Summary
I denne artikel vil vi vise, isolering af murine bosiddende lunge mesenchymale stamceller (lunge MSC), deres ekspansion, karakterisering og analyse af immunmodulerende egenskaber.
Abstract
Tissue bosiddende mesenchymale stamceller (MSC) er vigtige regulatorer af væv reparation eller regeneration, fibrose, inflammation, angiogenese og tumordannelse. Samlet set udgør disse undersøgelser tyder på, at hjemmehørende lungen MSC spille en rolle i lungevæv homeostase, skade og reparation i løbet af sygdomme som lungefibrose (PF) og arteriel hypertension (PAH). Her beskriver vi en teknologi til at definere en befolkning af hjemmehørende lunge MSC. Definitionen af denne population in vivo lungevæv ved hjælp af et definere sæt af markører letter gentagne isolering af en velkarakteriseret stamceller befolkning ved flowcytometri og undersøgelsen af en bestemt celletype og funktion.
Protocol
1. Lung Isolation
- Sacrifice voksne mus (8-10 uger i alder 18-20 g; C57Bl6J) mus med en overdosis af isofluran efterfulgt af afblødning med sterile teknik. Profiler vil variere lidt mellem stammer.
- Kirurgisk fjernelse mellemgulvet, åbne brysthulen ved at skære i brystkassen lateralt på hver side af musen. Skyl blod fra lungerne ved perfusing højre hjertet hjertekammer forsigtigt ved hjælp af 3-5mls af fosfat bufferet saltvand (PBS).
- Dissekere lunge lapper fjerne luftrøret og store bronkier og sted i en petriskål fyldt med Hanks bufferet saltvand (HBSS). Efter samling af alle lunge lapper tang anvendes til at placere væv på låget af fadet. Tissue er derefter hakkes i bittesmå stykker ved hjælp af engangs skalpeller med nok væske for at holde dem fugtige, men ikke så meget, at de flyder og flytte.
- Dissekere en Bagbenets af en af de mus og isolere knoglemarven til at bruge som en farvning kontrol for at indstille Flow cytometri porte. Stain knoglemarven (BM) som tidligere beskrevet 1.
2. Udarbejdelse af en enkelt celle Udelukkelse fra lungevæv
- Hver lunge er fordøjet ved hjælp af en optimeret væv vægt til volumen-forholdet på 0,2 g: 5mls af forvarmet 0,2% Worthington type 2 collagenase (Worthington Biochemicals, Lakewood, NJ, kat # LS004202) opløst i sterilt HBSS. Blandingen er nedsænket i et 37 ° C vandbad i 30 min 2,3.
- Triturate prøvebrønden indtil lungevæv fordøje flyder let gennem en 10 ml pipette (ca. 10 gentagelser). Inkuber i yderligere 15 min ved 37 ° C for at fuldføre væv fordøjer og sikrer en mere ensartet enkelt celle suspension.
- Fortynd lunge cellesuspensionen med HBSS og triturate med 5ml pipette til at sprede resterende væv fragmenter.
- Filter suspensionen op i en 70μM celle si for at fjerne ufordøjet væv fragmenter. Prøve kan opdeles i multiple koniske rør på dette tidspunkt for at forhindre overbelastning én celle si og reducere den tid.
- Pelleter cellesuspensionen i 10 min ved 1500 rpm og dekanteres supernatanten.
- Resuspender cellepelleten forsigtigt med stuetemperatur RBC buffer (eBiosciences, San Diego, CA, kat # 00-4333-57) og inkuberes ved RT i 5 min. Tilføj en tilsvarende mængde HBSS at inaktivere lysisbuffer og filter cellesuspensionen ved hjælp af en 40μM celle si for at fjerne snavs og celle aggregater.
- Pipetter 10μl af hver prøve skal der farves og tælle celle tal for både lunger og BM prøver ved hjælp af en hemocytometer. Bemærk: optage den samlede mængde af cellerne.
- Pelleter enkelt celle suspension af lunge-celler ved centrifugering ved 1500 rpm i 10 min.
- Resuspender både lunge-og BM celler på 1x10 6 celler / ml i forvarmet (37 ° C) DMEM + (Dulbecco ændrede Eagle er medium, høj glukose (Gibco, Carlsbad, CA, kat # 11965-092), der indeholder 2% føtalt Bovine serum (FBS) og 10mM HEPES.
- Forbered en 1mg/ml stamopløsning af Hoechst 33342 farvestof (Sigma Chemical Company, St.Louis, MO, kat # B2261) i vand og filter sterilisere 1,4. Det Hoechst farvestof kan gemmes som alikvoter ved -80 ° C.
- Tilføj Hoescht 33342 farvestof til en endelig koncentration af 5μg/ml (en 200x fortynding af en 1mg/ml lager) til enkelt celle suspension.
- Bland de celler ved forsigtigt inversion, og inkuber i 37 ° C vandbad i præcis 90 minutter.
3. Farvning og forberedelse af Lung cellesuspensionen for Flowcytometri Analyse
- Efter 90 min alle trin med Hoechst farvede lungeceller skal udføres ved 4 ° C eller på is for at forhindre farvestof udstrømning. Pellet cellerne ved centrifugering ved 1500 rpm i 10 min ved 4 ° C, og cellerne i iskolde farvning buffer (PBS +2% FBS).
- Resuspender cellerne i en koncentration på højst 1x10 7 celler / rør ved hjælp af 300-600μl af PBS indeholdende 2%FBS og 10mM HEPES.
- Tilføj tilstrækkeligt fniste CD45-antistof (typisk 1:200 fortynding af CD45-APC (BD Pharmingen, San Diego, CA, kat # 559864) til lunge-og BM prøver Inkubér på is i 10-15 min Inklusive et uplettet kontrol i løbet af.. forsøgsmetoden er nyttigt at indstille analysen porte.
- Pellet celler ved 4 ° C i 5 min ved 1500 rpm. Dekanteres supernatanten og resuspender cellerne i 500 μl af kølede farvning buffer (PBS +2% FBS). Overførsel til prechilled snap cap polypropylen rør (Fisherbrand, Schaumburg, IL; kat # 14 til 956-1D).
- Tilføj propidium iodid (PI, 200μg/ml lager i PBS) til prøver til en endelig koncentration på 2μg/ml at udelukke døde celler. PI skal bruges i kombination med Hoechst 33342 farvestof for at opnå den korrekte fluorescens profil på flowcytometrisk analyse.
- Store rør på is, beskyttet mod lys, indtil flowcytometri analyse.
4. Flowcytometri Analyse til at definere og isolereen lunge mesenchymale Stem Cell (lunge MSC) Befolkning hjælp Hoechst farvestof udstrømning til at afsløre en Side Befolkning (SP)
- Denne analyse har følgende instrumentspecifikke krav:
- 488 nm og UV (350-355 nm) lasere
- 2 detektorer på UV-laser stien med blå (450/65) og rød (675/50) filtre.
- UV røde Detektoren skal have en høj følsomhed for det røde signal. Dette kan være et problem med ældre celle sorteringsanlæg.
- Chiller enhed at opretholde prøven på 5-10 ° C.
- Juster lasere og indstillet til cellesortering efter fabrikantens protokollen.
- Saml den røde (x-aksen) og blå (y-akse) Hoechst signaler ved hjælp af en lineær skala.
- Juster fotomultiplikator røret spændinger til at placere G0/G1 højdepunkt i øverste højre for midten på grunden for at give mulighed for tilstrækkelig visning af den efterfølgende side befolkning. En del af S-fasen og hele G2 af cellecyklus kan være off-skala på øverste højre hjørne af plottet. Den blå SIGNAL er relativt lyse, mens det røde signal er dæmpet. Typisk MoFlo XDP (Beckman Coulter, Miami, FL) spændinger er 425 for de blå og 650 for de røde.
- Døde celler er gated ved hjælp af PI. Standarden PI sti (excitation 488nm, emission 630nm) kan anvendes. Alternativt, er PI også begejstrede for UV-laser og de døde cellepopulation ligger uden for skalaen på højre side af den side befolkning (SP) plot. Dette mindsker behovet for at kompensere for PI signalet fra enhver anden fluorokromer såsom FITC og PE. Den oprindelige Goodell fulgte metode disse procedurer 5-7.
- Opretholde en forholdsvis lav trykforskel under analyse og sortering til at sikre stram løsning på den side befolkning.
- SP fremstår som en sidearmen bortset fra den største population af lunge-celler. Denne population kaldes Hoechst lav.
- Den Hoechst lav / SP er analyseret for at adskille CD45 positive og negative populationer ved hjælp af et histogram 2,3 (FIGUR 1).
- Efter udvælgelse og gating af Hoechst lave CD45 neg lunge MSC befolkning cellerne kan inddrives ved sortering som enten en blandet befolkning ind i et rør eller enkelte celler at isolere kloner ind i en 96-brønds plade 3.
- For pladen sortere den slags stream nedbøjning er justeret til 25% for at skabe en mere vertikal slags strøm end den, der normalt bruges til rør sortering.
- Sigt den slags strøm ved at sende en test strøm puls på det øverste venstre og derefter det nederste højre brønd i en 96-brønds plade.
- Indstil sorteringsanlæg software pladediagram at deponere det ønskede antal af celler i hver brønd.
- At isolere en enkelt celle kloner en enkelt lunge MSC er sorteret i brønden af en 96-brønds plade i 150μl af dyrkningsmedier (α-MEM suppleret med 20% FBS). Efter den slags en ekstra 100μl af medie er tilføjet.
5. Isolation, Kultur og karakterisering af lunge MSC og Clones
- Kultue og udvidelse af blandet lunge MSC befolkning og enkelt celle kloner efter sortering er identisk med standard dyrkningsbetingelser (37 ° C, 5% CO 2 og> 95% luftfugtighed). Cellerne får lov til at overholde følgende isolation i 16 timer. Medier udskiftes hver 48 timer (α-MEM suppleret med 20% FBS). Når cellerne begynder at formere sig hurtigere og nå op på mellem 75-80% sammenløb de er inkuberet (figur 2).
- Cellerne skylles med forvarmet HBSS og inkuberes med 0,5% trypsin / EDTA (Cellgro, Manassas, VA, kat # 25 til 053-Cl) ved 37 ° C for mindre end 2 min. Cellerne overvåges ved hjælp af en omvendt mulighed for at bekræfte udseendet af en celle suspension.
- Lung MSC er derefter fordelt på nøgletal på 1:2 eller 1:03 afhængigt af den aktuelle spredning sats af kulturen.
- Evne til lunge MSC til at differentiere til traditionelle mesenchymale slægter af osteoblaster, fedtcellerne og chondrocytter og deres celleoverfladen udtryk for accepteret mesenchymale markører is evalueret for hver celle forberedelse. Cytogenetisk banding analyse er også udført for at bekræfte fravær af brutto kromosomafvigelser 2,3,8-11.
6. Tælling af lunge MSC ved hjælp af en Colony Forming Assay (CFU-F)
- Fortynd celler i Complete MesenCult medium (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) til en endelig koncentration på 1x10 6 celler / ml.
- Udfør seriefortyndinger at opnå den endelige koncentration i et 100mm parabol af 6x10 4 celler, 3x10 4 celler, 1,5 x10 4 celler og 0,75 x10 4 celler i 10 ml af medier. Analyser udføres i to eller tre eksemplarer for hver celle koncentration og kan skaleres til mindre arealer.
- Kultur celler i 10 dage under normale forhold. På dag 10 celler skylles med PBS og fastgøres ved hjælp af 100% methanol i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Detektere CFU-F kolonier ved farvning med 0,4% w / v Giemsa farvning løsning(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) fortyndet 1:20 med demineraliseret vand. Lad prøver at lufttørre og kvantificere antallet af kolonier, der indeholder mere end 25 celler pr koloni (Figur 3).
7. Analyse af immunmodulerende egenskaber af lunge MSC på T-celle-spredning og apoptose
- 6.25x10 4 lunge MSC celler per brønd er forgyldt med 96-brønds plader og henstår natten over 2.
- CD4 + celler fra milt fra T-celle receptoren (TCR) transgene mus, OT-II med T-celler, der genkender ægalbumin 323-339 peptid, der renses ved nedbrydende CD8 +, CD19 +, MHC-II + og CD25 + celler med en Miltenyi AutoMACS celle sorteringsanlæg (Miltenyi, Auburn, CA). Antigen-præsenterende celler (APC) er isoleret af positivt sortering MHC-II + celler 12.
- APC er faste i 4% paraformaldehyd, vasket 3 gange i PBS / 5% BSA/2mM EDTA, og fyldt med 0.5μg/ml eller 5μg / ml OVA323 peptid.
- Simuleret, vækst anholdt APC føjes til lungerne MSc i 96-brønds plader.
- Større end 95% ren CD4 + 1x10 5 celler er mærket med 5μM Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE, Sigma, St.Louis MO) i PBS og inkuberes i 5 min i mørket, vaskes med PBS-5% BSA, og derefter føjet til APC og lunge MSC celler i DMEM 5% FBS medier. Cellerne inkuberes derefter i 96 timer.
- T-celler bliver derefter farvet med anti anti-CD40 (Cy5), CD4 (APC-Cy7), CD8 (ViolBlue) Vbeta 5 (PE) og analyseres ved hjælp af en Miltenyi MacsQuant 7-kanals flowcytometer (Miltenyi, Aurburn, CA) og FloJo analyse software (Treestar, Ashland, OR). Spredning måles som faldet i det gennemsnitlige fluorescerende intensiteten af CFSE i forhold til baggrunden, T-cellerne mærket med CFSE og ikke udsættes for APC (Figur 4). T-cellerne tælles på dette tidspunkt og levedygtighed vurderes med trypan blå udstødelse.
8. Repræsentative resultater:
Figur 1. Flowcytometrisk analyse og definition af Lung MSC. Single cellesuspensioner af lungevæv fordøje farves med Hoechst 33342 og analyseres ved flowcytometri til at opdage forskelle i A. Forward Scatter (FSC) og Side Scatter (SSC) og B. Hoechst blå og rød fluorescens. Tilstedeværelsen af en side befolkning (SP) er synlige i porten. Den Hoechst lave SP er derefter analyseret for at adskille C. CD45-negative population af lunge MSC. Den CD45 positiv til negativ forhold mellem lunge SP er typisk 70:30 / 60:40.
Figur 2. Isolering og dyrkning af Lung MSC. Efter indsamlingen af lungen MSC ved cellesortering, er cellerne forgyldt med 30mm retter ved hjælp af α-MEM tillægs-orienteret med 20% FBS. A. Frisk sorteret celler synes små, runde og lyse. B. Efter ca 2-3 uger kolonier med en mesenchymale fænotype blevet klart, og spredning er mere indlysende.
Figur 3. Taelling af MSC ved Colony Forming-fibroblast-analyse. Udvidet lunge MSC er belagt per den beskrevne protokol for CFU-F analyse. A. Efter 10 dage og Giemsa pletten kolonier er indlysende. B. Kolonierne er store og består af en få hundrede celler. C. Cellerne vise en mesenchymale fænotype. A & B, Scale bar = 0,5 cm; C skalalinjen = 0,14 cm.
Figur 4. CFSE Baseret T-celle proliferationsanalyse. I mangel af lunge MSC og tilstedeværelse af antigen præsenterende celler (APC) + / - ægalbumin (OVA) CD40 positiv effektor T-celle viser et fald i CFSE intensitet, som indikerer spredning (rød cirkel). CFSE fluorescensintensitet af T-celle membran falder støkiometrisk med hver celledeling, dvs. med hver division. Ved tilstedeværelse af lunge MSC, APC + / - OVA, CD40 positiv effektor T-celle viser ingen signifikant ændring i CFSE intensitet, som indikerer en mangel på spredning (rød cirkel).
Discussion
Vi har tilpasset en metode, der oprindeligt blev anvendt til at identificere BM bloddannende celler til at isolere en bestemt population af hjemmehørende lunge MSC. På grund af reproducerbarheden af isolation disse celler blev derefter vel karakteriseres som MSC. Deres oprindelse er blevet defineret som bosiddende i den voksne mus lunge (i modsætning til afledte BM) og en fænotypisk og molekylær profil dokumenteret 2. Evnen til at gentagne gange isolere denne karakteriseret population tillader yderligere undersøgelse af den biologiske betydning og rolle i lungen MSC under væv homeostase og sygdom. Den seneste definition af denne population in vivo i både murine og humane lungevæv fremmer udviklingen af en terapeutisk strategi rettet mod redning af endogene celler til at lette lunge reparation under skader og sygdom.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af tilskud til SMM: AHA GIA0855953G, NIH 1R01 HL091105-01. Yderligere støtte blev leveret af: DW: NIH RO1DK075013, DDK og Kleberg Foundation, den UCCC Flowcytometri Core (NIH 5 P30 CA 46934-15), den UCCC Microarray core (NCI P30 CA 46934-14).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P-5368 | |
| Hanks buffered salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30588.01 | |
| 0.2% Worthington type 2 collagenase | Worthington Biochemical | LS004202 | |
| Red blood cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| H–chst 33342 dye | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| CD45-APC | BD Biosciences | 559864 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 81845 | |
| a-MEM | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30265.01 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-069 | |
| 0.5% trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-Cl | |
| Complete MesenCult Medium | Stem Cell Technologies | 05511 | |
| 0.4% w/v Giemsa staining solution | Sigma-Aldrich | GS1L | |
| 4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% paraformeldehyde is diluted to 4% using PBS |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Sigma-Aldrich | 21888 |
References
- Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Jun, D. H. The Pathology of Bleomycin Induced Fibrosis is Associated with Loss of Resident Lung Mesenchymal Stem Cells Which Regulate Effector T-Cell Proliferation. STEM CELLS. , (2011).
- Martin, J. Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential. Cytotherapy. 10, 140-151 (2008).
- Majka, S. M. Distinct progenitor populations in skeletal muscle are bone marrow derived and exhibit different cell fates during vascular regeneration. The Journal of Clinical Investigation. 111, 71-79 (2003).
- Goodell, M. A., McKinney-Freeman, S., Camargo, F. D. Methods in Molecular Biology. Basic Cell Culture Protocols. Helgason, D. C., Miller, C. L. 290, Humana Press. 343-352 (2005).
- Tadjali, M., Zhou, S., Rehg, J., Sorrentino, B. P. Prospective Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells by Expression of an. Abcg2/GFP Allele. Stem Cells. 24, 1556-1563 (2006).
- Zhou, S., Schuetz, J. D., Bunting, K. D., Colapietro, A. -M., Sampath, J., Morris, J. J., Lagutina, I., Grosveld, G. C., Osawa, M., Nakauchi, H., Sorrentino, B. P. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine. 7, 1028-1034 (2001).
- Chateauvieux, S. Molecular profile of mouse stromal mesenchymal stem cells. Physiological Genomics. 29, 128-138 (2007).
- Gregory, C. A., Prockop, D. J., Spees, J. L. Non-hematopoietic bone marrow stem cells: Molecular control of expansion and differentiation. Experimental Cell Research. 306, 330-335 (2005).
- Menicanin, D., Bartold, P., Zannettino, A., Gronthos, S. Genomic Profiling of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cell Reviews and Reports. 5, 36-50 (2009).
- Summer, R., Fitzsimmons, K., Dwyer, D., Murphy, J., Fine, A. Isolation of an Adult Mouse Lung Mesenchymal Progenitor Cell Population. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 37, 152-159 (2007).
- Waid, D. M. A unique T cell subset described as CD4loCD40+ T cells (TCD40) in human type 1 diabetes. Clinical Immunology. 124, 138-148 (2007).
