Summary
En este artículo se describen los procedimientos básicos para la realización de experimentos ópticos de asignación en el corazón de conejo Langendorff perfundidos con el sistema de imágenes panorámicas, y el doble (voltaje y calcio) modalidad de imagen.
Abstract
Imágenes ópticas y sondas fluorescentes metodología de investigación avanzado significativamente en el campo de la electrofisiología cardiaca de manera que no podría haber sido logrado por otros enfoques 1. Con el uso de los tintes de calcio y sensibles al voltaje, mapeo óptico permite la medición de potenciales de acción transmembrana y transitorios de calcio con una alta resolución espacial sin el contacto físico con el tejido. Esto hace que las mediciones de la actividad eléctrica cardíaca posible bajo muchas condiciones donde el uso de electrodos es inconveniente o imposible 1. Por ejemplo, las grabaciones ópticas proporcionan precisión los cambios morfológicos del potencial de membrana durante e inmediatamente después de la estimulación y desfibrilación, mientras que las técnicas convencionales de electrodos sufren de estímulo inducido por los artefactos durante y después de los estímulos debido a la polarización del electrodo 1.
El corazón de conejo Langendorff perfundidos es uno de los modelos más estudiados de la fisiología del corazón humano y la fisiopatología. Existen muchos tipos de arritmias observadas clínicamente podría ser recapitulado en el modelo de corazón de conejo. Se ha demostrado que los patrones de ondas en el corazón de conejo en las arritmias ventriculares, según el número de efectivos del corazón y de la longitud de onda de la reentrada, son muy similares a la de los dos corazón humano. También se demostró que los aspectos críticos de excitación-contracción (CE) de acoplamiento en el miocardio de conejo, como la contribución relativa de retículo sarcoplásmico (SR), es muy similar a la humana acoplamiento CE 3. Aquí se presentan los procedimientos básicos de los experimentos de mapeo óptico en el corazón de conejo Langendorff perfundidos, incluyendo la configuración del sistema Langendorff perfusión, la configuración de los sistemas de mapeo óptico, el aislamiento y la canalización del corazón, la perfusión y el colorante mancha del corazón, de excitación-contracción desacoplamiento y la recolección de señales ópticas. Estos métodos podrían aplicarse también en el corazón de otras especies de conejo, con los ajustes a las tasas de flujo, la óptica, soluciones, etc
Dos sistemas de mapeo óptico se describen. El sistema de cartografía panorámica se utiliza para asignar el epicardio todo del corazón de conejo 4-7. Este sistema proporciona una visión global de la evolución de los circuitos de reentrada durante arritmogénesis y la desfibrilación, y se ha utilizado para estudiar los mecanismos de las arritmias y la terapia antiarrítmica 8,9. El sistema de mapeo dual se utiliza para asignar el potencial de acción (AP) y el calcio transitorio (CAT) de forma simultánea desde el mismo campo de visión 10/13. Este enfoque ha mejorado nuestra comprensión de la importancia del calcio en la alternancia eléctrica y la inducción de arritmias 14-16.
Protocol
1. Preparación
- Prepare una solución fresca Tyrodes hecho "(en mM, NaCl 128,2, 1,3 CaCl 2, 4,7 KCl, 1,19 NaH 2 PO 4, 1,05 MgCl 2, 20,0 NaHCO3, y la glucosa 11.1). Para acelerar la preparación diaria de soluciones, preparar dos soluciones madre de antelación y almacenarlas a 4 ° C refrigerador: (1) archivo I (en g/2L, 374.6 NaCl, CaCl2 9,56, 17,52 KCl, 8,21 NaH 2 PO 4 , 10,67 MgCl 2) y (2) Foto II (en g/2L, 84,01 NaHCO 3). Para hacer 2 litros de solución suficiente para un experimento de tomar Tyrodes '1840mL de agua destilada y mezclar en ella 80 ml de archivo I, 80 ml de archivo II, y 4 g de glucosa.
- Preparar soluciones madre de colorantes y desacopladores de: (1) de excitación-contracción blebbistatin desacoplador solución madre (Tocris Bioscience solución, 2mg/ml en DMSO), (2) sensibles al voltaje tinte di-4-ANEPPS solución (Invitrogen, 1mg/ml solución en DMSO), (3) sensibles al voltaje tinte RH 237 de la solución madre (Invitrogen, solución 1.25mg/ml en DMSO), (4) Indicador de calcio Rhod-2AM solución (Invitrogen, la solución de 1mg/ml en DMSO). Un experimento de conejo solo requiere de aproximadamente 30 l de la solución di-4-ANEPPS, 30 l de la solución madre RH237, y 200 l de la Rhod-2AM solución madre. Para evitar la congelación y descongelación repetida, almacenamos alícuotas de 100 l de di-4-ANEPPS a -20 ° C. Otros colorantes también se almacenan a -20 ° C. Guarde el blebbistatin disuelto en +4 º C refrigerador.
- Antes de la cosecha del corazón, la solución de Tyrodes transferencia "en la botella de 2 litros y colocarlo en un baño de agua (Fisher Scientific) que mantiene la temperatura de la solución a 37 ° C. La solución es oxigenada con un 95% O 2 - 5% de CO 2. El pH se mantiene en 7,35 ± 0,05 ajustando el nivel de oxigenación. La solución se distribuye en el sistema de perfusión Langendorff y se filtra por un filtro de red de nylon (de tamaño de poro: 11μm, Millipore) colocado en la línea de perfusión antes de la cánula.
- Preparar el equipo de supervisión antes de la cosecha del corazón. Un transductor de presión (IPM) se utiliza para controlar la presión aórtica durante el experimento. Línea de base del transductor de presión se ajusta a cero mmHg cuando el corazón no está conectado al sistema de perfusión. Pseudo-ECG se colocan electrodos en la cámara para dirigir aproximada I, II y III de la ECG Einthoven triángulo.
2. La cosecha y la perfusión de los corazones de conejo
- Fijar el conejo en la inmovilización de conejo. Sacrificar al conejo por una inyección intravenosa de pentobarbital sódico (50 mg / kg), con 2.000 U de heparina. Cuando el conejo está totalmente liquidado, el cual está determinado por la falta de reflejo de dolor, de la cavidad torácica se abrió rápidamente y el corazón y los pulmones extirpados se.
- Haga un corte en el extremo superior de la aorta ascendente antes de todas las ramas del cayado aórtico. Expulsar el aire de la aorta ascendente y luego rápidamente canular el corazón de una cánula de calibre 16, que previamente ha sido conectado a un cazador de burbujas que es muy importante para mantener el aire fuera de las coronarias. Una vez que el corazón es retrógrada perfusión en un sistema de perfusión no recirculante Langendorff, hacer un corte para abrir el pericardio rápidamente.
- Extirpar el pulmón, la tráquea, la grasa y los tejidos conectivos, mientras que la sangre se limpia por la perfusión.
- ¡Muy importante! Un tubo de silicona (~ 3 cm de largo y 2 mm de diámetro) se inserta a través de una vena pulmonar y la válvula mitral hacia el ventrículo izquierdo (LV) y se mantiene durante todo el experimento. Este tubo se libera la solución que se encuentra atrapado en el VI. Sin circulación durante horas durante el experimento Langedorff-perfusión en un corazón mecánico inmovilizado, que puede causar isquemia severa en la cavidad del ventrículo izquierdo y producir arritmia.
- Mover el corazón de la cánula a la recirculación de Langendorff sistema de perfusión con el aparato de mapeo óptico.
3. La realización de experimentos con el sistema de mapeo óptico panorámico
- Coloque el corazón en una cámara de hexágono a medida y conectar la cánula para el sistema de perfusión. Mantener la presión aórtica a 60 ± 5 mmHg, ajustando el caudal de la bomba de perfusión. Monitor de la derivación I pseudo-ECG. Mantener el pH a alrededor de 7,35 ± 0,05.
- Apagar la luz de la habitación, porque es blebbistatin photoinactivated finales UV y baja (450 a 490 nm) 17 de la parte visible del espectro. Inyecte lentamente la solución madre blebbistatin a través del puerto de inyección en el cazador de burbujas de aire situado por encima de la cánula. Inyecte lentamente 0,1 ml por cada blebbistatin inyección en bolo. Espere a que la presión se estabilice antes de la próxima inyección.
- Coloque con cuidado el electrodo de estimulación en el lugar específico de su diseño experimental.
- Enfoque la imagen del corazón en el vidrio esmerilado situada en el plano de la imagen de cada matriz de fotodiodos (PDA) de tresespaciados uniformemente los ángulos que rodea el corazón. Ajustar la posición de la cánula y las distancias entre cada PDA y el corazón para que se ajuste el corazón en el campo de visión de los tres PDAs. Tome una fotografía de cada imagen que se enfoca en el cristal esmerilado.
- Inyecte lentamente 10 ~ 20μL di-4-ANEPPS solución de reserva a través del puerto de inyección en la trampa de la burbuja de aire en la solución de perfusión. Espere 1 a 3 minutos antes de las grabaciones ópticas.
- Para la primera grabación, a su vez la luz LED verde (sin filtro de excitación, INUNDACIONES LED, Lumileds), coge las grabaciones ópticas simultáneamente tres PDAs conectados con el sistema de adquisición de datos a medida, 5 y apagar la luz del LED. Comprobar la calidad de las señales de píxeles diferentes de los tres PDAs. Añadir 0,1 ~ 0,2 ml de solución madre blebbistatin si los artefactos de movimiento en el potencial de acción óptico se notan. Añadir otros 5 l di-4-ANEPPS solución de reserva si la señal-a-ruido es baja.
- Finalizar el protocolo diseñado experimental para el estudio funcional. Re-mancha el corazón con una solución de almacenamiento adicional 5μL di-4-ANEPPS si la señal se deteriora durante los experimentos, debido a photobleaching o lavado.
- Encienda la luz de la habitación después de la finalización del estudio funcional. Tomar imágenes del corazón de 36 ángulos iguales de tiempo. Esto se logra mediante la rotación del corazón a un paso de 10 ° con una cámara digital fija en el lugar de un PDA.
- Quitaré el corazón de la cámara. Drenaje de todas las soluciones. Lave el sistema de perfusión en la secuencia de DI de agua, alcohol al 70% del reactivo, y de nuevo con agua DI.
- El análisis de datos incluye la reconstrucción de la geometría del corazón de las 36 fotografías digitales, el registro de la señal óptica en la superficie de la geometría reconstruido, y la cuantificación de la duración del potencial de acción (APD), la velocidad de conducción (CV), fase, etc 6
4. La realización de experimentos con el sistema de mapeo de doble
- (Continúa después de la parte 2) Coloque el corazón canulado en una cámara de vidrio (Radnoti) y conectar la cánula para el sistema de perfusión. Precisar el corazón de la parte inferior de silicio de la cámara en la punta del ventrículo y la aurícula.
- Apagar la luz de la habitación. Inyecte lentamente la solución madre blebbistatin (15 ~ 20 minutos para llegar a 10μM) a través del puerto de inyección antes de la cánula de perfusión para inmovilizar el corazón.
- Poner una placa Petri de plástico, o de las demás ventanas de vidrio, por encima de la superficie epicárdica para reducir el movimiento de la superficie de la solución.
- Centra en dos cámaras CMOS en el sistema de mapeo dual (Ultima-L, SciMedia) en el mismo campo de visión. Fluorescencia emitida es separada por un espejo dicroico (635 de corte, Omega óptico), y filtrada por un filtro de 700 nm de paso largo (Thorlabs) para señales de tensión y por un 590/30 nm de paso de banda del filtro (Omega Optical) para las señales de calcio.
- El objetivo de la guía a la luz de dos lámparas halógenas (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT; SciMedia, Costa Mesa, CA) hacia el campo de la cartografía de vista para lograr una iluminación uniforme. Filtros de excitación (531/40 nm, SemRock) se utilizan.
- Mancha el corazón con la solución de tinte sensible a la tensión de valores RH 237 (10 ~ 30 l) a través del puerto de inyección.
- Mezclar la Rhod-2AM (0,2 ml) de solución madre con Pluronic F-127 (Invitrogen, una mezcla 1:1). Sonicar durante 1 minuto en un baño de ultrasonidos en baño María. Se inyecta la mezcla a través del puerto del trampero burbuja. Espere unos 20 minutos para permitir que el de-esterificación de los Rhod-02 a.m. antes de que comience la cartografía.
- Para una grabación, apagar la bomba de superfusión para evitar el movimiento en la superficie de la solución, a su vez de la fuente de luz de excitación (las lámparas halógenas); tener grabaciones óptica utilizando dos cámaras conectadas al sistema de adquisición de datos (Ultima-L, SciMedia) , apague la luz de excitación, y encender la bomba de superfusión. Comprobar la calidad de las señales ópticas. Re-mancha el tejido si es necesario.
- Terminar el resto del protocolo experimental diseñado para un estudio.
- Encienda la luz de la habitación y tomar una fotografía del corazón que contiene el campo de visión. Quitaré el corazón de la cámara. Drenaje de todas las soluciones. Lave el sistema de perfusión en la secuencia de DI de agua, 70% de alcohol reactivo (Fisher Scientific), y el agua DI.
- El análisis de datos contiene las medidas de APD, CV, la duración de calcio transitorios (CATD), la demora entre AP y el aumento del movimiento hacia arriba CAT, el tiempo de subida del calcio transitorio, y la constante de tiempo de un ajuste monoexponencial de la decadencia del gato.
Los resultados representativos:
Figura 1. Los resultados representativos de un experimento de conejo Langendorff perfundidos mediante el sistema de cartografía óptica panorámica. (A) La opinión anterior del corazón de conejo y de la geometría del corazón de conejo reconstruido en la forma de una malla tridimensional de la red de superficie. (B) Tdesenvolvió superficie epicárdica con código de color de la fase (que se obtiene a partir del análisis del plano fase 18) indica el frente de onda en rojo durante un episodio de taquiarritmia. (C) Las grabaciones de la acción óptica potencial de cinco lugares alrededor de la singularidad de fase marcada por 1-5 en el panel B. (D) Ocho fotografías de frente de onda de activación (color rojo) durante un ciclo de propagación de una arritmia reentrante estable. Los círculos de frente de onda de las agujas del reloj alrededor de una singularidad de fase, que es visible en la superficie anterior del corazón. El color de la repolarización (azul) está dispuesto a ser parcialmente transparente para que el frente de onda posterior es visible (por ejemplo, a 80 ms, 100 ms, y 120 ms). Una película de esta arritmia reentrante se presenta en el video complementario 1. Los métodos para la reconstrucción de la geometría, el registro de la señal, el cálculo del mapa de fase, y se desenvuelve la superficie se describen en detalle en otra parte 6.
Figura 2. Los resultados representativos de un experimento de conejo Langendorff perfundidos corazón mediante el sistema de mapeo dual (mapeo simultáneo de potencial de acción y el calcio transitorio). (A) La superficie anterior del corazón con el campo de la cartografía de vista cubiertos por los puntos negro. (B) Un primer plano de las grabaciones de un sitio. (C) muestra las huellas del potencial de acción (azul) y el calcio transitorio (rojo) de una serie de puntos espaciados uniformemente marcada por los puntos negro en el panel de A. Nótese que no todas las grabaciones de píxeles se muestran y la resolución espacial es de 200μm.
Discussion
Basándonos en nuestra experiencia, las claves para el éxito de Langendorff perfundidos experimento corazón de conejo son una solución bien preparada Tyrodes, cosecha rápida del corazón, en buen estado la presión de perfusión, y el pH adecuado de la solución oxigenada en el sistema de perfusión. Con el fin de registrar la señal con más alto posible relación señal-ruido, debemos tener en cuenta factores como la fuente de luz, filtros de luz, enfocando la óptica, fotodetectores, etc 19. Los detalles de estos aspectos se discuten en otro lugar 19. Los conejos jóvenes (edad: 4-5 meses; peso: 9.7 libras) podría ser utilizado para evitar la grasa epicárdica, lo que disminuye la relación señal-ruido de las señales ópticas.
La señal registrada por cada píxel es una integración ponderada de la luz emitida por un volumen de tejido. La profundidad de este volumen de tejido depende de las longitudes de onda de excitación y emisión de los colorantes utilizados. Por di-4-ANEPPS, como ejemplo, la profundidad de penetración estimada es de 300μm en el corazón de conejo 20. Por lo tanto, la interpretación de la señal óptica se debe hacer con precaución cuando la heterogeneidad local de la función eléctrica están presentes en el nodo sinusal, nódulo auriculoventricular, y durante la arritmia ventricular 1,21,22.
Una de las limitaciones de la técnica de mapeo óptico en comparación con la grabación de electrodos es que la fase de repolarización del potencial de acción es a menudo óptica distored por los artefactos de movimiento causado por la contracción cardíaca. Restricción mecánica se podría utilizar para reducir el artefacto, pero no lo elimina completamente. En comparación, farmacológicos excitación-contracción desacopladores son eficaces para eliminar los artefactos de movimiento. Sin embargo, estos desacopladores (por ejemplo, 2,3-butanodiona monoxima) podría tener importantes efectos secundarios electrofisiológicos. Blebbistatin se ha demostrado no tener efectos adversos sobre la electrofisiología cardíaca en el corazón normal 23, y por lo tanto un desacoplador prometedoras para el mapeo óptico. Cabe señalar que la aceleración de edema debido a la abolición de la contracción podría afectar también a la electrofisiología.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
NIH concede R01 HL085369, HL067322, HL082729, EB008999
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-1 | |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | S217-500 | |
| MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific | M33-500 | |
| NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific | S369-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-3 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience | 1760 | |
| Di-4-ANEPPS | Invitrogen | D1199 | |
| RH237 | Invitrogen | S1109 | |
| Rhod-2AM | Invitrogen | R1244 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 |
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