ランゲンドルフ灌流ウサギの心臓のMultiparametric光学マッピング

Summary

この記事では、パノラマのイメージングシステムを用いてランゲンドルフ灌流ウサギの心臓、およびデュアル（電圧とカルシウム）画像診断法で光学マッピング実験を実施するための基本的な手順について説明します。

Abstract

光イメージングと蛍光プローブは、他の^{1に近づく}ことによって達成されていることができなかった方法で、心臓電気生理学の分野で著しく先進的な研究の方法論を持っている。カルシウムや電位感受性色素を使用することで、光学マッピングは、組織の物理的な接触なしに高い空間分解能を持つ膜貫通活動電位とカルシウムトランジェントを測定することができます。これは、電極の使用が不便または¹不可能な多くの条件の下で心臓の電気活動の測定が可能になります。従来の電極技術は、電極の分極¹による刺激中および後の刺激によって誘発されるアーティファクトに苦しむ間、例えば、光学録音は、刺激と除細動中や直後に膜電位の正確な形態学的変化を提供しています。

ランゲンドルフ灌流ウサギの心臓は、人間の心臓の生理学と病態生理学の最も研究されているモデルの一つです。臨床的に観察された不整脈の多くの種類は、ウサギの心臓のモデルにrecapitulatedすることができます。それは、心臓や再入国の波長の効果的なサイズによって決定される心室性不整脈時のウサギの心臓の波のパターンは、、人間の心臓²のように非常に類似していることが示された。それはまた、筋小胞体（SR）の相対的な寄与として、ウサギ心筋でカップリング興奮収縮の重要な側面（EC）は、ヒトECカップリング³と非常に似ていることが示された。ここでは、ランゲンドルフ灌流システムのセットアップ、光学マッピングシステムのセットアップ、心臓、血流と心、興奮収縮の色素染色の分離とカニュレーションを含むランゲンドルフ灌流ウサギの心、の光学マッピング実験の基本的な手順を説明脱共役、および光信号のコレクション。これらのメソッドは、流量の調整、光学、ソリューション、などとウサギ以外の種から心臓に適用される可能性が

二つの光学マッピングシステムが説明されています。パノラママッピングシステムは、ウサギの心臓^4-7の全体心外膜をマップするために使用されます。このシステムは、不整脈原性および除細動時のリエントラント回路の進化のグローバルビューを提供し、不整脈とantiarrhythmia治療^8,9のメカニズムを研究するために使用されています。デュアルマッピングシステムは、ビュー^10-13の同じフィールドから同時に（CAT）一時的な活動電位（AP）とカルシウムをマップするために使用されます。このアプローチでは、電気的交互脈と不整脈^14から16の誘導におけるカルシウムの重要な役割についての理解を強化しています。

Protocol

1。準備

1. 焼きたてのTyrodes"ソリューションを（MM、128.2塩化ナトリウム、1.3 CaCl _2で 、4.7のKCl、1.19のNaH ₂ PO _4、1.05のMgCl _2、20.0飽和NaHCO _3、および11.1グルコースで）準備。ソリューションの毎日の準備を促進するために、事前に二つストック溶液を準備し、4でそれらを保存° C冷蔵庫：（1）ストックI（g/2Lで、374.6のNaCl、9.56のCaCl _2、17.52のKCl、8.21のNaH ₂ PO ₄ 、10.67のMgCl _2）及び（2）ストックII（g/2Lで、84.01のNaHCO _3）。一つの実験を取るために十分なTyrodes"ソリューションの2Lにするために証券私、証券IIの80mL、及びグルコースの4Gの80mLそれに脱イオン水と混合の1840mL。
2. 染料とuncouplersのストック溶液を準備します：（1）興奮収縮脱共役剤blebbistatinストック溶液（DMSOでTocrisバイオサイエンス、2mg/mLソリューション）、（2）膜電位感受性色素ジ-4 - ANEPPSのストック溶液（Invitrogen社、1mg/mL DMSO溶液）、（3）膜電位感受性色素RH 237ストック溶液（Invitrogen社、DMSOで1.25mg/mlソリューション）、（4）カルシウム指示薬rhodo -の異形2AMストック溶液（Invitrogen社、DMSOの1mg/ml溶液）。単一のウサギの実験では、di - 4 - ANEPPS原液、RH237ストック溶液30μL、およびrhodo -の異形2AMストック溶液を200μLの約30μLが必要です。繰り返し凍結融解を避けるために、我々は、-20℃でジ-4 - ANEPPS100μLのアリコートを保存する他の染料はまた、-20℃で保存されています+4℃の冷蔵庫中に溶解blebbistatinを保管してください。
3. 心臓を収穫する前に、2LボトルにTyrodes"ソリューションを転送し、37℃で溶液温度を維持する水浴（フィッシャーサイエンティフィック）にそれを置く℃に5％CO ₂ -溶液を95％O ₂と酸素れている。 pHは、酸素のレベルを調整することによって7.35 ± 0.05に維持されている。ソリューションは、ランゲンドルフ灌流系で循環されており、ナイロンネットフィルター（孔径：11μm、ミリポア社）でフィルタリングされているカニューレの前に灌流ラインに配置された。
4. 心臓を収穫する前に、モニタリング機器を準備します。圧力トランスデューサ（WPI）は、実験時の大動脈圧を監視するために使用されます。心臓が灌流システムに接続されていないときに、圧力変換器のベースラインがゼロmmHgに調整されます。擬似ECG電極は、おおよそのリードI、II、およびアイントホーフェン三角形ECGのIIIにチャンバー内に配置されます。

2。ウサギのハートの収穫と灌流

1. ウサギの現像抑制剤のウサギを修正。ペントバルビタールナトリウム（50 mg / kg）を2000とUのヘパリンの静脈内注射によってウサギを安楽死させる。ウサギは痛み反射の欠如によって決定される、完全に安楽死の場合は、胸腔内がすぐに開かれ、心臓と肺を摘出されています。
2. 大動脈弓のすべての分岐の前に大動脈を昇順の上端で切断してください。上行大動脈から空気を洗い流すと、すぐに以前coronariesから空気を保つために非常に重要であるバブルトラッパーに添付されている16ゲージのカニューレに心をカニューレを挿入する。心臓が逆行非循環ランゲンドルフ灌流系で灌流されると、カットがすぐに心を開くようにしてください。
3. 血液が灌流によってフラッシュされている間、肺、気管、脂肪、および結合組織を削除します。
4. 非常に重要！シリコンチューブ（直径〜3cmの長い、と2mm）左心室（LV）に肺静脈および僧帽弁を通って挿入し、実験全体を通してそこに保持されます。このチューブは、LVの中に閉じ込めているソリューションを解放します。機械的に固定された心臓のLangedorff -灌流実験中の時間の循環することなく、それはLVのキャビティ内に重度の虚血を引き起こすと不整脈を生成する可能性があります。
5. 光学マッピング装置による循環ランゲンドルフ灌流システムへのカニューレと心を動かします。

3。パノラマ光学マッピングシステムを用いて実験を行っ

1. カスタムメイドの六角形のチャンバー内の中心を置き、灌流システムにカニューレを接続してください。血流ポンプの流量を調整することによって、60℃大動脈圧± 5 mmHgに維持する。私は擬似心電図リード監視。 7.35付近でのpHを維持± 0.05。
2. blebbistatinはスペクトルの可視部分のUVおよびローエンド（450〜490 nm）を¹⁷でphotoinactivatedされているので、部屋のライトをオフにします。ゆっくりカニューレの上にある空気気泡トラッパーの注入ポートを介してblebbistatinストック溶液を注入する。徐々にすべてのボーラス注射用0.1ミリリットルblebbistatinを注入する。次の注入の前に安定させるために圧力を待ちます。
3. 穏やかにあなたの実験計画に特定の場所にペーシング電極を配置。
4. 3から各フォトダイオードアレイ（PDA）の像面にある曇りガラスの心臓の画像をフォーカス均等に心臓を取り巻く角度は等間隔。すべての3つのPDAの視野で心臓を収めるために、カニューレと各PDAと心間の距離の位置を調整します。すりガラスの各焦点画像の写真を撮る。
5. 徐々に灌流液への空気バブルトラップの注入ポートを介して〜20μLジ-4 - ANEPPSストック溶液10を注入する。光学的記録を取る前に1〜3分間待ちます。
6. 最初のレコーディングの場合は、、緑のLEDの光を（なし励起フィルター、LEDフラッド、Lumileds社）をオンにカスタムメイドのデータ収集システムに接続された3つのPDAを^、5から同時に光学録音を取ると、LEDライトをオフにしてください。すべての3つのPDAの異なる画素からの信号の品質を確認してください。光学的活動電位におけるモーションアーチファクトが気づいている場合、0.1〜0.2mlのblebbistatin原液を追加。信号対雑音比が低い場合は別の5μLジ-4 - ANEPPS原液を追加。
7. 機能的研究のために設計された実験プロトコルを終了します。信号が光退色またはウォッシュアウトによる実験中に悪化した場合、追加5μLジ-4 - ANEPPS原液で心臓を再染色。
8. 機能的研究の完了後に部屋のライトをオンにします。 36の等間隔の角度から心臓の写真を撮ります。これは、一つのPDAの位置に固定デジタルカメラで10 °のステップで心臓を回転させることによって達成されます。
9. チャンバーの外心を取る。すべてのソリューションをドレインします。 DI水、70％試薬のアルコール、そして再び純水の順序で灌流システムを洗う。
10. データ分析は、36のデジタル写真、再構築されたジオメトリの表面に光信号の登録、および活動電位持続時間（APD）の定量化、伝導速度（CV）、位相、等⁶から心臓形状の再構築が含まれ

4。デュアルマッピングシステムを用いて実験を行っ

1. （パート2の後続行は）ガラス室（Radnoti）でカニューレ心を置き、灌流システムにカニューレを接続してください。心室心尖部および心房におけるチャンバーのシリコン底部に心臓を突き止める。
2. 部屋のライトをオフにします。ゆっくり心を固定化するために血流カニューレに注入する前のポートを介して（10μMに達するまで15〜20分）blebbistatinストック溶液を注入する。
3. 溶液表面の動きを減らすために心外膜面上に、プラスチック製のペトリ皿、または他のガラス窓のカバーを置く。
4. ビューの同じフィールドでデュアルマッピングシステム（ウルティマ- L、SciMedia）二つのCMOSカメラをフォーカス。放出された蛍光は、ダイクロイックミラー（635カット、オメガオプティカル）で分離し、電圧信号用700nmのロングパスフィルター（Thorlabs）によって、カルシウムの信号用の30分の590 nmのバンドパスフィルタ（オメガオプティカル）によってフィルタリングされます。
5. 均一な照明を実現するために、ビューのマッピングのフィールドに向かって、2つのハロゲンランプ（SciMedia、コスタメサ、カリフォルニア州ニューポートオリエインスツルメンツ、ストラットフォード、コネチカット州）のライトガイドを目指しています。励起フィルター（40分の531 nmの、SemRock）が使用されています。
6. 注入ポートを介して膜電位感受性色素RH 237ストック溶液（10〜30μL）と心を染色。
7. プルロニックF - 127（Invitrogen社、1:1混合物）とrhodo -の異形2AM（0.2mlの）ストック溶液を混ぜる。水浴のソニケーターで1分間超音波洗浄します。バブルトラッパーのポートを介して混合物を注入する。 rhodo -の異形2の脱エステル化は、マッピングの開始前に回答できるように、約20分間待ちます。
8. つの録音の場合は、液の表面で動きを避けるために、灌流ポンプをオフにして、励起光源（ハロゲンランプ）の電源を入れてからデータ収集システム（ウルティマ- L、SciMedia）に接続されている両方のカメラを用いた光記録を取る、励起光をオフにし、そして灌流ポンプをオンにします。光信号の品質を確認してください。必要に応じて組織を再染色。
9. 研究用に設計された実験プロトコルの残りを完了します。
10. 部屋のライトをオンにし、ビューのフィールドを含む心臓の写真を撮る。チャンバーの外心を取る。すべてのソリューションをドレインします。 DI水、70％試薬のアルコール（フィッシャーサイエンティフィック）、および純水の順序で灌流システムを洗う。
11. データ解析は、APD、CV、カルシウムトランジェント時間（CaTD）、APのアップストロークと猫の上昇、一過性カルシウムの立ち上がり時間、およびCATの崩壊のmonoexponentialフィットの時定数の間の遅延の測定値が含まれています。

代表的な結果：

図1代表的なパノラマの光学マッピングシステムを使用してランゲンドルフ灌流ウサギの実験の結果を。 （A）ウサギの心臓と三次元のメッシュグリッドの表面の形で再構成されたウサギの心臓の形状の前面像を。 （B）T彼は、心外膜面をラップ解除色分けされて頻脈性不整脈のエピソードの中で赤で示されて波面を示す位相（位相平面解析¹⁸から得られる）で。 （C）安定したリエントラント不整脈のサイクル中に活性化の波面（赤色）の伝播のパネルB.（D）エイトのスナップショットで1から5でマークされた位相特異点の周りの5つの場所からの光の活動電位の記録。波面円は心臓の前面で表示されている位相特異点、周りに時計回り。再分極の色（青）は後部波面が（例えば、80ミリ秒、100ミリ秒、および120msで）表示されるように部分的に透明になるように設定されています。このリエントラント不整脈の映画は、補足ビデオ1で提供されています。幾何学の復興、信号の登録、位相マップの計算、及び表面のラップを解除するための方法は他の⁶詳細に記述されています。

図2。デュアルマッピングシステム（一時的な活動電位およびカルシウムの同時マッピング）を使用してランゲンドルフ灌流ウサギの心臓の実験から代表的な結果。 （A）黒いドットで覆われ、ビューのマッピングのフィールドを持つ心臓の前面を。あるサイトからの録音の（B）クローズアップビュー。 （C）ではないすべてのピクセルの記録が示され、空間分解能が200μmの場合されていることをパネルAに黒い点でマークされた等間隔の位置の配列から活動電位（青）とカルシウムトランジェント（赤）のサンプルのトレースを。

Discussion

我々の経験に基づいて、成功したランゲンドルフ灌流ウサギの心臓の実験のためのキーは、十分に準備Tyrodes"ソリューション、心の迅速な収穫、手入れの行き届いた灌流圧、および灌流系における酸素化ソリューションの適切なpHを含める。最高の信号対雑音比を持つ信号を記録するために、我々は、光源、光学フィルター、光学系を中心に、光検出器、など^19を含む要因を考慮する必要があります。これらの側面の詳細は別の場所で¹⁹説明されています。若いウサギ（年齢：4〜5ヶ月、体重：7〜9ポンド）が光信号の信号対雑音比を低下させる心外膜脂肪を、避けるために使用することができる。

各ピクセルで記録された信号は、組織の体積から放射される光の重み付け統合です。この組織容積の深さは、使用する色素の励起および発光波長に依存します。ジ-4 - ANEPPSの場合は、例として、推定侵入深さは、ウサギの心臓²⁰の300μmのである。電気的機能の局所的不均一性は、洞房結節、房室結節、および心室の間に不整脈^1,21,22に存在する場合このように、光信号の解釈は慎重に行う必要があります。

電極の記録と比較して光学的マッピング技術の一つの制限は、光学的活動電位の再分極相はしばしば心収縮によって生じるモーションアーチファクトによってdistoredされていることです。機械的な制約は、アーティファクトを減らすために使用することができるが、それを完全に排除することはできません。比較では、薬理学的興奮収縮uncouplersは、モーションアーチファクトの除去に有効です。しかし、これらのuncouplers（例えば2,3 - ブタンジオンMonoxime）重要な電気生理学的な副作用を持つことができます。 Blebbistatinは、正常な心臓²³の心臓電気生理学上の有害な副作用を持たないことが実証され、したがって、光学マッピングのための有望な脱共役剤であるれました。それは、収縮の廃止による浮腫の加速がまた電気生理学に影響を及ぼすことに留意すべきである。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher Scientific	S271-1
CaCl2 (2H2O)	Fisher Scientific	C79-500
KCl	Fisher Scientific	S217-500
MgCl2 (6H2O)	Fisher Scientific	M33-500
NaH2PO4 (H2O)	Fisher Scientific	S369-500
NaHCO3	Fisher Scientific	S233-3
D-Glucose	Fisher Scientific	D16-1
Blebbistatin	Tocris Bioscience	1760
Di-4-ANEPPS	Invitrogen	D1199
RH237	Invitrogen	S1109
Rhod-2AM	Invitrogen	R1244
Pluronic F127	Invitrogen	P3000MP
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650