Summary
Aprovechando los avances en el desarrollo de fluoróforo y la tecnología de imágenes, un método sencillo de Alexa Fluor etiquetado de los virus del dengue se ideó para visualizar las primeras interacciones entre el virus y la célula.
Abstract
Los primeros eventos en la interacción entre el virus y la célula puede tener gran influencia en el resultado de la infección. Determinación de los factores que influyen en esta interacción podría conducir a una mejor comprensión de la patogénesis de la enfermedad y así influir en el diseño de vacunas o terapéuticos. Por lo tanto, el desarrollo de métodos para investigar esta interacción sería útil. Los recientes avances en el desarrollo de fluoróforos 1-3 y tecnología de imagen 4 puede ser aprovechado para mejorar nuestros conocimientos actuales sobre la patogénesis del dengue y así allanar el camino para reducir los millones de infecciones de dengue ocurren anualmente.
El virus del dengue tiene una envoltura externa andamio que consta de 90 sobre glicoproteína (E) dímeros que protejan el depósito nucleocápside, que contiene una sola hebra de ARN del genoma positivo 5. Las subunidades proteicas idénticas en la superficie del virus por lo tanto pueden ser etiquetados con un colorante reactivo de amina y se visualizan a través de microscopía de inmunofluorescencia. A continuación, presentamos un método simple de etiquetado de los virus del dengue con Alexa Fluor succinimidil éster tinte disuelve directamente en un buffer de bicarbonato de sodio que se produjo el virus altamente viable después del marcaje. No existe un procedimiento normalizado para el etiquetado de los virus vivos y el protocolo existente de un fabricante para el etiquetado de proteínas por lo general requiere la reconstitución de un colorante en dimetilsulfóxido. La presencia de dimetilsulfóxido, incluso en cantidades mínimas, puede bloquear la infección del virus de la producción y también inducir la citotoxicidad celular 6. La exclusión del uso de dimetilsulfóxido en este protocolo lo que reduce esta posibilidad. Alexa Fluor tiene tintes fotoestabilidad superior y son menos sensibles al pH que los tintes comunes, como la fluoresceína y rodamina 2, lo que es ideal para el estudio de la captación celular y el transporte endosomal del virus. La conjugación de Alexa Fluor tinte no afecta el reconocimiento de virus del dengue etiquetados por el virus de anticuerpos específicos y sus supuestos receptores de siete células del huésped. Este método podría tener aplicaciones útiles en los estudios virológicos.
Protocol
1. Alexa Fluor etiquetado de los virus del dengue
- Antes de la reacción de marcaje, purificar el virus del dengue, con colchón de sacarosa y preparar los reactivos y equipos necesarios, como se indica en el protocolo.
- Prepare frescos buffer 0,2 M de bicarbonato de sodio, pH 8.5 (tampón etiquetado), y 1,5 millones de hidroxilamina buffer, pH 8,3 (dejar de reactivo), justo antes de que el etiquetado y el filtro de esterilización con filtros de jeringa 0.2μm.
- Diluir aproximadamente 3x10 8 unidades formadoras de placas (UFP) del virus del dengue purificado en 1 ml de buffer de etiquetado en un tubo de 2 ml. Esto puede ser ampliado en proporción para el etiquetado de los lotes de virus.
- Reconstituir el liofilizado Alexa Fluor 594 (AF594) ésteres succinimidilo a 1 mm en el etiquetado tampón inmediatamente antes de la reacción de marcaje. Otros de los fluorocromos Alexa Fluor tinte serie se puede utilizar de acuerdo a las necesidades de uno. Minimizar la exposición a la luz a partir de este paso.
- Agregar 100μl de la 1mM AF594 tinte para el virus diluido mientras se agita suavemente con la punta de la pipeta.
- Incubar la mezcla de reacción de marcaje a temperatura ambiente durante 1 hora en la oscuridad. Mezcla de inversiones suave cada 15 minutos.
- Girar el tubo brevemente en una centrífuga de mesa y añadir 100μl de reactivo de parada a la mezcla de reacción mientras se agita suavemente con la punta de la pipeta.
- Incube a temperatura ambiente durante una hora adicional en la oscuridad. Mezcla de inversiones suave cada 15 minutos.
2. Purificación de Alexa Fluor etiquetados virus del dengue
- Al mismo tiempo, equilibrar la columna de purificación con el tampón de su elección. En este experimento, una columna PD-10 se equilibró con 25 ml de tampón HNE (Hepes 5 mM, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA), pH 7,4, antes de su uso.
- Aplicar el virus de la etiqueta en la parte superior de la columna y empezar a recoger el flujo a través de una vez que el virus entra en la etiqueta de la matriz. Llenar la columna con tampón HNE una vez que todos los virus de la etiqueta ha entrado en la matriz. Deseche el primero 2,5 ml de filtrado y recoger el próximo 2 ml de la fracción de virus de la etiqueta.
- Alícuota y almacenar purificada AF594 virus del dengue en la etiqueta -80 ° C, lejos de la fuente de luz.
- Descongelar una alícuota y determinar el título del virus de la etiqueta de la placa de ensayo antes de utilizar el lote de virus de la etiqueta.
- Semillas de 5x10 4 por pocillo de células Vero, que se cultiva en M-199 medio de crecimiento, en una placa de 4 y con un cubreobjetos en la parte inferior de bien un día antes de la infección.
- Quitar el sobrenadante del cultivo de bien y infectar a las células con multiplicidad de infección de un virus de la etiqueta en el volumen de 100μl (diluido en M-199 medio de mantenimiento según sea necesario) durante 10 minutos a 37 ° C.
- Eliminar el inóculo y lavar dos veces en los cubreobjetos 1XPBS.
- Fijar las células en el 3% paraformalydehyde por 30 minutos.
- Lavar los cubreobjetos 3 veces en 1XPBS.
- Permeabilizar las células con una solución de permeabilización que contiene saponina 0,1% y 5% de BSA en 1XPBS por 30 minutos.
- Se incuban las células con diluir centrifugación-aclaró sobrenadante de cultivo monoclonal 3H5 hibridoma anticuerpo durante 1 hora en una cámara húmeda, protegido de la luz.
- Lavar los cubreobjetos 3 veces en tampón de lavado (1XPBS que contienen cloruro de 1 mM de calcio, cloruro de magnesio 1 mM y 0,1% saponina).
- Se incuban las células con AF488 anticuerpo anti-ratón IgG, 1:100 diluida en una solución de permeabilización, de 45 minutos en cámara húmeda, protegido de la luz.
- Lavar los cubreobjetos 3 veces en tampón de lavado y enjuague una vez en agua destilada.
- Frote el borde del cubreobjetos contra una toalla de papel para drenar el exceso de agua y montar a portaobjetos de vidrio con 8μl Mowiol 4-88 Dabco que contiene 2,5%.
- Deje que la solución de montaje para fijar la noche a 4 ° C antes de ver con un microscopio confocal Zeiss. Adquisiciones secuencial se debe realizar un fluoróforo emocionante a la vez y cambiar entre los detectores de forma concomitante.
- Las imágenes son luego analizadas para la co-localización de la tinción de anticuerpos E de proteínas con el virus de la etiqueta con el software LSM Zeiss Zen para estimar el grado de etiquetado.
3. Resultados representante
Un ejemplo de la producción del virus del dengue marcado con tinte AF594 se muestra en la Figura 2. Normalmente, menos de 10 veces cae del título inicial debe ser observado tras el etiquetado de éxito. Sin embargo, cabe señalar que todos los buffers tienen que estar preparados para el nuevo etiquetado para tener éxito y Alexa Fluor ésteres succinimidilo debe utilizarse inmediatamente después de la reconstitución, ya que se hidrolizan en ácidos libres no reactivo en soluciones acuosas 8.
A continuación, el virus de la etiqueta tiene que ser comprobado por fluorescencia suficiente antes de su uso en los experimentos. Una sencilla prueba de inmunofluorescencia se llevó a cabo en las células Vero y el grado de etiquetado puede estimarse a partir de la co-localización de los virus marcado con anti-E tinción de anticuerpos de proteínas. Cortarcélulas de Al fueron examinados y una imagen confocal típico se muestra en la Figura 3. Co-localización de análisis de las imágenes utilizando el software LSM Zen demostrado superposición coeficientes que van desde 0,65 hasta 0,8, lo que sugiere que aproximadamente el 65 al 80% de los viriones se marcaron con el tinte.
Cifra que representa el esquema de 1.Overall Alexa Fluor tinte de etiquetado de procedimiento del virus del dengue. En primer lugar, los topes correspondientes y el virus del dengue están preparados purificados. El tinte Alexa Fluor se reconstituye y se añade a la del virus del dengue diluye en el etiquetado de amortiguamiento. La reacción se detuvo una hora más tarde, con la adición de reactivo de parada. Posteriormente, el virus de la etiqueta se purifica a través de una columna de exclusión por tamaño de quitar el tinte libre. Finalmente, el virus de la etiqueta se vuelve a titulados por la placa de ensayo y la prueba de fluorescencia.
Figura 2. La media de número de viriones viables (ufp / ml) según lo determinado en un ensayo de placa antes y después del AF594 etiquetado. Una alícuota del AF594 etiquetados virus del dengue se descongela y se re-titulado por la placa de ensayo y que por lo general muestran una menor de 10 veces caen de el título de partida. Las barras de error indican la desviación estándar de duplicados.
Figura 3. Co-localización de las etiquetas AF594 con las proteínas del virus del dengue E en las células Vero. Células cultivadas en cubreobjetos el día anterior estaban infectados con dengue AF594 etiquetados en MOI de 1 por 10 minutos a 37 ° C. Las células fueron fijadas posteriormente y se marcaron con anticuerpos anti-E, y se examina para colocalización de la proteína G (verde) y AF594 etiquetado (rojo). Señales fluorescentes se visualizaron con una lupa 63X utilizando Zeiss LSM 710 microscopio confocal. Barra de escala es 10μm. Amarillos indican las áreas de colocalización, como se muestra en el recuadro.
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Discussion
Aunque AF594 colorante se utilizó en este informe, una amplia gama de fluoróforos en la serie Alexa Fluor ésteres succinimidilo está disponible con la química de etiquetado similar. Esto podría extender la aplicación de etiquetado más allá de la imagen. La citometría de flujo se puede utilizar como una alternativa a la microscopía confocal para estimar el grado de etiquetado para los fluoróforos que puede ser excitado y detectado por la máquina de FACS.
Alexa Fluor colorantes son pequeñas moléculas que reaccionan con grupos amino libres, principalmente la arginina y la lisina 9, por lo general orientados hacia el exterior los residuos de las proteínas. En nuestro laboratorio, la conjugación de los virus del dengue con 100μM de Alexa Fluor 594 tinte proporcionan el suficiente brillo para obtener imágenes con una pérdida mínima en el título viral. De luminosidad se puede lograr mediante la variación de la concentración de colorante utilizado. Sin embargo, el aumento de la concentración de colorante puede reducir la viabilidad del virus 7,10. Una posible limitación es la interferencia en la unión al receptor debido al bloqueo del acceso de los fluoróforos. Por lo tanto, dependiendo de la aplicación, un nivel óptimo de etiquetado debe ser determinado a garantizar un equilibrio entre el grado de etiquetado y abrogation10 funcional. Ten en cuenta que la concentración también puede verse afectada por la reacción posterior al envasado de los ésteres de Alexa Fluor succinimidil 8.
El etiquetado directo del virus del dengue con Alexa Fluor tinte que aquí se presenta no requiere ningún paso adicional en el etiquetado para visualizar el virus, lo que elimina la posibilidad de tinción no específica de anticuerpos antivirales indirectos. También permite en tiempo real el seguimiento de los acontecimientos posteriores a la internalización de imágenes de células vivas. Este método es relativamente simple, y debido a la conjugación es estable, se puede utilizar para producir y almacenar lote marcado con el virus de múltiples experimentos en comparación con los tintes fluorescentes lipophillic, como la de cadena larga carbocyanine1 ,1-dioctadecil-3, 3, colorantes 3,3-tetramethylindodicarbocyanine (DID) o estirilo, que no se puede almacenar en el frío durante más de 3 días.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo ha sido financiado por la National Medical Research Council, Singapur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Hydroxylamine | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| Sodium hydroxide | Merck & Co., Inc. | 106498 | |
| AF594 succinimidyl esters | Molecular Probes, Life Technologies | A20004 | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4-well plate | Nalge Nunc international | 176740 | |
| Coverslips | Einst | 0111520 | |
| Microscope slide | Sail Brand | 7105 | |
| 3H5 hybridoma | ATCC | HB46 | |
| 10x PBS | BUF-2040-10X1L | 1st Base | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | |
| To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter. | |||
| To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter. | |||
References
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- Kuhn, R. J. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108, 717-725 (2002).
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