Summary
Nous démontrons une méthode simple pour placer les cellules à des endroits désirés sur un substrat. Cette méthode schémas cellules en retournant une puce de silicone contenant des micropuits remplis de cellules sur le substrat. Cette méthode offre une nouvelle façon de moduler la signalisation diffusibles et juxtacrine entre les cellules.
Abstract
Interactions cellule-cellule composée de signalisation diffusibles et contact cellule-cellule (juxtacrine signalisation) sont importants dans de nombreux processus biologiques tels que la croissance tumorale, la différenciation des cellules souches et de cellules souches auto-renouvellement. Un certain nombre de méthodes existent actuellement pour moduler la signalisation cellulaire in vitro. Une méthode de moduler le montant total de la signalisation diffusible est de faire varier la densité de semis de cellules pendant la culture. En raison de la nature aléatoire de l'ensemencement des cellules, cela se traduit par une variation considérable dans la cellule-cellule réelle d'espacement et la quantité de contact cellule-cellule, et ne peut pas prescrire de l'environnement local. Une approche plus spécifique pour la signalisation cellulaire modulant est d'utiliser des inhibiteurs moléculaires ou des approches génétiques pour abattre spécifiques des protéines de signalisation, mais ces deux méthodes sont les mieux adaptés à la manipulation de petits nombres de molécules. Ici, nous démontrons une nouvelle approche de la modulation des cellules de la signalisation cellulaire qui module l'environnement local d'un amas de cellules en plaçant des nombres différents de cellules à des endroits désirés sur un substrat. Cette méthode fournit un moyen complémentaire pour contrôler la signalisation locale diffusibles et juxtacrine entre les cellules. Notre méthode permet l'utilisation de la puce Bio Flip (BFC), une puce de silicone contenant des centaines microfabriqué à des milliers de micropuits, chacun dimensionné pour contenir soit une seule cellule ou un petit nombre de cellules. Nous charger la puce avec des cellules simplement en les pipetage sur le réseau de puits et le lavage des cellules déchargées du tableau. La puce est alors retourné sur un substrat, par lequel les cellules tombent du puits et sur le substrat, le maintien de leur structuration. Après que les cellules ont attaché, la puce peut être retiré (ou à gauche sur). Cette approche de la structuration cellulaire est unique en ce qu'il: 1) ne modifie pas la chimie du substrat, permettant ainsi aux cellules de proliférer et à migrer; 2) permet la structuration sur n'importe quel support, y compris la culture de tissus en polystyrène, verre, matrigel, et même chargeur de couches de cellules, et 3) est compatible avec l'impression par microcontact traditionnelle, permettant la création d'îles de la matrice extracellulaire des cellules placées à l'intérieur des îles. Dans cette vidéo, nous démontrons la structuration des cellules souches embryonnaires de souris sur la culture de tissus en polystyrène en utilisant la CBF.
Protocol
Faire un CBF
BFC sont réalisés par moulage polydiméthylsiloxane (PDMS) sur une 4 "plaquette master silicium.
Faire une plaquette master
- Commencez par déshydratation les plaquettes de Si pendant 30 min à 130 ° C.
- Placer la galette sur un spin-coucheuse, versez SU8-2050 (Microchem) sur la tranche, d'une rampe de 300 rpm / s à 3000-4000 rpm, et de spin pendant 30 s pour obtenir la hauteur caractéristique de 40-30 mm, respectivement.
- Après le filage, placer la galette sur une plaque de cuisson à 65 ° C, immédiatement montée en puissance de la température à 95 ° C pendant 5-6 min, puis il rampe à 65 ° C.
- Exposer les gaufrettes à une dose d'UV de 200 mJ / cm 2 sur un aligneur de contact à l'aide d'un masque en champ sombre.
- Placer les tranches sur une plaque de cuisson à 65 ° C, immédiatement montée en puissance de la température à 95 ° C pendant 4-5 min, puis il rampe à 65 ° C.
- Développer les plaquettes dans l'acétate de PM et d'isopropanol.
- Silaniser les plaquettes pendant 30 min à l'aide hexaméthyldisiloxane (Shin-Etsu MicroSi), ou (tridécafluoro-1 ,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane (t2492-KG, Spécialités UCT, Bristol, PA), pour éviter de PDMS adhérant à la tranche principale de silicium.
Moulage puces
- Mélanger PDMS (Dow Corning, le Sylgard 184) dans un ratio de 10:1, le verser sur la plaquette master Si (~ 15 g par tranche), et laissez sécher durant la nuit à température ambiante.
- Peler les guérir PDMS hors la plaquette de Si et découper chaque puce en utilisant une lame de rasoir.
- Bond chaque puce d'une lame de microscope cm coupé 1x1 pour une manipulation facile.
Préparation de la BFC pour une utilisation
- Faire tremper la nuit dans du PBS BFC afin d'empêcher l'absorption du support dans le PDMS pendant l'expérience.
- Sécher les puces avec un Kimwipe (Kimtech Science).
- Mettre une goutte de 7,5% albumine sérique bovine (BSA) (~ 200 ml) sur la surface à motifs de la CBF, et puis le gratter avec un embout de pipette pour disperser la BSA et de supprimer toutes les bulles dans les puits.
- Laissez le BSA sur la surface BFC pour au moins 0,5 heures. Idéalement agiter la BSA toutes les 15 min pour empêcher la formation de croûtes.
- Pour monter la CBF dans un plat 35x10 mm EPTC (Falcon, 35 à 3001), couper les bords d'un plat à mi-chemin EPTC bas afin que les ¾ "clips liant (Office Depot) ira parfaitement sur le rebord plat pour serrer les puces et vaisselle ensemble.
- Coupez un joint entretoise (en forme de cadre avec des bords 20'20 mm extérieur, 15'15 bord mm intérieur, et de 250 à 500 mm d'épaisseur) à partir d'une feuille de PDMS (Specialty Products en silicone) ou de silicone d'autres, et l'appliquer à l'antenne en utilisant une pince à épiler.
Modélisation des cellules avec un BFC
- Stériliser le plat, joint, revêtu de BSA à puce, et 2 pinces pour reliure sous lumière UV pendant 1 minute.
- Aspirer le BSA et rincer la BFC deux fois avec 200 ml de PBS.
- Ajouter la gélatine à l'antenne EPTC couper si nécessaire pour votre lignée cellulaire. Sinon, mouiller la surface EPTC avec certains médias avant de l'appliquer à la puce (voir ci-dessous). Cela empêche la formation de bulles dans la chambre.
- Après aspiration du PBS, une pipette de 200 mL de la solution de la cellule (~ 1 × 10 6 cellules / ml) sur la surface BFC. Laissez les cellules se contenter de 5-10 min.
- Inclinez la CBF d'un coin à ~ 15 ° d'angle et lentement la pipette la solution de cellules avec une pipette de 200 ml. Ensuite, placez le plat BFC et ajouter 100 ml de PBS ou de médias vierges à l'angle CBF opposé. Rincer la BFC de cette manière une fois 2-4 supplémentaires, au besoin, pour effacer toutes les cellules de l'inter-régions bien.
- Pipeter 200 ml de support sur la surface à puce. Aspirer gélatine / médias de l'EPTC. Puis inverser le plat pré-mouillé et poussez lentement le haut BFC, dans le plat.
- Appliquer un liant clip de chacun, aux deux côtés de la chambre pour la sceller. Retirez les broches métalliques de la reliure des clips pour ce plat reste au niveau où capoté.
- Enfin, parcourir rapidement la configuration plus, tout en évitant tout mouvement inutile, et le placer dans l'incubateur.
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Discussion
Bien que le protocole et vidéo présentés ici décrivent en utilisant l'une BFC le modèle des cellules souches embryonnaires de souris (mESCs), BFC peuvent être utilisés pour motif de pratiquement n'importe quel type de cellule d'intérêt. Le seul changement on peut avoir besoin de faire est de modifier la taille des micropuits. Dans notre expérience, à utiliser la CBF pour les cellules de modèle unique d'un autre type de cellule, d'un diamètre et la hauteur micropuits égal à 10 microns de diamètre plus grand que la cellule fonctionne mieux seules.
BFC peut également être utilisé pour les cellules modèle sur d'autres substrats, y compris d'autres cellules, sans changements notables dans le protocole. Modélisation sur une couche de cellules existantes est un des avantages de l'approche plus traditionnelle des approches BFC patterning cellule puisque celltypes certains, y compris mESCs et les CES humains, ont besoin de cellules de soutien ou d'alimentation pour maintenir leur phénotype approprié dans la culture.
Une application de la CBF que nous poursuivons est d'utiliser la CBF pour enquêter sur la signalisation entre les cellules souches embryonnaires de souris. Par ensemencement des cellules individuelles dans des réseaux carrés avec des espacements de grille différents, nous moduler la vitesse à laquelle les molécules de signalisation sont échangés par les cellules. En faisant de grands puits (d'un diamètre de 40 microns), nous pouvons également recueillir un plus grand nombre (~ 2-10) des cellules à un endroit donné, localement modifier la densité cellulaire. En outre, nous pouvons placer un certain nombre de petits puits à proximité les uns aux autres, entraînant un modèle substrat où la densité des cellules locales est élevé par les cellules ne sont pas en contact. Dans ce mode, on peut moduler la signalisation indépendamment diffusibles et juxtacrine entre les cellules. Ayant cellules dans une grille rend également beaucoup plus facile de suivre les cellules sur plusieurs jours. Nous croyons que la facilité de structuration cellule avec la CBF encouragera d'autres chercheurs pour l'utiliser dans leurs études.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par NIH EB007278.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Silicon master mould | |||
| Tissue culture dishes | Falcon BD | 35-3001 | 35 mm |
| 3/4" binder clips | |||
| PBS | |||
| hexamethyldisiloxane | Shin-Etsu MicroSi | ||
| New Item | MicroChem Corp. | SU8-2050 | |
| PM acetate | |||
| Isopropanol | |||
| BSA | 7.5% Bovine Serum Albumin |
References
- Rosenthal, A., Macdonald, A., Voldman, J. Cell Patterning Chip for Controlling the Stem Cell Microenvironment. Biomaterials. 28, 3208-3216 (2007).
