Summary
Un metodo è descritto photoactivate singole cellule contenenti una proteina fluorescente in gabbia con assorbimento a due fotoni da un Ti: zaffiro oscillatore laser a femtosecondi. Per mappare il destino della cellula fotoattivati, immunoistochimica è usato. Questa tecnica può essere applicata a qualsiasi tipo di cellula.
Abstract
La possibilità di etichettare in modo differenziato le singole cellule ha importanti implicazioni nella biologia dello sviluppo. Per esempio, determinare in che modo ematopoietiche, lignaggi vasi linfatici e sanguigni sorgono in embrioni di sviluppo richiede la mappatura destino e lignaggio tracciamento di cellule precursori indifferenziati. Recentemente, proteine photoactivatable che includono: Eos 1, 2, PAmCherry 3, Kaede 4-7, pKindling 8 e KikGR 9, 10 hanno ricevuto grande interesse come sonde cellulari traccia. Lo spettro di fluorescenza di queste proteine fotosensibili possono essere facilmente convertito con eccitazione UV, permettendo una popolazione di cellule per essere distinte da quelle adiacenti. Tuttavia, il photoefficiency della proteina attivata può limitare a lungo termine delle cellule inseguimento 11. In alternativa alle proteine photoactivatable, in gabbia fluoresceina destrano è stato ampiamente utilizzato in sistemi modello embrione 7, 12-14. Tradizionalmente, per uncage fluoresceina destrano, eccitazione UV da una casa lampada a fluorescenza o di un singolo fotone laser UV è stato utilizzato, tuttavia, le fonti di tale limite la risoluzione spaziale di fotoattivazione. Qui riportiamo un protocollo per mappare il destino, traccia discendenza, e rilevare le singole cellule marcate. Singole cellule in embrioni iniettati con gabbia fluoresceina destrano sono fotoattivati nel vicino infrarosso con impulsi laser prodotta da un laser a femtosecondi titanio zaffiro. Questo laser è consuetudine in tutti i microscopi confocale a due fotoni come il microscopio LSM 510 META NLO utilizzati in questo documento. Dal momento che i tessuti biologici è trasparente alla radiazione nel vicino infrarosso 15, gli impulsi laser può essere focalizzato in profondità all'interno dell'embrione senza uncaging cellule sopra o sotto il piano selezionato focale. Pertanto, non lineare assorbimento a due fotoni è indotta solo al centro geometrico di uncage fluoresceina destrano in una singola cella. Per rilevare la cella contenente Uncaged fluoresceina destrano, descriviamo un semplice protocollo immunoistochimica 16 a visualizzare rapidamente la cellula attivata. Il protocollo di attivazione e la rilevazione presentato in questo articolo è versatile e può essere applicato a qualsiasi modello di sistema.
Nota: I reagenti usati in questo protocollo si possono trovare nella tabella allegata alla fine dell'articolo.
Protocol
1. Sintesi di gabbia fluoresceina destrano (adattato da rif. 14)
- Preparare una soluzione 0,1 M di borato di sodio diluita in DDH 2 O.
- Misura 4 mg di 10 kDa aminodextran e aggiungerlo alla CMNB-gabbia tubo fluoresceina.
- Aggiungere 500 ml di soluzione preparata borato di sodio (punto 1.1) al CMNB-gabbia tubo fluoresceina. Chiudere la provetta e vortex per 30 secondi per sciogliere il composto.
- Lasciare il composto di reagire durante la notte su un nutator a temperatura ambiente. Coprire il tubo con un foglio di metallo per evitare l'esposizione della miscela di luce ambientale.
- Ottenere uno spin Zeba desalificare colonna e sviti il tappo inferiore. Segna un punto sulla colonna, che saranno utilizzati per orientare la colonna quando centrifugazione. Porre la colonna in un tubo di 15 ml conica Falcon. Nota: la soluzione nella colonna è in buffer di colonna.
- Allentare il tappo superiore della colonna di spin desalificare. Posizionare il tubo 15 ml conica Falcon che ospita la colonna desalificare spin in una centrifuga. Orientare la colonna con il punto segnato (passo 1,4) di fronte al centro del rotore della centrifuga. Centrifugare la provetta a 1000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Dopo la centrifugazione, rimuovere la colonna desalificare rotazione dal tubo Falcon. Gettare sia il flusso raccolti e il tubo da 15 ml. Ottenere un nuovo tubo da 15 ml conica Falcon, e posto la colonna desalificare rotazione nel tubo nuovo Falcon. Nota: Dopo centrifugazione, il letto di resina colonna dovrebbe comparire compattato. Utilizzare la colonna immediatamente.
- Ottenere la miscela ha reagito (in gabbia con fluoresceina destrano) al punto 1.3. Togliere il tappo dalla colonna spin e aspirare la miscela ha reagito ed applicare lentamente al centro della colonna di spin desalificare. Dopo aver applicato la miscela ha reagito, sostituire il coperchio della colonna.
- Posizionare il tubo Falcon che ospita la colonna desalificare spin in una centrifuga. Come fatto al punto 1.5, orientare la colonna con il punto segnato di fronte al centro del rotore della centrifuga. Centrifugare la provetta a 1000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Dopo la centrifugazione, una miscela giallo (in gabbia con fluoresceina destrano) saranno raccolti (circa 400 mL) nel tubo da 15 ml Falcon. Trasferire la gabbia con fluoresceina destrano miscela in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.
- Coprire immediatamente il tubo con un foglio di metallo per evitare l'esposizione della miscela di luce ambientale. Liofilizzare la gabbia con fluoresceina destrano composto in una speedvac. Liofilizzazione di 350 microlitri dovrebbe durare circa 4 ore.
- Dopo la liofilizzazione completo, risospendere la polvere (circa 3 mg) in DDH 2 O ad una concentrazione finale di circa l'1% w / v. Mescolare brevemente vortex per sospendere la polvere.
- L'aliquota in gabbia fluoresceina destrano in tubi separati lamina metallica coperta, e conservarli a -20 ° C.
2. Raccolta di embrioni e di microiniezione in gabbia con fluoresceina destrano
* Questa procedura utilizza il pesce zebra come sistema modello animale.
- Il giorno prima di iniezioni, istituito attraversa uno zebrafish 01:01 maschio-femmina o 2:1 maschio-femmina in vasche di allevamento con divisori.
- La mattina dopo cambiare l'acqua della vasca di allevamento e rimuovere i divisori. Immediatamente preparare un 5 microlitri 1 / 10 soluzione diluita di lavoro in gabbia fluoresceina destrano sia 1 X Danieau media (vedi Preparazione delle soluzioni) o DDH 2 O. Coprire il tubo di soluzione di lavoro con un foglio di metallo per evitare l'esposizione alla luce.
- Pipettare il preparato in gabbia fluoresceina destrano soluzione (passo 2.2) nella ago. Prima di tagliare la punta dell'ago a una dimensione appropriata al microscopio dissezione, posto un pezzo di trasparente filtro giallo davanti alla sorgente di luce bianca. Il filtro giallo impedirà uncaging spontanea della fluoresceina destrano durante le iniezioni. Quando si guarda attraverso il oculare oculare, la sorgente di luce deve apparire giallo.
- Raccogliere embrioni e pipettare in un vassoio di stampo microiniezione. Impostare il tempo di microiniezione per fornire 3-4 nL di gabbia fluoresceina destrano. Sotto il microscopio a dissezione, orientare gli embrioni con una pinza e iniettare (da 3 a 4 NL) in gabbia con fluoresceina destrano nella base del blastomero cellule (blastomeri-tuorlo d'interfaccia). La fase embrionale di iniezione deve essere 1 - a 2-cellule stadio.
- Dopo l'iniezione, rimuovere gli embrioni dal vassoio di stampo microiniezione e metterli in un piatto pulito Petri contenente acqua di pesce fresco. Blu di metilene può essere aggiunto all'acqua di pesce per prevenire la crescita fungina ad una concentrazione finale pari ad 0,02% w / v. Coprire la capsula di Petri con un foglio di metallo per evitare uncaging del iniettato in gabbia fluoresceina-destrano.
- Alzare gli embrioni iniettati di una fase in cui le cellule di interesse devono essere fotoattivati. Per fotoattivazione, preparare una soluzione a basso 0,6% di fusione agarosio in DDH 2 O. A seconda della fase embrionale, Tricaine (MS222) possono essere aggiunti alla fusione agarosio basso. Per fare questo, diluire 0,02% Tricaine a basso punto di fusione agarosio ad una concentrazione finale del 0,0014%.
- Non appena gli embrioni raggiungono lo stadio di sviluppo appropriato, dechorionate gli embrioni in 1 X Danieau dei media con una pinza. Quando dechorionating, assicurarsi che un filtro giallo trasparente è inserito nel percorso della sorgente di luce bianca (vedi punto 2.3).
- Riscaldare il 0,6% soluzione a basso fusione agarosio a 37 ° C. Pipettare 1 ml di fusione agarosio basso nel pozzo di un vetrino coprioggetti LabTek camerati. Cura il montaggio 3-4 embrioni in basso punto di fusione agarosio e orientarli con pinze con le celle da fotoattivati rivolto verso il basso contro il coprioggetto in basso.
- Lasciare solidificare l'agarosio. Dopo la solidificazione, pipettare 1 ml di 1 X Danieau supporto sopra l'agarosio.
- Ripetere i passaggi 2,8-2,9 per più embrioni.
3. Due fotoni attivazione di gabbia fluoresceina destrano
* Questa procedura presuppone che l'embrione esprime GFP reporter. L'embrione è visualizzato utilizzando lo ione argon (488 nm) sorgente laser collegata al microscopio LSM 510 META NLO. Una cellula GFP singolo positivo è selezionato e fotoattivati utilizzando il Mai Tai laser (laser a femtosecondi) accoppiato al LSM 510. La procedura è la stessa per non fluorescente embrioni. In alternativa, la luce bianca può essere usata per trovare la cella da attivare, seguita dalla attivazione utilizzando il Mai Tai sorgente laser.
- Caricare il software LSM 510. Mettere un filtro trasparente gialla nel percorso del fascio di luce bianca.
- Selezionare Scansione Nuova immagine e fare clic su Start Expert Mode.
- Selezionare la scheda laser. Accendere il ioni argon (488 nm) e Mai Tai (femtosecondi) sorgenti laser.
- Impostare il Mai Tai lunghezza d'onda a 740 nm.
- Selezionare la scheda di configurazione. Impostare la configurazione ottica di percorso per la ioni argon e Mai Tai laser.
- Selezionare la scheda Scansione. Cambia l'obiettivo di 20X/0.8.
- Impostare la velocità massima di scansione facendo clic su Max.
- Imposta modalità, Metodo e Numero di linea, media, e 1.
- Sotto la scheda Canali deselezionare tutte le sorgenti laser ad eccezione del Mai Tai.
- Posizionare un misuratore di potenza nel percorso ottico ottico.
- Selezionare il pulsante per attivare Cont scansione continua.
- Regolare la% di trasmissione fino a quando il misuratore di potenza legge un laser di potenza media di 47 mW.
- Arrestare la scansione selezionando il pulsante Stop.
- Sotto la scheda Canali deselezionare il Mai Tai sorgente laser e selezionare lo ione argon (488 nm).
- Selezionare il pulsante rapido xy. Sotto la scheda Canali regolare il foro stenopeico, il guadagno del rivelatore, amplificatore offset e guadagno dell'amplificatore per lo ione argon laser per ottenere la migliore qualità dell'immagine.
- Utilizzando il controller fase, trovare e mettere a fuoco la cellula da attivare.
- Fare clic sul pulsante Stop.
- Utilizzando lo strumento zoom, zoom sul cellulare attivato fino a quando il fattore di zoom nella scheda Modalità visualizza 50 a 70.
- Arrestare la scansione selezionando il pulsante Stop.
- Sotto la scheda Canali deselezionare l'argon ionizzato laser (488 nm) e selezionare il Mai Tai laser.
- Sotto la scheda Modalità impostare la velocità di scansione di 31,46 sec.
- Selezionare il pulsante singolo per avviare la scansione di due fotoni attivazione di gabbia fluoresceina destrano della cella selezionata.
- Dopo l'attivazione, deselezionare il Mai Tai laser nella scheda Canali e riselezionare il laser a ioni argon (488 nm).
- Impostare il fattore di zoom in modalità a 1, e cliccare sul pulsante sotto la velocità massima voce per impostare la massima velocità di scansione.
- Seleziona xy veloce a leggere le fotoattivati regione. Controllare che la regione non è fotoattivati laser ablato. Per ulteriori informazioni su ablazione laser, si prega di consultare la sezione discussione.
- Ripetere i passaggi precedenti per altri embrioni.
4. Immunolocalizzazione di Uncaged fluoresceina destrano (adattato da rif. 16)
- Dopo photoativation, posto un filtro trasparente giallo davanti alla sorgente di luce bianca e rimuovere manualmente ogni embrione dal basso punto di fusione di agarosio utilizzando pinze taglienti. Mettere tutti gli embrioni rimossi in un nuovo piatto di Petri contenente fresca 1 X Danieau media. Coprire la capsula di Petri con un foglio di metallo per evitare l'esposizione degli embrioni alla luce.
- Se necessario, dietro gli embrioni alla fase di sviluppo desiderato. Nel frattempo, preparare una soluzione di paraformaldeide al 4% (vedi Preparazione delle soluzioni). Aliquota 1,5 mL di paraformaldeide preparato in una provetta.
- Dopo gli embrioni hanno raggiunto lo stadio di sviluppo di interesse, pipetta gli embrioni in provetta (dal punto 4.2). Coprire il tubo con un foglio di metallo per evitare l'esposizione alla luce.
- Nutate il tubo di una notte a 4 ° C. Per il giorno successivo preparare graduati etanolo (EtOH) soluzioni in tampone salino fosfato (PBS) e DDH 2 O, il 30% EtOH: PBS, 50% EtOH: PBS, il 70% EtOH: DDH 2 O, e il 100% EtOH.
- Il giorno successivo, togliere gli embrioni di 4 ° C. Rimuovere la lamina di metallo che copre il tubo e aspirare rapidamente fuori paraformaldehye (lasciarsi alle spalle un piccolo volume che è sufficiente a coprire gli embrioni). Pipettare 1,5 mL di EtOH 30%: PBS nella provetta. Ri-coprire il tubo con un foglio di metallo. Nutate il tubo a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Ripetere il punto 4.5 utilizzando 50, 70 e 100% classificato soluzioni EtOH. Dopo il lavaggio 100% EtOH, lavare gli embrioni di nuovo in 100% EtOH per 10 minuti.
- Dopo il lavaggio, conservare gli embrioni durante la notte a -20 ° C. Per il giorno successivo preparare un tampone fosfato Tween (PBT; vedere Preparazione delle soluzioni), 5 X tampone bloccante (vedi protocollo del produttore per la preparazione), acido maleico (protocollo per la preparazione può essere trovato nel protocollo tampone di bloccaggio), 10 mg / ml proteinasi K, e un anticorpo 10 X soluzione (anti-fluoresceina-AP, vedere Preparazione delle soluzioni).
- Anche preparare il 2% di agnello nel siero (LS, vedere Preparazione delle soluzioni) diluito in PBT. Conservare l'anticorpo a 4 ° C per una notte agitando su un nutator. La LS 2% può essere conservato a 4 ° C.
- Il giorno dopo togliere gli embrioni da -20 ° C. Rimuovere la lamina di metallo che copre il tubo e aspirare rapidamente fuori EtOH 100%. Aggiungere 1,5 mL di EtOH 70%: DDH 2 O al tubo. Ri-coprire il tubo con un foglio di metallo. Nutate il tubo a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Ripetere il passo con 4,8 50 e 30% EtOH soluzioni classificato, e il 100% PBT. Dopo il lavaggio 100% PBT, lavare gli embrioni altri 3 volte in 100% PBT per 10 minuti.
- Se gli embrioni sono più vecchi di 24 ore, proteinasi K li trattano. In caso contrario, passare al punto 4.13. Per fare questo, diluire il preparato proteinasi K (punto 4.7) 1:1000 in PBT. Incubare gli embrioni in proteinasi K per 10 minuti, o più, se gli embrioni sono più vecchi. Mantenere gli embrioni ricoperto di un foglio di metallo per evitare l'esposizione alla luce.
- Dopo il trattamento con proteinasi K, lavare gli embrioni 5 volte in PBT per 10 minuti. Dopo il lavaggio, fissare gli embrioni in paraformaldeide 4% per 30 minuti a temperatura ambiente su un nutator. In seguito, lavare immediatamente gli embrioni 5 volte in PBT per 10 minuti. Mantenere gli embrioni ricoperto di un foglio di metallo per evitare l'esposizione alla luce.
- Fai un tampone di bloccaggio diluendo Buffer 5 X di blocco in tampone acido maleico a 1 X. Rimuovere gli embrioni da PBT e metterli in 1 tampone X di blocco. Coprire gli embrioni con un foglio di metallo e nutate a temperatura ambiente per 5 a 6 ore.
- Dopo 5 o 6 ore di blocco, heat shock degli embrioni a 65 ° C per 15 a 20 minuti.
- Ottenere la soluzione di anticorpi e la LS 2% preparato il giorno precedente. Centrifugare la soluzione di anticorpi a max giri. Trasferire la fase acquosa al tubo LS 2%. Capovolgere la provetta per mescolare.
- Trasferire gli embrioni da tampone di bloccaggio LS-anticorpo miscela. Mantenere gli embrioni ricoperto di un foglio di metallo per evitare l'esposizione alla luce. Nutate gli embrioni a 4 ° C durante la notte.
- Il giorno dopo lavare gli embrioni a temperatura ambiente 6 volte per 15 minuti in PBT. Preparare AP buffer (vedi Preparazione delle soluzioni).
- Lavare gli embrioni a temperatura ambiente per 2 volte per 10 minuti in tampone AP. Preparare NBT / BCIP soluzione di sviluppo (vedi Preparazione delle soluzioni).
- Trasferire gli embrioni NBT / BCIP. Lasciare che la macchia di sviluppare nel buio.
- Bloccare lo sviluppo lavando gli embrioni 3 volte in PBT per 5 minuti ciascuno.
- Per l'acquisizione di immagini montare gli embrioni in fusione di agarosio 0,6% a basso o 3% di metilcellulosa, e acquisire le immagini utilizzando un microscopio invertito o verticale.
- Fotoattivati campioni possono essere conservati per le analisi future (colorazione rimane stabile) da disidratazione in un lavaggio classificato EtOH. Seguire i passaggi attraverso 4,4 4,7 per la disidratazione dei campioni.
5. Rappresentante dei risultati:
Figura 1. Fotoattivazione di gabbia fluoresceina destrano. (A, B) Brightfield e l'immagine di fluorescenza di un embrione di zebrafish vista laterale in fase di 13/14-somite prima fotoattivazione. (C, D) L'embrione è stato fotoattivati in fase the13/14-somite in uno dei somiti (freccia) con una lunghezza d'onda di 740 nm, tempo di scansione di 31 secondi, e una potenza media del laser di 47 mW. Post-attivazione, (d) fluorescenza da Uncaged fluoresceina destrano è osservato. Orientamento: dorsale (a destra), ventrale (a sinistra). Scala bar 100 micron.
Figura 2. Immunolocalizzazione di gabbia fluoresceina destrano. La Figura 2 mostra i immunocolorazione di Uncaged fluoresceina destrano in un embrione 18/19 HPF zebrafish. Al 10-somite scena una piccola regione di un embrione è stato attivato nel mesoderma piastra laterale utilizzando i parametri laser stesso indicato nella figura 1. Utilizzando la procedura immunolocalizzazione, la freccia identifica la regione attivati con la colorazione di fondo minima. Orientamento: dorsale (in alto), ventrale (in basso). Scala bar 100 micron.
Discussion
Questo documento descrive un metodo versatile per la mappatura dei singoli il destino della cellula in base alla fotoattivazione di gabbia fluoresceina destrano. Uncaging di gabbia fluoresceina destrano in celle singole si ottiene utilizzando l'assorbimento a due fotoni di un laser a femtosecondi Mai Tai accoppiato al Zeiss LSM 510 META microscopio confocale. Uncaged fluoresceina destrano nelle cellule fotoattivati è rapidamente visualizzato usando una semplice procedura di immunoistochimica.
In questo protocollo i due fotoni di lunghezza d'onda di assorbimento per fotoattivazione di gabbia fluoresceina destrano è di 740 nm. Questa lunghezza d'onda è stato determinato sperimentalmente da photoactivating gabbia fluoresceina destrano embrioni di tipo selvatico iniettato. La lunghezza d'onda di eccitazione laser è stato variato dal 600-800 nm, e la presenza o assenza di fluoresceina fluorescenza post-attivazione era qualitativamente determinato. Abbiamo scoperto che 740 nm prodotta il più forte segnale di attivazione seguenti fluoresceina. Idealmente, 740 nm dovrebbe funzionare per tutti i sistemi modello, tuttavia, si consiglia di testare una vasta gamma di lunghezze d'onda per determinare l'ottimale a due fotoni di lunghezza d'onda di eccitazione per il campione.
In gabbia con fluoresceina destrano tipo selvatico embrioni iniettati, per ogni due-fotone di lunghezza d'onda di eccitazione testato anche variato la potenza media del laser. Per una lunghezza d'onda di eccitazione di 740 nm, una potenza media del laser di 47 mW prodotto un segnale fluoresceina più forte nella regione attivata rispetto a potenze inferiori laser media. Potenze superiori media del laser non ha prodotto segnali fluoresceina più forte, ma l'ablazione indotta del tessuto. Dato che gli impulsi laser a femtosecondi sono efficienti a ablazione dei tessuti biologici 15, si consiglia di determinare la potenza media soglia laser per fotoattivazione che evita l'ablazione dei tessuti.
Assorbimento a due fotoni si verifica all'interno di un volume di interazione di piccole dimensioni. Per garantire corretto funzionamento del dispositivo in gabbia con fluoresceina destrano, la cellula deve essere messa a fuoco corretta. Nel protocollo di cui sopra, le cellule GFP positive sono state contemporaneamente ripreso a luce bianca per confermare la messa a fuoco delle cellule. Pertanto, l'acquisizione di luce bianca, oltre ad altri canali è consigliabile. Dopo aver confermato fuoco delle cellule, il nostro protocollo suggerisce di ingrandimento della cellula attivata. Un fattore di zoom da 50 a 70 è suggerito, tuttavia, questo valore dipende dalla dimensione della cellula prescelta. Aumentando lo zoom isola la cellula attivata dalle cellule adiacenti, e limita l'area di scansione di due fotoni di attivazione. Idealmente, l'area di scansione dovrebbe coprire una vasta area della cellula.
Rilevazione di singole cellule attivate richiede che la colorazione di fondo essere minimo. Nel protocollo immunolocalizzazione sopra, è importante che il campione è bloccato in tampone di bloccaggio da 5 a 6 ore (punto 4.13). Durante lo sviluppo di NBT / BCIP, Uncaged fluoresceina destrano dovrebbe diventare visibile in 10 a 20 minuti. Se la colorazione di fondo è forte, si consiglia un tempo più lungo blocco e lava aggiuntive per rimuovere gli anticorpi (punto 4.17).
Le figure 1 e 2 forniscono risultati rappresentativi di fotoattivazione e immunolocalizzazione. Nella Figura 1, i primi 1 - a 2-cellule embrioni stadio tipo selvatico in gabbia sono stati iniettati con fluoresceina destrano. Gli embrioni sono stati sollevati a somitogenesis metà e montato in basso punto di fusione agarosio con l'orientamento laterale. Figura 1 (a, b) raffigurano campo chiaro e le immagini fluorescenti dell'embrione prima fotoattivazione. La prova che l'embrione è rimasto Uncaged è dimostrato dall'assenza di fluoresceina fluorescenza nella figura 1 (b). Una piccola regione all'interno di un somite è stato attivato con una lunghezza d'onda di 740 nm per 31 secondi utilizzando un laser di potenza media di 47 mW, Figura 1 (c, freccia). Post-attivazione, a due fotoni uncaging di fluoresceina destrano è verificato come dimostrano la fluorescenza della zona attiva, Figura 1 (d, freccia). Attivazione non è stato accompagnato da ablazione laser, come il tessuto somitic rimasta intatta, Figura 1 (c). La figura 2 mostra l'immunolocalizzazione di Uncaged fluoresceina destrano. Una piccola regione del mesoderma piastra laterale di un 10-somite embrione scena era fotoattivati utilizzando i parametri laser stesso, come indicato in Figura 1. L'embrione è stato sollevato e trattati con 4,1 passi attraverso 4.20. La freccia nella Figura 2 individua la regione attiva, come indicato da un accumulo di precipitato blu. Solo la posizione attiva è chiaramente individuata senza interferire colorazione di fondo.
Preparazione di soluzioni:
1 X PBT (1 L)
10 X 100 ml PBS
2 g di BSA
10 ml di Tween 20%
10 X PBS (1 L)
80 g di NaCl
2 g di KCl
6,1 g Na 2 HPO 4
1,9 g di KH 2 PO 4
DDH 2 O a 1 L
pH a 7,3
Paraformaldeide 4% (160 ml)
32% paraformaldeide (due flaconcini da 10 ml)
8 mL 20 X PBS
132 ml DDH 2 O
1 ml di NaCl 5 M
2,5 ml 1 M MgCl 2
5 ml 1 M Tris pH 9,5
250 microlitri Tween 20%
41,25 mL DDH 2 O
Anticorpi soluzione (per 1 campione)
5,5 microlitri polvere Acetone
40 microlitri PBT
LS 0,8 microlitri
0,1 microlitri anti-fluoresceina-AP anticorpi
2% LS (360 microlitri per 1 campione)
7,2 microlitri LS 100%
352,8 microlitri PBT
1 X Danieau media (1 L) ‡
11,6 mL 5 M NaCl
700 microlitri 1 M KCl
400 microlitri 1 M MgSO 4
600 microlitri 1 M di Ca (NO 3) 2
5 ml 1 M HEPES
DDH 2 O a 1 L
regolare il pH a 7,6
‡ Danieau è una soluzione salina ideale per l'allevamento di embrioni di zebrafish dechorionated. Altri mezzi di comunicazione possono essere utilizzati, purché siano correttamente con soluzioni isotoniche osmolarità (~ 300 mOsm per zebrafish)
NBT magazzino (1 ml)
50 mg Nitro Blu tetrazolo
0,7 ml di anidride dimetilformamide
0,3 mL DDH 2 O
BCIP magazzino (1 ml)
50 mg di 5-bromo-4-cloro-3-fosfato indolil
1 ml di anidride dimetilformamide
NBT / BCIP soluzione di sviluppo
1 ml di buffer AP
4,5 microlitri magazzino NBT
3,5 microlitri magazzino BCIP
Acetone polvere
- Selezionate 20 pesci adulti e congelare in azoto liquido.
- Macinare il pesce congelato con un mortaio e pestello in polvere.
- Trasferire la polvere di pesce in un tubo da 50 ml.
- Riempire il tubo conico con 100% di acetone. Vortice del tubo.
- Gira il tubo a max rpm per 10 minuti. Scartare il surnatante.
- Lavare il pellet altre 3 volte in 100% acetone e girare il tubo a max rpm per 10 minuti. Con l'ultimo lavaggio del surnatante deve apparire chiaro.
- Aggiungere 100 acetone% al pellet di nuovo e lasciare che il tubo di riposare a temperatura ambiente. Le particelle più dense si sistemerà, mentre le particelle più fini rimarrà in sospensione.
- Decantare le particelle in un nuovo tubo. Aliquota della soluzione polvere in tubi separati e conservarli a -20 ° C.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo J. Chen per la fornitura del gabbia fluoresceina destrano protocollo di sintesi. Questa ricerca è stata sostenuta dal marzo del premio Dimes 5-FY09-78, l'American Heart Association 09BGIA2090075 premio, e il NIH / NHLBI premio HL107369 R01-01 per SS Un ringraziamento speciale a C. Closson per la sua assistenza microscopia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 | |
| 10 kDa Aminodextran | Invitrogen | D1860 | |
| Zeba Desalt Spin Column | Pierce, Thermo Scientific | 89889 | |
| Low melting agarose | Amresco | 0815-100G | |
| Sodium Borate | Amresco | 1131117-100G | |
| Tricaine Methylsulfonate/ MS222 | Research Organics | 1347A | |
| Anti-fluorescein-AP | Roche Group | 11376622 | |
| Blocking buffer | Roche Group | 11 096 176 001 | |
| Maleic Acid | Sigma-Aldrich | MO375-500G | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| NBT | Sigma-Aldrich | I8377-250mg | |
| BCIP | Fisher Scientific | PI-34040 | |
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-2000 | |
| LabTek chambered coverglass slides | Nalge Nunc international | 155380 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Lamb serum | Invitrogen | 16070096 | |
| LSM 510 META NLO | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 20X 0.8 NA Air apochromatic objective | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Transparent yellow filter | Theatre House Inc. | Roscolux filter sheet Color: 312 |
References
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