Summary
사파이어 femtosecond 레이저 발진기 : 메소드는 티에서 두 광자 흡수를 사용하는 형광 단백질 갇힌를 포함하는 단일 세포를 photoactivate에 설명되어 있습니다. 운명의지도 photoactivated 세포는 immunohistochemistry가 사용됩니다. 이 기술은 모든 세포 유형에 적용할 수 있습니다.
Abstract
differentially 단일 세포를 분류하는 능력이 발달 생물학에서 중요한 의미가 있습니다. 예를 들어, 림프 및 혈액 선박 lineages은 개발 배아의 방법을 결정하는 것은 조혈 발생의 운명 매핑 및 undifferentiated 전구체 세포의 추적 혈통이 필요합니다. 최근 등이 photoactivatable 단백질 : EOS 1, 2, PAmCherry 3, Kaede 4-7, 8 pKindling, 그리고 KikGR 9 10 셀 추적 프로브와 같은 광범위한 관심을 받았습니다. 이러한 감광성의 단백질의 형광 스펙트럼은 쉽게 세포의 인구가 인접한 것들 구분할 수 있도록, UV 여기로 변환할 수 있습니다. 그러나, 활성 단백질의 photoefficiency 11을 추적하는 장기 세포를 제한할 수 있습니다. photoactivatable 단백질의 대안으로, 갇힌 플루오레신 - dextran 널리 배아 모델 시스템 7, 12-14에 사용되었습니다. 전통적으로 우리에서 내놓다 플루오레신 - dextran, 형광 램프 집 또는 단일 광자의 UV 레이저의 UV 여기 사용되었습니다 있지만, 이러한 소스는 photoactivation의 공간적 해상도를 제한합니다. 여기 우리는 운명지도 혈통 추적 및 단일 레이블 세포를 탐지하기 위해 프로토콜을보고합니다. 플루오레신 - dextran 갇힌 주사 배아의 단일 세포는 티타늄 사파이어 femtosecond 레이저에서 생산 근처 적외선 레이저 펄스와 photoactivated 있습니다. 이 레이저는이 문서에서 사용되는 LSM 510 META NLO 현미경 같은 모든 두 개의 광자 공촛점 현미경의 전통. 생물 학적 조직에 가까운 적외선 조사 15 투명 있기 때문에 레이저 펄스는 선택한 초점 평면 위 또는 아래 세포를 uncaging하지 않고 배아 이내 깊은 초점을 맞추고 있습니다. 따라서 비선형 두 광자 흡수는 하나의 셀에 플루오레신 - dextran을 개방하다에만 초점 기하학에서 유도됩니다. uncaged 플루오레신 - dextran을 포함하고있는 세포를 감지하기 위해, 우리는 신속하게 활성화된 세포를 시각화하는 간단한 immunohistochemistry 프로토콜 16 설명합니다. 본 논문에 제시된 활성화 및 감지 프로토콜은 다목적이고 모든 모델 시스템에 적용할 수 있습니다.
참고 :이 프로토콜에 사용되는 시약은 문서의 끝부분에 추가 테이블에서 찾을 수 있습니다.
Protocol
1. 갇힌 플루오레신 - dextran의 합성 (참조에서 적응. 14)
- ddH 2 O.에 희석 borate 나트륨의 0.1 M 솔루션을 준비
- 10 kDa aminodextran 4 MG을 측정하고 CMNB - 갇힌 플루오레신 튜브에 추가합니다.
- CMNB - 갇힌 플루오레신 관으로 준비 나트륨 borate 솔루션 500 μL (단계 1.1) 추가합니다. 혼합물을 용해하기 위해 30 초 동안 관과 소용돌이 모자.
- 혼합물은 실온에서 nutator에서 하룻밤 반응하도록 허용합니다. 주변 조명에 혼합물의 노출을 방지하기 위해 튜브 금속 호일로 커버.
- 하단 캡에서 Zeba 탈염하다 회전 칼럼과 트위스트를 구합니다. centrifuging시 방향으로 열을 사용됩니다 열을 점을 마크. 15 ML 원뿔 팔콘 튜브에 열을 삽입합니다. 참고 : 스핀 열에 솔루션은 열 버퍼입니다.
- 탈염하다 스핀 칼럼의 상단 뚜껑을 풀어. 원심 분리기의 탈염하다 스핀 열을 하우스 15 ML 원뿔 팔콘 튜브를 놓습니다. 동양이 표시된 점이 스핀 열 (단계 1.4) 원심 회전 날개의 중심에 직면. 상온에서 2 분 동안 1,000 XG에서 튜브를 원심.
- 원심 분리 후, 팔콘 튜브에서 탈염하다 스핀 열을 제거합니다. 를 통해 수집된 흐름과 15 ML 원뿔 튜브를 모두 폐기하십시오. 새로운 15 ML 원뿔 팔콘 튜브를 얻을, 그리고 새로운 팔콘 튜브의 탈염하다 스핀 컬럼을 넣으십시오. 참고 : centrifuging 후, 열 수지 침대를 압축 나타납니다. 즉시 열을 사용합니다.
- 단계 1.3 반응 혼합물을 (플루오레신 - dextran 갇힌) 구합니다. 스핀 컬럼에서 뚜껑을 제거하고 반응 혼합물을 기음과 탈염하다 스핀 열의 중앙에 천천히 적용해야합니다. 반응 혼합물을 적용한 후, 스핀 컬럼에 뚜껑을 교체하십시오.
- 원심 분리기의 탈염하다 스핀 열을 하우스 팔콘 튜브를 놓습니다. 마찬가지로 단계 1.5, 방향 원심 회전 날개의 중심을 향하고 표시된 점이 스핀 열의됐다. 상온에서 2 분 동안 1,000 XG에서 튜브를 원심.
- 원심 분리 후, 노란 혼합물은 (플루오레신 - dextran 갇힌) 15 ML 팔콘 튜브 (약 400 μL) 수집됩니다. 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 갇힌 플루오레신 - dextran 혼합물을 전송합니다.
- 즉시 주변 조명에 대한 혼합물의 노출을 방지하기 위해 튜브 금속 호일로 커버. speedvac에 갇힌 플루오레신 - dextran 혼합물을 Lyophilize. 350 μL의 Lyophilization은 약 4 시간 정도 소요됩니다.
- lyophilization 완료 후, 약 1 %의 최종 농도 ddH 2 O에 분말 (약 3 MG) resuspend W / 대 간단히 가루를 정직 vortexing하여 섞는다.
- 나누어지는 별도의 금속 포일 적용 튜브에 플루오레신 - dextran을 갇힌, 그리고에 그들을 저장할 -20 ° C.
2. 배아 및 플루오레신 - dextran 갇힌의 microinjection의 수확
*이 과정은 동물 모델 시스템으로 zebrafish를 사용합니다.
- 주사 전날, 디바이더와 탱크를 사육에 어느 1시 1분 남자와 여자 또는 2시 1분 남성 대 여성 zebrafish의 십자가를 설정합니다.
- 다음날 아침은 사육 탱크 물을 변화와 디바이더를 제거합니다. 당장 1 X Danieau 미디어 하나에 플루오레신 - dextran (솔루션의 준비를 참조) 또는 ddH 2 O에 갇힌의 5 μL 10분의 1 희석 작업 솔루션을 준비 작업 솔루션 튜브 조명에 노출을 방지하기 위해 금속 호일로 커버.
- 바늘로 준비 갇힌 플루오레신 - dextran 용액 (2.2 단계) 피펫. 해부 현미경 하에서 적절한 크기로 바늘 끝부분을 절단하기 전에 흰색 광원 앞에 투명한 노란색 필터의 한 조각을 넣으십시오. 노란색 필터는 주사 동안 플루오레신 - dextran의 자연 uncaging를 방지할 수 있습니다. 안구 눈 조각을 통해 원하는 때, 광원이 노란색 나타납니다.
- 배아를 수집하고 microinjection 금형 트레이에 그들을 피펫. 플루오레신 - dextran 갇힌의 NL 3-4를 전달 microinjection 시간을 설정합니다. 해부 현미경에서 동양 포셉와 배아 그리고 (3-4 NL) 주사는 blastomere 세포 (blastomere - 노른자 인터페이스)의 기본에 플루오레신 - dextran을 갇힌. 주사에 대한 배아 단계는 1되어야 - 2 - 세포 단계.
- 주사 후, microinjection 금형 트레이에서 배아를 제거하고 신선한 생선 물이 포함된 깨끗한 페트리 접시에 놓으십시오. 메틸렌 블루는 0.02 % w / 대에서의 최종 농도에 곰팡이 성장을 방지하기 위해 생선 물 추가할 수 있습니다 플루오레신 - dextran 갇힌 주입의 uncaging 방지하기 위해 금속 박과 함께 페트리 접시를 커버.
- 관심의 세포가 photoactivated해야 할 때 무대에 주입 배아를 올립니다. photoactivation 들어, ddH 2 O.에서 0.6 % 낮은 용융 아가로 오스 솔루션을 준비 배아 단계에 따라 Tricaine는 (MS222) 낮은 용해 아가로 오스에 추가할 수 있습니다. 이렇게하려면 0.0 희석0.0014 %의 최종 농도 낮은 용융 아가로 오스의 2퍼센트 Tricaine.
- 즉시 태아가 적절한 발달 단계, 포셉 1 X Danieau 미디어 dechorionate 배아에 도달 등. dechorionating 때 투명한 노란색 필터 (단계 2.3 참조) 백색 광원의 경로에 배치되었는지 확인합니다.
- 37 ° C.에 0.6 % 낮은 용융 아가로 오스 솔루션을 열 LabTek chambered의 coverglass 슬라이드의 잘으로 낮은 용해 아가로 오스의 피펫 1 ML. 조심스럽게 바닥 coverslip에 대해 아래에 직면 photoactivated하는 세포와 포셉 낮은 용해 아가로 오스와 동양 그들의 3-4 배아를 탑재합니다.
- 아가로 오스는 응고 수 있습니다. 응고 후, 피펫 아가로 오스 대 1 X Danieau 미디어 1 ML.
- 더 많은 배아를위한 2.9 단계 2.8을 반복합니다.
3. 갇힌 플루오레신 - dextran의 2 광자 활성화
*이 절차는 배아는 기자 GFP를 표현하고 있다고 가정합니다. 배아는 아르곤 이온 (488 NM) LSM 510 META NLO 현미경에 부착된 레이저 소스를 사용하여 볼 수 있습니다. 하나 GFP 양성 세포가 선택되고 LSM 510에 결합 마이 타이 레이저 (femtosecond 레이저)를 사용 photoactivated입니다. 프로 시저가 아닌 형광 배아에 대해 동일합니다. 또는 흰 빛이 마이 타이 레이저 소스를 사용하여 활성 뒤에 활성화될 수있는 세포를 발견하는 데 사용할 수 있습니다.
- LSM 510 소프트웨어를로드합니다. 하얀 빛을 빔 경로에 투명한 노란색 필터를 넣습니다.
- 새 이미지를 스캔 선택하고 전문가 모드 시작을 누릅니다.
- 레이저 탭을 선택합니다. 아르곤 이온 (488 NM)와 마이 타이 (femtosecond) 레이저 소스를 켭니다.
- 740 nm의에 마이 타이 파장을 설정합니다.
- 설정 탭을 선택합니다. 아르곤 이온과 마이 타이 레이저에 대한 광학 경로 구성을 설정합니다.
- 스캔 탭을 선택합니다. 20X/0.8로 목적을 변경합니다.
- 맥스를 클릭하여 최대 스캔 속도를 설정합니다.
- 설정 모드, 방법, 및 숫자 라인 말은, 1.
- 마이 타이를 제외한 채널 탭 선택을 취소 아래의 모든 레이저 소스.
- 광학 빔 경로에 전원 측정기를 놓습니다.
- 연속 스캔을 활성화 Cont 버튼을 선택합니다.
- 전원 측정기가 47 MW의 평균 레이저의 파워를 읽고 때까지 전송 %를 조정합니다.
- 정지 버튼을 선택하여 검색을 중지합니다.
- 채널 탭을 선택을 취소 마이 타이 레이저 소스와 아르곤 이온 (488 나노미터)을 선택에서.
- 빠른 XY 버튼을 선택합니다. 채널 탭 아래에있는 최상의 이미지 품질을 달성하기 위해 핀홀, 검출기 이득, 증폭기 오프셋, 그리고 아르곤 이온 레이저를위한 앰프 게인을 조정합니다.
- 무대 컨트롤러를 사용하여 찾아 활성화 세포에 중점을두고 있습니다.
- 중지 버튼을 클릭합니다.
- 모드 탭 아래에있는 줌 계수는 50-70를 표시합니다 때까지 활성화된 세포에 줌 도구를 사용하여 줌.
- 정지 버튼을 선택하여 검색을 중지합니다.
- 채널 탭 선택 해제 아래에있는 아르곤 이온 레이저 (488 nm의) 및 마이 타이 레이저를 선택합니다.
- 모드 탭에서 31.46 초로 스캔 속도를 설정합니다.
- 선택한 셀의 갇힌 플루오레신 - dextran의 2 광자 정품 인증에 대한 검색을 시작하려면 싱글 버튼을 선택합니다.
- 후 활성화, 취소 마이 타이 채널 탭 아래에 레이저와 reselect 아르곤 이온 레이저 (488 nm의).
- 1 모드에서 줌 계수를 설정하고 가장 빠른 스캔 속도를 설정 제목의 속도에서 최대 버튼을 클릭하십시오.
- photoactivated 지역을 검토 고속 XY를 선택합니다. photoactivated 지역은 레이저 ablated 있지는 않은지 확인하십시오. 레이저 절제에 대한 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오.
- 다른 배아에 대해 위의 단계를 반복합니다.
4. uncaged 플루오레신 - dextran의 면역 (심판의 적응. 16)
- photoativation 후, 흰색 광원 앞에 투명한 노란색 필터를 배치하고 수동 날카로운 집게를 사용하여 낮은 용융 아가로 오스에서 각 배아를 제거합니다. 신선 한 X Danieau 미디어를 포함하는 새로운 배양 접시에있는 모든 제거된 배아를 놓습니다. 빛에 배아의 노출을 방지하기 위해 금속 박과 함께 페트리 접시를 커버.
- 원하는 발달 단계에 필요한 경우, 후면 배아. 그 사이에 4 % paraformaldehyde 솔루션 (솔루션의 준비 참조) 준비합니다. microcentrifuge 튜브로 나누어지는 준비 paraformaldehyde 1.5 ML합니다.
- 배아 관심의 발달 단계에 도달 후, microcentrifuge 튜브 (4.2 단계에서)로 배아를 피펫. 조명에 노출을 방지하기 위해 튜브를 금속 호일로 커버.
- 4 박 튜브를 Nutate ° C. 그 다음날을위한 준비는 인산 버퍼 식염수 (PBS)와 ddH 2 O의 에탄올 (EtOH) 솔루션을 등급; 30% EtOH : PBS, 50 % EtOH : PBS 70 % EtOH : ddH 2 O, 그리고 100 % EtOH.
- 그 다음날, 4에서 배아를 제거 ° C.를 튜브를 덮고있는 금속 호일을 제거하고 신속하게 용건을 기음formaldehye (배아를 충당하기 위해 충분히 작은 볼륨 남겨두고). 튜브에 PBS : 30 % EtOH의 피펫 1.5 ML. 튜브 금속 호일로 다시 커버. 10 분에 대한 실내 온도에서 튜브를 Nutate.
- 50, 70을 사용하여 단계 4.5를 반복하고, 100 % EtOH 솔루션을 등급. 100 % EtOH 세척 후, 10 분에 대한 100 % EtOH에 다시 배아를 씻어.
- 세척 후, -20 ° C.에 밤새 배아를 저장 5 X 차단 버퍼 (준비 제조 업체 프로토콜을 참조), maleic 산성 (준비 프로토콜을 차단 버퍼 프로토콜에서 찾을 수 있습니다), 10 MG / ML proteinase, 그 다음날에 대한 십대 초반은 (솔루션의 준비를 참조하십시오 PBT) 인산가 버퍼 준비 K, 그리고 10 X 항체 솔루션 (안티 플루오레신 - AP, 솔루션의 준비 참조).
- PBT의 희석, 또한 2 % 증가 양고기 혈청 (솔루션의 준비를 참조하십시오 LS) 준비합니다. 4 항체를 저장 ° C 하룻밤 nutator에 떨고. 2 % LS는 4 ° C.에 보관 수 있습니다
- 그 다음날은 -20 ° C.에서 배아를 제거 튜브를 덮고있는 금속 호일을 제거하고 신속하게 100 % EtOH를 기음. 튜브에 ddH 2 O : 70 % EtOH 1.5 ML을 추가합니다. 튜브 금속 호일로 다시 커버. 10 분에 대한 실내 온도에서 튜브를 Nutate.
- 50 30% 등급 EtOH 솔루션, 및 100 % PBT를 사용하여 단계 4.8를 반복합니다. 100 % PBT 세척 후, 3 번 이상 10 분 100 % PBT의 배아를 씻어.
- 배아 24 시간보다 오래된 경우, proteinase K 그들을 처리합니다. 그렇지 않은 경우 4.13 단계로 진행합니다. 이렇게하려면, PBT의 준비 proteinase K (단계 4.7) 1:1000을 희석. 배아 나이가있다면 10 분, 이상 proteinase K에있는 태아를 품어. 조명에 노출을 방지하기 위해 금속 박으로 덮여 배아 보관하십시오.
- proteinase K 처리 후, 10 분 대한 태아에게 PBT 5 번 씻는다. 세탁 후 nutator에 실온에서 30 분에 대한 4 % paraformaldehyde에있는 배아를 수정. 그 후, 즉시 10 분 대한 태아에게 PBT 5 번 씻는다. 조명에 노출을 방지하기 위해 금속 박으로 덮여 배아 보관하십시오.
- X.이 PBT에서 배아를 제거하고 1 X 차단 버퍼에 넣어 1 maleic 산성 버퍼에 5 X 차단 버퍼를 diluting하여 차단 버퍼를 확인합니다. 금속 포일로 배아를 커버 5로 6 시간 동안 실온에서 그들을 nutate.
- 차단 열 쇼크 5~6시간 후 65 배아 ° C 15-20 분을 위해.
- 항체 솔루션을 구해서 2 % LS는 전날 준비. 최대 RPM에서 항체 솔루션을 원심 분리기. 2 % LS 튜브에 수성 단계를 전송합니다. 섞어 튜브를 반전.
- LS - 항체 혼합물에 버퍼를 차단에서 배아를 전송합니다. 조명에 노출을 방지하기 위해 금속 박으로 덮여 배아 보관하십시오. 4 ° C 하룻밤에있는 배아를 Nutate.
- 그 다음날은 PBT에서 15 분에 대한 실내 온도 6 회에서 배아를 씻으십시오. AP 버퍼 (솔루션의 준비 참조) 준비합니다.
- AP 버퍼에서 10 분에 대한 실내 온도 2 번에서 배아를 씻으십시오. NBT / BCIP 개발 솔루션 (솔루션의 준비 참조) 준비합니다.
- NBT / BCIP로 배아를 전송합니다. 얼룩이 어둠 속에서 개발을 허용합니다.
- 5 분 각각의 배아에게 PBT 3 번 세척하여 개발을 중지합니다.
- 이미지 수집을위한 0.6 % 낮은 용융 아가로 오스 또는 3 %의 메틸 셀룰로오스의 배아를 탑재하고, 거꾸로 또는 수직으로 복합 현미경을 사용하여 이미지를 획득.
- Photoactivated 샘플은 등급 EtOH 세척에서 그들을 dehydrating하여 향후 분석 (얼룩이 안정 상태)에 저장할 수 있습니다. 샘플을 dehydrating위한 4.7 단계 4.4 따르십시오.
5. 대표 결과 :
그림 1. 플루오레신 - dextran 갇힌의 Photoactivation. (A, B) Brightfield과 photoactivation 전에 13/14-somite 단계에서 가로보기 zebrafish 배아의 형광 이미지. (C, D) 배아가 740 NM의 파장을 가진 somites (화살표) 중 하나에 the13/14-somite 단계에서 photoactivated했다, 31 초 시간을 스캔하고, 47 MW의 평균 레이저의 파워. 후 활성화, (D) uncaged 플루오레신 - dextran에서 형광이 관찰됩니다. 오리 엔테이션 : 지느러미 (오른쪽), (왼쪽) 복부. 스케일 바 100 μm의.
그림 2. 면역의 플루오레신 - dextran을 갇힌. 그림 2는 19분의 18 hpf zebrafish 배아에서 uncaged 플루오레신 - dextran의 immunostaining을 묘사. 10 체절 단계에서 배아의 작은 지역은 그림 1에 명시된 동일한 레이저 매개 변수를 사용하여 측면 판 mesoderm으로 활성화되었다. 면역 프로 시저를 사용하여 화살표 최소한의 배경 얼룩으로 활성화된 지역을 식별합니다. 오리 엔테이션 : 지느러미 (상단), (아래) 복부. 스케일 바 100 μm의.
Discussion
본 논문은 플루오레신 - dextran 갇힌의 photoactivation에 따라 단일 셀 운명 매핑을위한 다양한 방법을 설명합니다. 하나의 세포에 갇힌 플루오레신 - dextran의 Uncaging 것은 자이스 혈구 LSM 510 META 공촛점 현미경을 결합 마이 타이의 femtosecond 레이저에서 두 광자 흡수를 사용하여 이루어진다. photoactivated 세포에 Uncaged 플루오레신 - dextran은 간단한 immunohistochemistry 절차를 사용하여 빠르게 시각이다.
이 프로토콜에 갇힌 플루오레신 - dextran의 photoactivation에 대해 두 광자 흡수 파장은 740 nm의 수 있습니다. 이 파장은 실험적 갇힌 플루오레신 - dextran 주입 wildtype의 배아를 photoactivating에 의해 결정되었다. 레이저 여기 파장은 600-800 nm의에서 변화되었고, 플루오레신 형광 후 정품 인증의 존재 또는 부재가 질적으로 결정했습니다. 우리는 740 nm의가 강한 플루오레신 신호 다음 정품 인증을 생산 것으로 나타났습니다. 이상적으로, 740 nm의 모든 모델 시스템에 대한 작동해야하지만, 우리는 샘플에 대한 최적의 두 광자 여기 파장을 결정하기 위해 파장의 범위를 테스트 좋습니다.
갇힌 플루오레신 - dextran 주입 wildtype의 배아에서 각 두 광자 여기 파장에 대해 우리는 또한 평균 레이저 파워를 다양한 테스트. 740 NM의 여기 파장을 위해, 47의 평균 레이저 전원 MW 평균 레이저 파워를 낮은 비교 활성화 지역에서 강한 플루오레신 신호를 생산. 높은 평균 레이저 힘이 강한 플루오레신 신호를 생산하지만, 조직 유도 절제하지 않았다. femtosecond 레이저 펄스는 생물 학적 조직 15 탄두에 효율적 때문에, 우리는 조직 절제를 피할 수 photoactivation에 대한 임계값 평균 레이저 파워를 결정하는 것이 좋습니다.
두 광자 흡수가 작은 상호 작용 볼륨 내에 발생합니다. 플루오레신 - dextran을 갇힌의 적절한 작동을 보장하기 위해 세포는 적절한 초점에 와야한다. 위의 프로토콜, GFP 양성 세포는 동시에 세포 초점을 확인하는 하얀 빛 아래에 몇 군데 있었다. 따라서 다른 채널 이외에 흰색 라이트 인수는 것이 좋습니다. 셀 포커스를 확인 후, 우리의 프로토콜은 활성 세포를 확대 제안합니다. 50-70의 줌 계수를 제안하지만,이 값은 선택한 셀의 크기에 따라 달라집니다. 줌을 늘리면 인접한 세포에서 활성화된 세포를 분리하고, 두 광자 정품 인증에 대한 검색 영역을 제한합니다. 이상적으로, 스캔 영역은 세포의 큰 영역을 커버한다.
단일 활성 세포의 탐지 배경 얼룩이 최소한 있어야합니다. 위의 면역 프로토콜에서는이 예제가 5~6시간 (4.13 단계)에 대한 버퍼를 차단에서 차단하는 것이 중요합니다. NBT / BCIP로 개발하면 플루오레신 - dextran은 10 분에서 20 분에서 볼 수가해야 uncaged. 배경 얼룩이 강한 경우, 우리는 항체 (단계 4.17)를 제거하는 이상 차단 시간과 추가적인 세척을하는 것이 좋습니다.
그림 1과 2는 photoactivation와 면역의 대표적인 결과를 제공합니다. 그림 1, 초 1 - 2 - 세포 단계의 배아에 wildtype 플루오레신 - dextran 갇힌로 주입했다. 배아는 중간 somitogenesis에 제기와 측면 방향으로 낮은 용해 아가로 오스에 마운트되었습니다. 그림 1 (A, B)는 photoactivation 전에 brightfield 및 배아의 형광 이미지를 묘사. 배가 uncaged 남은 증거는 그림 1 (B)에 플루오레신 형광의 부재에 의해 증명됩니다. 체절 내의 작은 지역은 47 평균 레이저의 파워 MW, 그림 1 (; 화살표 C)를 사용하여 31 초에 대한 740 nm의 파장의로 활성화되었다. 플루오레신 - dextran의 포스트 - 활성화, 두 광자 uncaging는 활성화된 지역 그림 1 (; 화살표 D)에서 형광으로 표시된 발생했습니다. somitic 조직은 그대로, 그림 1 (C) 유지로 정품 인증은 레이저 절제 동반되지 않았습니다. 그림 2는 uncaged 플루오레신 - dextran의 면역을 보여줍니다. 10 체절 단계 배아의 측면 플레이트 mesoderm의 작은 지역은 그림 1에서 설명한 동일한 레이저 매개 변수를 사용하여 photoactivated되었습니다. 배아는 사육 및 4.20 단계 4.1을 사용하여 처리되었습니다. 지역 활성화 그림 2 찾습니다에게에있는 화살표대로 파란색 침전물의 축적에 의해 지적했다. 오직 활성화 위치를 명확하게 배경 얼룩을 방해하지 않고도 감지됩니다.
솔루션의 준비 :
1 X PBT (1 L)
100 ML 10 × PBS
2g BSA
10 ML 20 % 십대 초반
10 X PBS (1 L)
80g NaCl
2g KCl
6.1 g 나 2 HPO 4
1.9 g KH 2 PO 4
1 L에 ddH 2 O
7.3으로 산도
4 % Paraformaldehyde (160 ML)
32 % Paraformaldehyde (2 인용 10 ML의 튜브)
8 ML 20 X PBS
132 ML ddH 2 O
한 ML 5 M NaCl
2.5 ML 1 M MgCl 2
5 ML 1 M 트리스의 산도 9.5
250 μL 20 % 십대 초반
41.25 ML ddH 2 O
항체 용액 (1 샘플의 경우)
5.5 μL 아세톤 분말
40 μL PBT
0.8 μL LS
0.1 μL 방지 플루오레신 - AP 항체
2 % LS (1 샘플을 360 μL)
7.2 μL 100 % LS
352.8 μL PBT
1 X Danieau 미디어 (1 패) ‡
11.6 ML 5 M NaCl
700 μL 1 M KCl
400 μL 1 M MgSO 4
600 μL 1 M 카 (NO 3) 2
5 ML 1 M HEPES
1 L에 ddH 2 O
산도 7.6로 조정
‡ Danieau는 dechorionated zebrafish의 배아를 양육을위한 이상적인 소금 솔루션입니다. 다른 미디어가 사용될 수 있습니다, 그들이 제대로 osmolarity (zebrafish에 대한 ~ 300 mOsm)과 isotonic 솔루션입니다 제공
NBT 주식 (1 ML)
50 MG 니트로 블루 Tetrazolium
0.7 ML 디메틸 포름 아미드의 무수물
0.3 ML ddH 2 O
BCIP 주식 (1 ML)
50 MG 5 - 브로모 -4 - 클로로 -3 - 인산 인돌릴
한 ML 디메틸 포름 아미드의 무수물
NBT / BCIP 개발 솔루션
한 ML AP 버퍼
4.5 μL NBT 주식
3.5 μL BCIP 주식
아세톤 분말
- 20 성인 물고기를 선택하고 액체 질소에서 그들을 동결.
- 절구로 냉동 생선을 갈아 및 파우더에 유봉.
- 50 ML 원뿔 튜브에 생선 분말을 전송합니다.
- 100 % 아세톤으로 원뿔 튜브를 입력합니다. 소용돌이 튜브합니다.
- 10 분에 대한 최대 RPM에서 튜브를 돌린다. 뜨는 폐기하십시오.
- 펠렛에게 100 % 아세톤에있는 다른 3 번 씻어 10 분에 대한 최대 RPM에서 튜브를 돌린다. 마지막 세척으로 뜨는 분명히 나타납니다.
- 다시 펠렛에 100 % 아세톤을 추가하고 튜브는 상온에서 대기하자. 미세한 입자 현탁액에 남아있는 동안 더 밀도 입자가 해결됩니다.
- 새로운 튜브로 미세 입자를 가만히 따르다. 나누어지는 분말 별도의 튜브에 솔루션 및 -20 ° C.에 그들을 저장
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 갇힌 플루오레신 - dextran 합성 프로토콜을 제공하는 J. 첸 주셔서 감사합니다. 이 연구는 천 수상 5 FY09 - 78, 미국 심장 협회 상을 09BGIA2090075의 월 지원하고, SS에 NIH / NHLBI 수상 R01 HL107369 - 01 특수 그의 현미경 보조 C. Closson에 감사드립니다.되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 | |
| 10 kDa Aminodextran | Invitrogen | D1860 | |
| Zeba Desalt Spin Column | Pierce, Thermo Scientific | 89889 | |
| Low melting agarose | Amresco | 0815-100G | |
| Sodium Borate | Amresco | 1131117-100G | |
| Tricaine Methylsulfonate/ MS222 | Research Organics | 1347A | |
| Anti-fluorescein-AP | Roche Group | 11376622 | |
| Blocking buffer | Roche Group | 11 096 176 001 | |
| Maleic Acid | Sigma-Aldrich | MO375-500G | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| NBT | Sigma-Aldrich | I8377-250mg | |
| BCIP | Fisher Scientific | PI-34040 | |
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-2000 | |
| LabTek chambered coverglass slides | Nalge Nunc international | 155380 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Lamb serum | Invitrogen | 16070096 | |
| LSM 510 META NLO | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 20X 0.8 NA Air apochromatic objective | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Transparent yellow filter | Theatre House Inc. | Roscolux filter sheet Color: 312 |
References
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