-100 (Sigma) durante 10 minutos, seguido por PBS-FSG durante 10 minutos.
- Se incuba con el secundario, isotipo de los anticuerpos específicos marcados con fluorocromo Alexa Fluor 488 (verde), 568 (rojo) o 633 (azul) (Molecular Sondas-Invitrogen) a 1:1000 dilución. El uso del tinte ToPro-3 para visualizar el ADN nuclear. Utilizar el 10% de NGS-PBS-FSG como diluyente para anticuerpos.
- Use la solución anti-temple (Sigma) para montar las secciones de tejidos teñidos.
6. Microscopía confocal
Realizar imágenes con una Leica TCS SP2 verdadero microscopio de escaneo láser confocal (Leica, Wetzlar, Alemania) equipado con tres láseres (seis líneas de excitación está disponible): un láser de argón, kriptón a 488 nm (verde), un láser de criptón a 568 nm ( rojo) y un láser de helio-neón de 633 nm (azul), que abarcan desde el visible hasta el otro lado rojo del espectro. Registro de contraste de interferencia diferencial (DIC) imágenes para la evaluación de los no etiquetados arquitectura del tejido.
7. Resultados representante
Un ejemplo de un reconocimiento positivo de la ETG por tanto tTG2 e IgA se muestra en la fig. 3A. De acuerdo con la situación en pacientes humanos, y debido a la prevalencia mucho más baja de DH-como dermatitis de CD-como la sensibilidad al gluten también en los macacos rhesus, la mayoría de las muestras de biopsia de piel se espera que show la reacción positiva con anticuerpos tTG2 pero sin la presencia de tTG2 + IgA + doble células positivas (Fig. 4). Estos casos DH-relacionados, incluyendo casos de dermatitis de origen microbiano, se revelan algunas células de un solo positivo IgA + esparcidos por debajo del epitelio, pero no solapamiento espectral entre las tTG2 e IgA marcados con marcadores (Fig. 3B y 4). Por lo tanto, es importante para mantener el orden de los procedimientos de prueba sugerido, a partir de la exploración clínica (Fig. 1), seguida de evaluación histopatológica (Fig. 2) y sólo si no que causan dermatitis y otras más comunes agentes pueden ser identificados confocal, examen microscópico de biopsias de piel manchada para tTG2 e IgA se justifica. Las evaluaciones clínicas y / o histopatológicos no son suficientes para el diagnóstico positivo de esta condición. En los casos en doble positivo (+ tTG2 IgA +) las células se identifican en el área de las papilas dérmicas, DH-como el diagnóstico dermatitis pueden ser emitidas. En tales casos, la retirada del gluten de la dietay la administración de la dieta sin gluten se recomienda con el fin de aliviar los síntomas de la dermatitis.
Figura 1. Región inguinal de EM96 macaco antes (A) y después (B) la retirada del gluten de la dieta durante 5 semanas. La reintroducción del gluten de la dieta coincidió con la reaparición de la dermatitis (C).
Figura 2. HE tinción de las biopsias de piel EM96 macacos recogidos antes (A) y después (B) la retirada del gluten de la dieta durante 9 semanas. R: El epitelio se espese (7-15 capas de células epiteliales), con una gruesa capa superficial de células hiperqueratósicas infiltrado de neutrófilos en degeneración. Los neutrófilos aparecen también en el interior del epitelio y se mezclan con un número moderado de linfocitos, células plasmáticas e histiocitos alrededor de los anexos en la dermis superior. B: Algunos hyperkeratosis todavía está presente, el espesor del epitelio está normalizado (4-7 capas) con mínima infiltración linfoplasmocitario en la dermis superior. C: La piel normal abdominal de FR56 macacos, sin infiltración linfoplasmocitaria, se incluye para la comparación. Magnificación de 20x.
Figura 3. Imágenes de microscopía confocal de EM96 biopsias de piel macacos recogidos antes (A) y después (B) la retirada del gluten de la dieta durante 9 semanas. A: tinción IgA (verde), tTG2 (rojo) y ToPro-3 de marcadores de ADN nuclear (azul). Co-localización de IgA y tTG2 aparece en amarillo en la zona de papilae dérmica. B: muestra de piel tomada después de 9 semanas de dieta sin gluten no muestra IgA en el epitelio, mientras que algunos subepitelial de IgA está presente (verde), tTG2 (rojo) y ToPro-3 de marcadores de ADN nuclear (azul).
Figura 4.
| Animal Etiqueta | Sexo [M / F] | Edad [Años] | Los síntomas clínicos | Plasma tTG2 anticuerpos | Dieta [1,2] * |
| HJ71 | F | 1.3 | Saludable | - | 1 |
| HD13 | M | 1.4 | Diarrea sanos, ocasionales | + | 1 |
| FR56 | M | 5.4 | Diarrea crónica idiopática | - | 1 |
| EM96 | F | 5.0 | Dermatitis crónica | + / - (Borderline) | 1 y 2 |
| GI24 | F | 4.6 | Dermatitis crónica | - | 1 |
Tabla 1. TNPRC macacos rhesus utilizados para la recogida de biopsias de piel
* Dieta 1 - regular comida mono (con gluten), la dieta 2 - dieta libre de gluten
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Discussion
Nuestra reciente creación no humana modelo de primates de la sensibilidad al gluten se ha utilizado recientemente para estudiar los cambios de permeabilidad intestinal provocada por gluten de la dieta 5,6. Plasma tTG2 anticuerpos, así como intestinal tTG2 + + depósitos de IgA se detectaron en algunos macacos sensibilidad al gluten. Ya que recientemente identificado incidentes raros de dermatitis idiopática en la colonia de macacos rhesus, que no se pudo habitual (infecciosas / metabólicas) etiología establecida, el objetivo de este estudio fue evaluar si tTG2 + IgA depósitos de anticuerpos + puede ser detectado en muestras de piel de estos raros casos de dermatitis (Tabla 1).
Prevalencia de autoanticuerpos tTG2 que son indicativos de las gamas de CD entre las 1:70 y 7 de 1:200. Nuestros estudios con macacos de sensibilidad al gluten indican que la prevalencia de anticuerpos en cautividad tTG2 macacos rhesus se asemeja a la registrada en la población humana. Primaria los factores ambientales y genéticos que podrían estar afectando la medida of prevalencia, tanto en seres humanos y los macacos son poco estudiada 8,9. Los factores que se asocian con una menor prevalencia de DH (1:400 a 1:10.000) que el CD también son desconocidas. Por lo tanto, una investigación más rigurosa es necesaria para estudiar la patogénesis de CD y DH. Este informe es el primero en demostrar la existencia de DH-como dermatitis en primates no humanos. A pesar de que la prevalencia de DH-como dermatitis parece ser mucho más baja que la prevalencia de la enteropatía sensible al gluten también en los macacos, los resultados presentados proporcionan esperanza para la investigación futura, en el supuesto de que los animales adicionales con DH-como la dermatitis se identifica. Detección de doble positivas tTG2 + IgA + en las células de biopsias de piel de animales afectados por microscopía confocal se clave en dichos esfuerzos.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Amanda Tardo, el Dr. Mostafa Bouljihad, Feely Stephanie, Coyne Carol, la Dra. Erin Ribka, el Dr. Pete Didier y Kuebler Dorothy por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH R01-DK076653 y 3R01-DK076653-02S1 para KS y la subvención de funcionamiento de la base de TNPRC RR000164.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Human IgA-FITC * | Sigma-Aldrich | F-5259 | 1:100 working dilution |
| Anti-Human tTG2 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | MS-300-P1ABX | 1:100 working dilution |
| Anti-Mouse IgG1 ** | Invitrogen | A-21124 | 1:1,000 working dilution |
| ToPro-3 DNA probe *** | Invitrogen | T-3605 | 1:1,000 working dilution |
| Zinc Formalin (Z-fix) | Anatech Ltd., Battle Creek, MI | 171 | |
| OCT Freezing Medium | Sakura Finetek | 4583 | |
| Cytoseal Mounting Medium | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Anti-Quenching Solution | Sigma-Aldrich | P 3130 | |
| Ethilon (Nylon Suture) | Ethicon Inc. | 663G | |
| Miltex Punch Dermal Biopsy Instrument | Miltex Inc. | NA | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with a size 40 blade | Oster Professional Products | 78005-050 | |
| Leica Tissue Processor | Leica Microsystems | ASP300 | |
| Rotary Microtome | Microm International | HM325 | |
| Cryostat | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HM560 | |
| Confocal Microscope | Leica, Wetzlar | TCS SP2 | |
| * Fluorescein isothiocyanate ** Secondary (Alexa Fluor 568-conjugated) antibody used after tTG2 primary antibody ** Dye |
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References
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