Summary
Метод описан в photoactivate одной клетки, содержащие в клетках флуоресцентного белка с помощью двух-фотонного поглощения от Ti: Sapphire фемтосекундного лазерного генератора. Для судьба карте фотоактивированного клетки, иммуногистохимии используется. Эта техника может быть применена к любому типу клеток.
Abstract
Возможность дифференциально маркировать отдельные клетки имеет важное значение в развитии биологии. Например, в определении того, как гемопоэтических, линий лимфатических и кровеносных сосудов возникают в развивающихся эмбрионах требуется отображение судьбы и линии отслеживания недифференцированных клеток-предшественников. Недавно фотоактивируемых белков, которые включают: 1 Eos, 2, PAmCherry 3, Kaede 4-7, pKindling 8 и 9 KikGR, 10 получили широкий интерес как сотовые отслеживания зондов. Спектр флуоресценции эти светочувствительные белки могут быть легко преобразованы с УФ возбуждении, позволяя популяции клеток следует отличать от соседними. Тем не менее, photoefficiency из активированного протеина может ограничить долгосрочные клетки отслеживания 11. В качестве альтернативы фотоактивируемых белков, в клетке флуоресцеина-декстран широко используется в зародыше модели систем 7, 12-14. Традиционно для флуоресцеина выпускать из клетки-декстран, УФ-возбужденныхрадиоизлучение от флуоресценции доме лампы или одного лазерного УФ-фотонов была использована, однако такие источники ограничивает пространственное разрешение фотоактивации. Здесь мы приводим протокол к судьбе карту, происхождение следа, и обнаружить одно меченых клеток. Отдельные клетки у эмбрионов вводят в клетке флуоресцеина-декстран которые фотоактивируемые с ближнего инфракрасного лазерного импульса производятся из фемтосекундного лазера титана сапфира. Этот лазер является обычным во всех двухфотонного конфокальный микроскоп, таких как META LSM 510 NLO микроскоп, используемые в настоящем документе. С биологической ткани является прозрачным для инфракрасного облучения 15, лазерные импульсы могут быть направлены глубоко внутри эмбриона без uncaging клеток выше или ниже выбранной фокальной плоскости. Таким образом, нелинейный двух-фотонного поглощения индуцируется только на геометрического фокуса выпускать из клетки флуоресцеина-декстрана в одной ячейке. Чтобы обнаружить ячейку, содержащую Uncaged флуоресцеина-декстрана, мы опишем простой протокол от 16 до иммуногистохимии быстро видеотехникативной активированных клеток. Активация и обнаружения протокола представленные в этой статье является универсальным и может быть применен к любой модели системы.
Примечание: реагенты, используемые в настоящем протоколе можно найти в таблице, прилагаемой в конце статьи.
Protocol
1. Синтез клетке флуоресцеина-декстрана (адаптировано из работы. 14)
- Подготовить 0,1 М раствора бората натрия разводят в DDH 2 O.
- Измерьте 4 мг 10 кДа aminodextran и добавить его в CMNB-клетке трубки флуоресцеина.
- Добавить 500 мкл приготовленного раствора бората натрия (шаг 1,1) в CMNB-клетке трубки флуоресцеина. Закройте пробирку крышкой и вихрь в течение 30 секунд, чтобы растворить смесь.
- Позвольте смеси реагировать в течение ночи на nutator при комнатной температуре. Крышка трубки с металлической фольгой для предотвращения воздействия смеси на окружающий свет.
- Получить спина Zeba опреснения колонки и поворот от нижней крышки. Отметить точку на колонку, которая будет использована для ориентации столбца при центрифугировании. Поместите колонку в 15 мл коническую трубку Falcon. Примечание: решение в спине колонки колонки буфером.
- Ослабить верхнюю крышку на опреснения колонке спина. Поместите 15 мл коническую трубку Соколе, где находится опреснения колонке спина в супермаркетifuge. Orient спина колонки с отмеченной точкой (шаг 1,4) с видом на центр ротора центрифуги. Центрифуги трубы при 1000 мкг в течение 2 минут при комнатной температуре.
- После центрифугирования, удаления опреснения колонке спина от метро Сокол. Откажитесь как собранные потока через и 15 мл коническую трубку. Получить новую 15 мл коническую трубку Сокола, и поместить опреснения колонке спина в новую пробирку Falcon. Примечание: После центрифугирования, кровать колонке смола должна появиться уплотняется. Используйте колонку сразу.
- Получить отреагировал смеси (в клетке флуоресцеина-декстрана) в пункте 1.3. Снимите крышку с колонки спина и аспирации отреагировал смеси и применять его медленно к центру опреснения колонке спина. После применения отреагировал смеси, наденьте на него колпачок на спине колонки.
- Поместите пробирку Соколе, где находится опреснения колонке спина в центрифуге. Как это было сделано в пункте 1.5, ориентация спина колонки с отмеченной точкой с видом на центр ротора центрифуги. Centrifugэлектронной трубки при 1000 мкг в течение 2 минут при комнатной температуре.
- После центрифугирования, желтая смесь (в клетке флуоресцеина-декстран) будут собраны (примерно 400 мкл) в 15 мл трубки Falcon. Переезд в клетке флуоресцеина-декстран смеси 1,5 мл микроцентрифужных трубку.
- Сразу покрытия труб с металлической фольгой для предотвращения воздействия смеси на окружающий свет. Lyophilize в клетке флуоресцеина-декстран смеси в SpeedVac. Лиофилизация 350 мкл займет около 4 часов.
- После завершения лиофилизации, ресуспендируют порошка (около 3 мг) в DDH 2 O до конечной концентрации около 1% вес / Смешать коротко встряхиванием приостановить порошка.
- Аликвотировать клетке флуоресцеина-декстрана в отдельных металлической фольги покрытый трубами, и храните их при температуре -20 ° C.
2. Сбор эмбрионов и микроинъекции клетке флуоресцеина-декстрана
* Эта процедура использует рыбок даниокак модель системы животного.
- За день до инъекции, создана данио кресты либо 1:01 мужчина-женщина или 2:1 мужчин и женщин в разведении танков с разделителями.
- На следующее утро менять воду разведения танк и удалить разделители. Немедленно подготовить 5 мкл 1/10 разбавленного рабочего раствора клетке флуоресцеина-декстран или в 1 X Danieau СМИ (см. приготовления растворов) или DDH 2 O. Крышка рабочего раствора трубки с металлической фольгой, чтобы предотвратить воздействие света.
- Внесите подготовленное клетке флуоресцеина-декстран раствор (шаг 2,2) в иглу. Перед разрезанием кончика иглы до нужного размера под микроскопом рассечение, поместить кусок прозрачного желтый фильтр в передней части белый источник света. Желтый фильтр будет препятствовать спонтанной uncaging из флуоресцеина-декстран во время инъекции. При поиске через глазные часть глаза, источник света должен появиться желтые.
- Сбор эмбрионов и пипеткой их в microiЛоток njection формы. Установить микроинъекции время, чтобы поставить от 3 до 4 НБ клетке флуоресцеина-декстрана. При вскрытии микроскопом, ориентироваться эмбрионов с пинцетом и вводят (3 до 4 NL) в клетке флуоресцеина-декстрана в основание бластомеров клеток (бластомеров желтка интерфейс). Стадии эмбриона для инъекций должна быть 1 - 2-клеточной стадии.
- После инъекции удалить эмбрионы из лотка формы микроинъекции и поместить их в чистую чашку Петри, содержащую пресную воду рыб. Метиленовый синий могут быть добавлены к рыбе воды для предотвращения роста грибов в конечной концентрации 0,02% вес / Накройте чашку Петри с металлической фольгой, чтобы предотвратить uncaging введенного в клетке флуоресцеина-декстрана.
- Поднимите вводят эмбрионы до стадии, когда клетки интереса должны быть фотоактивируемые. Для фотоактивации, готовить на 0,6% низкой температурой плавления агарозы решение в DDH 2 O. В зависимости от стадии эмбриона, Tricaine (MS222) могут быть добавлены к низкой температурой плавления агарозы. Чтобы сделать это, развести 0,02% Tricaine в низкой температурой плавления агарозы до конечной концентрации 0,0014%.
- Как только эмбрионы достигают соответствующей стадии развития, dechorionate эмбрионов в 1 X Danieau СМИ щипцами. Когда dechorionating, убедитесь, что прозрачный желтый фильтр находится на пути белого источника света (см. п. 2.3).
- Нагрейте 0,6% низкой температурой плавления агарозы решение до 37 ° C. Внесите 1 мл низкой температурой плавления агарозы в колодец покровного стекла слайд LabTek камерные. Осторожно установите 3 до 4 эмбрионов в низкой температурой плавления агарозы и ориентировать их с помощью пинцета с клетками для фотоактивируемые обращены вниз к нижней покровное.
- Разрешить агарозном чтобы затвердеть. После затвердевания, пипетки 1 мл 1 X Danieau СМИ за агарозы.
- Повторите шаги с 2,8 до 2,9 для более эмбрионов.
3. Двухфотонные активации клетке флуоресцеина-декстрана
* Эта процедура предполагает, что эмбрион выражает ReporteГ GFP. Эмбрион просмотреть с помощью ионов аргона (488 нм) лазерный источник прикреплены к LSM 510 META микроскопом НЛО. Один GFP положительные клетка выбрана и фотоактивируемые помощью Mai Tai лазера (фемтосекундного лазера) в сочетании с LSM 510. Процедура одинакова для нефлуоресцентного эмбрионов. Кроме того, белый свет может быть использован, чтобы найти клетку, чтобы быть активированы, с последующей активацией помощью Mai Tai лазерного источника.
- Загрузите LSM 510 программное обеспечение. Поместите прозрачный желтый фильтр в белый свет пути луча.
- Выберите Сканировать Новые изображения и нажмите кнопку Пуск Expert Mode.
- Выберите вкладку лазерный. Включите ионов аргона (488 нм) и Mai Tai (фемтосекундных) лазерных источников.
- Установить Mai Tai длиной волны до 740 нм.
- Выберите вкладку конфигурации. Установите оптическую конфигурацию путь для ионов аргона и Mai Tai лазера.
- Выберите вкладку Сканирование. Изменение целью 20X/0.8.
- Установите максимальную скорость сканирования, нажав Макс.
- Set Mode, методов и номер линии, Средний и 1.
- Под снимите вкладке Channels всех лазерных источников, за исключением Mai Tai.
- Поместите измеритель мощности в оптическом пути луча.
- Выберите Cont кнопку для включения непрерывного сканирования.
- Отрегулируйте передачи% до измеритель мощности читает средней мощности лазерного из 47 мВт.
- Остановить проверку, выбрав кнопку Стоп.
- Под каналов вкладке снимите Mai Tai лазерного источника и выберите ионов аргона (488 нм).
- Выберите кнопку быстрого ху. На вкладке Channels отрегулировать отверстие, детектор усиления усилителя смещения и усиления усилителя для аргонового ионного лазера для достижения наилучшего качества изображения.
- Использование этапе контроллер, найти и сосредоточиться на ячейку для активации.
- Нажмите кнопку Стоп.
- Используя инструмент масштабирования, увеличить на активированные клетки, пока коэффициент масштабирования в режиме вкладки отображается 50 до 70.
- Остановить проверку, выбрав кнопку Стоп.
- Под снимите вкладку Каналы ионов аргона-лас-эр (488 нм) и выберите Mai Tai лазера.
- В режиме вкладке установите скорость сканирования до 31,46 сек.
- Выберите одну кнопку, чтобы начать сканирование в течение двух-фотонной активации клетке флуоресцеина-декстрана от выбранной ячейки.
- После активации, снимите Mai Tai лазерных вкладке Channels, и повторно аргоновый ионный лазер (488 нм).
- Установить коэффициент масштабирования в режиме 1, и нажмите на кнопку Max под заголовком скорость, чтобы установить быстрый скорость сканирования.
- Выберите Быстрый ху рассмотреть фотоактивированного региона. Убедитесь, что фотоактивированного регионе не лазерной абляции. Для получения дополнительной информации о лазерной абляции, пожалуйста, обратитесь к обсуждению раздела.
- Повторите эти действия для других эмбрионов.
4. Иммунодетекции из Uncaged флуоресцеина-декстрана (адаптировано из работы. 16)
- После photoativation, поместить прозрачный желтый фильтр в передней части белый источник света и вручную удалить из каждого эмбриона лвл плавления агарозы с помощью острых щипцов. Поместите все снятые эмбрионов в новом чашку Петри, содержащую свежие 1 X Danieau СМИ. Накройте чашку Петри с металлической фольгой для предотвращения воздействия эмбрионов на свет.
- При необходимости задние эмбрионов до нужной стадии развития. В то же время, подготовиться 4% параформальдегида решение (см. приготовления растворов). Алиготе 1,5 мл подготовленной параформальдегидом в микроцентрифуге трубку.
- После эмбрионов достигли стадии развития интереса, пипетки эмбрионов в микроцентрифуге трубки (с шагом 4,2). Крышка трубки с металлической фольгой, чтобы предотвратить воздействие света.
- Кивать трубку в течение ночи при 4 ° C. На следующий день подготовки оцениваются этанола (этанол) решения в фосфатный буфер солевой раствор (PBS) и DDH 2 O, 30% этанола: PBS, 50% этанола: PBS, 70% этанола: DDH 2 O и 100% этанола.
- На следующий день, удалить эмбрионов от 4 ° C. Снимите металлическую фольгу покрытие трубки и быстро аспирации от пунктаformaldehye (оставить небольшой объем, что достаточно, чтобы покрыть эмбрионов). Внесите 1,5 мл 30% этанола: PBS в трубку. Повторное покрытие труб с металлической фольгой. Кивать трубки при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Повторите шаг 4,5, используя 50, 70 и 100% этанола оценивается решений. После 100% мытья EtOH, промыть эмбрионов раз в 100% этанола в течение 10 мин.
- После мойки, хранения эмбрионов в течение ночи при температуре -20 ° C. На следующий день готовить фосфатным буфером между (PBT, см. приготовления растворов), 5 X блокирующего буфера (см. производителем протокол для подготовки), малеиновой кислоты (протокол для предварительной подготовке можно найти в блокирующем буфере протокола), 10 мг / мл протеиназы К и 10 X раствор антител (Anti-флуоресцеина-AP, см. приготовления растворов).
- Также приготовьте 2% баранины сыворотки (LS, см. приготовления растворов) разводят в PBT. Храните антитело при 4 ° С в течение ночи тряску на nutator. 2% LS можно хранить при температуре 4 ° C.
- На следующий день удалите эмбрионовОт -20 ° C. Снимите металлическую фольгу покрытие трубки и быстро аспирации от 100% этанола. Добавить 1,5 мл 70% этанола: DDH 2 O к трубе. Повторное покрытие труб с металлической фольгой. Кивать трубки при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Повторите шаг 4,8, используя 50 и 30% этанола оценивается решений, и 100% PBT. После 100% мытья PBT, промыть эмбрионов 3 раза в 100% PBT течение 10 мин.
- Если эмбрионы старше, чем 24 часов, протеиназы К их лечения. Если нет, перейдите к пункту 4.13. Чтобы сделать это, развести подготовленным протеиназы К (шаг 4.7) 1:1000 в PBT. Инкубируйте эмбрионов в протеиназы К в течение 10 минут или дольше, если эмбрионы старше. Держите эмбрионов покрывают металлической фольгой, чтобы предотвратить воздействие света.
- После лечения протеиназы К, мыть эмбрионов 5 раз в PBT течение 10 мин. После промывки исправить эмбрионов в 4% параформальдегидом в течение 30 минут при комнатной температуре на nutator. После этого немедленно промыть эмбрионов 5 раз в PBT течение 10 мин. Держите эмбрионовпокрытые металлической фольгой, чтобы предотвратить воздействие света.
- Сделать блокирующего буфера путем разбавления 5 X блокирующего буфера в буфер малеиновой кислоты на 1 X. Удалить эмбрионы из PBT и поместить их в 1 X блокирующего буфера. Накройте эмбрионов с металлической фольгой и кивать их при комнатной температуре в течение 5 до 6 часов.
- После 5 до 6 часов в режиме блокировки, тепловой шок эмбрионов при 65 ° C в течение 15 до 20 минут.
- Получить решение антитела и 2% LS подготовлен в предыдущий день. Центрифуга раствор антител при макс оборотах в минуту. Передача водной фазы в 2% LS трубку. Обратить трубки перемешать.
- Перенесите эмбрионы из блокирующего буфера в LS-антитело смеси. Держите эмбрионов покрывают металлической фольгой, чтобы предотвратить воздействие света. Кивать эмбрионов при 4 ° С в течение ночи.
- На следующий день мыть эмбрионов при комнатной температуре в 6 раз в течение 15 минут в PBT. Подготовка AP буфера (см. приготовления растворов).
- Промойте эмбрионы при комнатной температуре в 2 раза по 10 минут в AP буffer. Подготовка NBT / BCIP развивающихся решения (см. приготовления растворов).
- Перенесите эмбрионы NBT / BCIP. Разрешить пятно развиваться в темноте.
- Остановить развитие стиральная эмбрионов 3 раза в PBT в течение 5 минут каждый.
- Для получения изображения смонтировать эмбрионов в 0,6% низкой температурой плавления агарозы или 3% метилцеллюлозы, и получать изображения с помощью перевернутого или вертикальном соединении микроскопом.
- Фотоактивированного образцы могут быть сохранены для последующего анализа (окрашивание остается стабильным) путем дегидратации их в градуированную мыть EtOH. Выполните шаги с 4,4 по 4,7 для обезвоживания образцов.
5. Представитель Результаты:
Рисунок 1. Фотоактивация клетке флуоресцеина-декстрана. (A, B) Светлое и флуоресценции изображение зародыша рыбки данио боковой вид на 13/14-somite этап перед фотоактивации. (C, D) эмбрион был фотоактивируемыет the13/14-somite этапом в одном из сомитов (стрелка) с длиной волны 740 нм, время сканирования на 31 секунд, а средняя мощность лазерного из 47 мВт. После активации, (г) флуоресценции флуоресцеина Uncaged-декстрана не наблюдается. Ориентация: Спинной (справа), брюшные (слева). Шкала бар 100 мкм.
Рисунок 2. Иммунодетекции в клетке флуоресцеина-декстрана. На рисунке 2 представлена иммуноокрашивания из Uncaged флуоресцеина-декстрана в 18/19 эмбрионов данио рерио HPF. На 10-сомитов небольшой области эмбриона был активирован в латеральной пластинки мезодермы с теми же параметрами лазерного заявил на рисунке 1. С помощью иммунологического процедуры, стрелка указывает активированного региона с минимальным окрашиванием фона. Ориентация: Спинной (вверху), вентральной (нижней). Шкала бар 100 мкм.
Discussion
Эта статья описывает универсальный метод для отображения одной судьбой ячейки на основе фотоактивации клетке флуоресцеина-декстрана. Uncaging в клетке флуоресцеина-декстрана в одиночных камерах достигается с помощью двух-фотонного поглощения от фемтосекундных лазерных Mai Tai связан с Zeiss LSM 510 META конфокальной микроскопии. Uncaged флуоресцеина-декстрана в фотоактивированного клетки быстро визуализировать с помощью простой процедуры иммуногистохимии.
В этом протоколе двухфотонного поглощения длины волны для фотоактивации клетке флуоресцеина-декстрана составляет 740 нм. Эта длина волны была экспериментально определяется photoactivating клетке флуоресцеина-декстрана вводят эмбрионов дикого типа. Длина волны лазерного возбуждения варьировалась от 600 до 800 нм, а наличие или отсутствие флуоресценции флуоресцеина после активации было качественно определен. Мы обнаружили, что 740 нм произвел сильнейший флуоресцеина сигнал после активации. В идеале, 740 нм должна работать для всехмодельных систем, однако мы рекомендуем тестирования диапазона длин волн для определения оптимального двухфотонного длины волны возбуждения для вашего образца.
В клетке флуоресцеина-декстрана вводят дикого типа эмбрионы, для каждой из двух фотонов длины волны возбуждения испытания мы также изменялась средняя мощность лазера. Для длины волны возбуждения 740 нм, средняя мощность лазера 47 МВт производства флуоресцеина сильнее сигнал на активированном области по сравнению к снижению средней мощности лазера. Высшее средней мощности лазерного не производят сильные сигналы флуоресцеина, но абляции тканей. С фемтосекундных лазерных импульсов эффективны при абляции биологической ткани 15, мы рекомендуем определения порога генерации средней мощности для фотоактивации, чтобы избежать аблации ткани.
Два-фотонного поглощения происходит в течение небольшого объема взаимодействия. Для обеспечения правильной активации в клетке флуоресцеина-декстран, клетки должны быть приведены в надлежащее внимание. В гоэлектронной выше протокола, GFP-положительных клеток были одновременно отображаемого при дневном свете, чтобы подтвердить фокус ячейки. Таким образом, белый свет приобретения в дополнение к другим каналам является целесообразным. После подтверждения фокус ячейки, наш протокол предлагает увеличение активированных клеток. Коэффициент масштабирования от 50 до 70 Предполагается, однако, эта величина зависит от размера выбранной ячейки. Увеличение масштаба изолирует активированные клетки от соседних клеток, а также ограничивает область сканирования в течение двух-фотонной активации. В идеале, область сканирования должна охватывать большую площадь ячейки.
Обнаружение одного активированных клеток требуется, чтобы фоновое окрашивание быть минимальным. В приведенном выше протоколе иммунодетекции важно, что образец их в блокирующем буфере в течение 5 до 6 часов (шаг 4,13). При разработке с NBT / BCIP, Uncaged флуоресцеина-декстран должны стать видимыми в течение 10 до 20 минут. Если фоновое окрашивание сильна, мы предлагаем больше времени блокировки и дополнительной промывки для удаления антитела (шаг 4,17).
На рисунках 1 и 2 представлены репрезентативные результаты фотоактивации и иммунодетекции. На рисунке 1, ранним 1 - 2-клетки эмбрионов на стадии дикого типа вводили в клетке флуоресцеина-декстрана. Эмбрионы были подняты до середины сомитогенеза и установлен в низкой температурой плавления агарозы в боковой ориентации. На рисунке 1 (а, б) изобразить светлое и флуоресцентные изображения эмбриона до фотоактивации. Доказательства того, что эмбрион остался Uncaged демонстрирует отсутствие флуоресценции флуоресцеина на рисунке 1 (б). Небольшая область в сомитов была активирована с длиной волны 740 нм в течение 31 секунд использовании средней мощности лазерного из 47 мВт, рисунок 1 (с; стрелка). После активации, двухфотонное uncaging флуоресцеина-декстран произошло как показано на флуоресценции от активированного области, Рисунок 1 (D; стрелка). Активация не сопровождается лазерная абляция, как сомитной ткани остаются нетронутыми, рисунок 1 (с). На рисунке 2 показаны иммунодетекции из Uncaged плавикового escein-декстрана. Небольшая область в латеральной пластинки мезодермы из 10-сомитов эмбрион фотоактивируемые с использованием тех же параметров лазера, как указано на рисунке 1. Эмбрион был поднят и обрабатывается с использованием шагов через 4,1 4,20. Стрелки на рисунке 2 находит регионе активирована, о чем свидетельствует накопление синий осадок. Только активированный расположение четко обнаружено не вмешиваясь фоне окрашивания.
Подготовка решения:
1 X PBT (1 л)
100 мл 10 X PBS
2 г BSA
10 мл 20% Tween
10 X PBS (1 л)
80 г NaCl
2 г KCl
6,1 г Na 2 HPO 4
1,9 г KH 2 PO 4
DDH 2 O до 1 л
рН до 7,3
4% параформальдегида (160 мл)
32% параформальдегид (два флаконах по 10 мл)
8 мл 20 X PBS
132 мл DDH 2 O
1 мл 5 М NaCl
2,5 мл 1 М MgCl 2
5 мл 1 М Трис рН 9,5
250 мкл 20% Tween
41,25 мл DDH 2 O
Антитела решение (1 образец)
5,5 мкл порошок Ацетон
40 мкл PBT
0,8 мкл LS
0,1 мкл Anti-флуоресцеина-AP антител
2% LS (360 мкл на 1 образец)
7,2 мкл 100% LS
352,8 мкл PBT
1 X Danieau СМИ (1 л) ‡
11,6 мл 5 М NaCl
700 мкл 1 М KCl
400 мкл 1 М MgSO 4
600 мкл 1 М Ca (NO 3) 2
5 мл 1 М HEPES
DDH 2 O до 1 л
рН настроить до 7,6
‡ Danieau является идеальным решением соли для выращивания эмбрионов данио рерио dechorionated. Другие средства могут использоваться, если они изотонических растворов с проPerly осмолярности (~ 300 мосм для рыбок данио)
НБТ складе (1 мл)
50 мг нитротетразол синий
0,7 мл ангидрида диметил формамида
0,3 мл DDH 2 O
BCIP складе (1 мл)
50 мг 5-бром-4-хлор-3-индолил фосфат
1 мл ангидрида диметил формамида
NBT / BCIP развивающихся решения
1 мл буфера AP
4,5 мкл складе НБТ
3,5 мкл складе BCIP
Ацетон порошок
- Выберите 20 взрослых рыб и заморозить их в жидком азоте.
- Измельчить мороженой рыбы с помощью ступки и пестика в порошок.
- Передача рыбы порошка в 50 мл коническую трубку.
- Заполните коническую трубку с 100% ацетона. Вихревые трубки.
- Спиновые трубки при макс оборотов в минуту в течение 10 мин. Удалите супернатант.
- Вымойте гранул другого 3 раза в 100% ацетоне и вращать трубу при макс оборотов в минуту в течение 10 мин. СиУ последней промывки супернатант должны появиться ясно.
- Добавить 100% ацетона в осадок снова, и пусть трубы выдерживают при комнатной температуре. Более плотные частицы осядут, в то время как более мелкие частицы остаются во взвешенном состоянии.
- Слейте мелких частиц в новую пробирку. Аликвотировать порошок решения на отдельные трубы и хранить их при температуре -20 ° C.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим J. Chen за предоставление в клетке флуоресцеина-декстран синтеза протокол. Это исследование было поддержано марта Dimes награду 5-FY09-78, Американская Ассоциация Сердца награду 09BGIA2090075, и NIH / NHLBI награду HL107369 R01-01 SS отдельное спасибо C. Клоссон за микроскопии помощи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 | |
| 10 kDa Aminodextran | Invitrogen | D1860 | |
| Zeba Desalt Spin Column | Pierce, Thermo Scientific | 89889 | |
| Low melting agarose | Amresco | 0815-100G | |
| Sodium Borate | Amresco | 1131117-100G | |
| Tricaine Methylsulfonate/ MS222 | Research Organics | 1347A | |
| Anti-fluorescein-AP | Roche Group | 11376622 | |
| Blocking buffer | Roche Group | 11 096 176 001 | |
| Maleic Acid | Sigma-Aldrich | MO375-500G | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| NBT | Sigma-Aldrich | I8377-250mg | |
| BCIP | Fisher Scientific | PI-34040 | |
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-2000 | |
| LabTek chambered coverglass slides | Nalge Nunc international | 155380 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Lamb serum | Invitrogen | 16070096 | |
| LSM 510 META NLO | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 20X 0.8 NA Air apochromatic objective | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Transparent yellow filter | Theatre House Inc. | Roscolux filter sheet Color: 312 |
References
- Mathur, J. mEosFP-based green-to-red photoconvertible subcellular probes for plants. Plant physiology. 154, 1573-1587 Forthcoming.
- Wiedenmann, J. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 15905-15910 (2004).
- Subach, F. V. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature. 6, 153-159 (2009).
- Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nature protocols. 1, 960-967 (2006).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
- Watanabe, W. Single-organelle tracking by two-photon conversion. Optics express. 15, 2490-2498 (2007).
- Warga, R. M., Kane, D. A., Ho, R. K. Fate mapping embryonic blood in zebrafish: multi- and unipotential lineages are segregated at gastrulation. Developmental cell. 16, 744-755 (2009).
- Chudakov, D. M. Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nature. 21, 191-194 (2003).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PloS ONE. 3, e3944-e3944 (2008).
- Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC developmental biology. 9, 49-49 (2009).
- Stark, D. A., Kulesa, P. M. An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model. Dev Dyn. 236, 1583-1594 (2007).
- Zhong, T. P., Childs, S., Leu, J. P., Fishman, M. C. Gridlock signalling pathway fashions the first embryonic artery. Nature. 414, 216-220 (2001).
- Vogeli, K. M., Jin, S. W., Martin, G. R., Stainier, D. Y. A common progenitor for haematopoietic and endothelial lineages in the zebrafish gastrula. Nature. 443, 337-339 (2006).
- Clanton, J. A., Shestopalov, I. A., Chen, J. K., Gamse, J. T. Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran. J. Vis. Exp. (50), e2672-e2672 (2011).
- Niemz, M. H. Laser-Tissue Interactions: Fundamentals and Applications. , Springer. (2003).
- Jowett, T. Analysis of protein and gene expression. Methods in cell biology. 59, 63-85 (1999).
