Summary
Abbiamo dimostrato un metodo semplice per l'immissione delle cellule nelle posizioni desiderate su un substrato. Questo metodo di modelli di cellule lanciando un chip di silicone che contiene pozzetti pieni di cellule sul substrato. Questo metodo fornisce un nuovo metodo per modulare la segnalazione diffusibile e juxtacrine tra le cellule.
Abstract
Interazioni cellula-cellula composta di segnalazione diffondibile e cellula-cellula contatto (juxtacrine segnalazione) sono importanti in numerosi processi biologici come la crescita del tumore, la differenziazione delle cellule staminali e cellule staminali auto-rinnovamento. Un certo numero di metodi esistono attualmente per modulare segnalazione cellulare in vitro. Un metodo di modulare la quantità totale di segnalazione diffusibile è quello di variare la densità di semina delle cellule in coltura. A causa della natura casuale di semina delle cellule, questo si traduce in notevoli differenze nella effettiva cellula-cellula spaziatura e la quantità di contatto cellula-cellula, e non può prescrivere l'ambiente locale. Un approccio più specifico per la segnalazione cellulare modulare è quello di utilizzare gli inibitori molecolari o approcci genetici per abbattere specifiche proteine di segnalazione, ma entrambi questi metodi sono più adatti per la manipolazione di un piccolo numero di molecole. Qui, dimostriamo un nuovo approccio alla modulazione cellula-cellula di segnalazione che modula l'ambiente locale di un cluster di cellule mettendo un diverso numero di celle nelle posizioni desiderate su un substrato. Questo metodo fornisce un modo complementare per controllare la segnalazione locale diffusibile e juxtacrine tra le cellule. Il nostro metodo si avvale della Bio Chip Flip (BFC), un chip di silicone microfabbricazione contenente centinaia a migliaia di pozzetti, ciascuno di dimensioni a detenere un singola cella o un piccolo numero di cellule. Carichiamo il chip con le cellule semplicemente pipettando loro sulla serie di pozzi e di lavaggio delle cellule scaricato fuori l'array. Il chip viene poi girato su un substrato, per cui le cellule caduta dalle fonti e sul substrato, mantenendo la loro patterning. Dopo che le cellule hanno attaccato, il chip può essere rimosso (o sinistra). Questo approccio alla patterning cellulare è unico in quanto: 1) non altera la chimica del substrato, permettendo così alle cellule di proliferare e migrare, 2) permette di patterning su qualsiasi supporto, compreso il tessuto-cultura polistirolo, vetro, Matrigel, e anche alimentatore strati di cellule, e 3) è compatibile con stampa microcontact tradizionali, permettendo la creazione di isole matrice extracellulare con cellule poste all'interno quelle isole. In questo video, dimostriamo il modello delle cellule staminali embrionali di topo sul tessuto-cultura polistirolo utilizzando il BFC.
Protocol
Fare un BFC
BFCs sono realizzati per stampaggio polidimetilsilossano (PDMS) su un "4 wafer di silicio maestro.
Fare un wafer maestro
- Inizia la disidratazione wafer silicio per 30 minuti a 130 ° C.
- Posizionare la cialda su uno spin-verniciatore, versare SU8-2050 (MicroChem) sul wafer, rampa da 300 giri / s di 3000-4000 giri al minuto, e far girare per 30 s per produrre altezze caratteristica di 40-30 mm, rispettivamente.
- Dopo la filatura, posizionare il wafer su una piastra a 65 ° C, immediatamente rampa fino alla temperatura di 95 ° C per 5-6 minuti, e poi rampa di discesa a 65 ° C.
- Esporre il wafer ad una dose UV di 200 mJ / cm 2 su un assetto contatto con un campo scuro maschera.
- Posizionare il wafer su una piastra a 65 ° C, immediatamente rampa fino alla temperatura di 95 ° C per 4-5 minuti, e poi rampa di discesa a 65 ° C.
- Sviluppare le cialde in acetato PM e isopropanolo.
- Silanize le cialde per 30 minuti utilizzando esametildisilossano (Shin-Etsu MicroSi), oppure (Tridecafluoro-1 ,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-triclorosilano (t2492-KG, Specialità UCT, Bristol, PA), per evitare di PDMS aderendo alla wafer maestro Si.
Stampaggio chip
- Mix PDMS (Dow Corning, Sylgard 184) in un rapporto di 10:1, versatelo sopra il wafer di silicio maestro (~ 15 g per wafer), e lasciarlo curare tutta la notte a temperatura ambiente.
- Sbucciare le PDMS curato fuori dal wafer di Si e tagliare ogni chip con una lama di rasoio.
- Legame ogni chip ad un vetrino da microscopio 1x1 centimetri taglio per una facile movimentazione.
Preparazione del BFC per l'uso
- Mettere a bagno durante la notte BFC in PBS al fine di prevenire l'assorbimento del supporto nella PDMS durante l'esperimento.
- Asciugare il chip con un Kimwipe (Kimtech Scienza).
- Mettere una goccia di 7,5% di albumina sierica bovina (BSA) (~ 200 mL) sulla superficie modellata del BFC, e poi raschiare con un puntale per disperdere la BSA ed eliminare eventuali bolle dai pozzetti.
- Lasciare la BSA sulla superficie BFC per almeno 0,5 ore. Idealmente agitare la BSA ogni 15 minuti per evitare formazione di croste.
- Per il montaggio del BFC all'interno di un piatto 35x10 millimetri TCPS (Falcon, 35-3001), tagliare i cerchioni di un modo TCPS mezzo piatto in modo che la ¾ "clip legante (Office Depot) si adatta sopra il bordo piatto per il bloccaggio del chip e piatto insieme.
- Tagliare una guarnizione distanziale (struttura a forma di 20'20 con bordo esterno millimetri, 15'15 millimetri bordo interno, e 250-500 mm di spessore) da un foglio di PDMS (Prodotti speciali in silicone) o silicone, e applicarlo al piatto con delle pinzette.
Cellule patterning con un BFC
- Sterilizzare il piatto, la guarnizione, BSA rivestite chip, e 2 clip legante ai raggi UV per 1 minuto.
- Aspirare la BSA e risciacquare il BFC due volte con 200 ml di PBS.
- Aggiungere la gelatina al piatto TCPS taglio, se necessario per il vostro cellulare-line. In caso contrario, bagnare la superficie TCPS con alcuni mezzi di comunicazione prima di applicarlo al chip (vedi sotto). Questo impedisce la formazione di bolle nella camera.
- Dopo aspirare il PBS, pipetta 200 ml di soluzione delle cellule (~ 1 × 10 6 cellule / ml) sulla superficie BFC. Lasciate che le cellule accontentarsi di 5-10 min.
- Inclinare il BFC a un angolo ad un angolo di circa 15 ° e lentamente pipetta la soluzione di cellule con una pipetta 200 ml. Poi, posizionare il piatto BFC e aggiungere 100 ml di PBS o supporti vergini fino all'angolo opposto BFC. Sciacquare il BFC in questo modo un ulteriore 2-4 volte, se necessario, per eliminare tutte le cellule dalla inter-e regioni.
- Pipettare 200 ml di media sulla superficie del chip. Aspirare gelatina / supporto dal TCPS. Poi invertire la pre-bagnato piatto e spingere lentamente l'alto BFC, nel piatto.
- Applicare un legante clip di ciascuno, ai due lati della camera per sigillarla. Togliere le punte di metallo dalle clip legante in modo che resti piatto livello quando capovolto.
- Infine, capovolgere rapidamente la configurazione sopra evitando movimenti inutili, e metterlo in incubatrice.
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Discussion
Anche se il protocollo e il video qui descritto l'utilizzo della BFC 1 a modello le cellule staminali embrionali di topo (mESCs), BFCs può essere usato per modello praticamente qualunque tipo di cellule di interesse. L'unico cambiamento che si possano desiderare di fare è quella di modificare la dimensione dei pozzetti. Nella nostra esperienza, per usare il BFC alle cellule singolo modello di un altro tipo di cellula, un diametro di pozzetti ed altezza pari a 10 micron superiore al diametro delle cellule distaccato funziona meglio.
BFCs può essere utilizzato anche per le cellule modello su altri substrati, tra le altre cellule, senza cambiamenti significativi nel protocollo. Patterning su un strato di cellule già esistenti è uno dei vantaggi dell'approccio BFC rispetto agli approcci tradizionali di patterning cellulare dal celltypes alcuni, tra cui mESCs e CES umane, richiedono cellule di supporto o alimentatore per mantenere il loro fenotipo proprio nella cultura.
Un'applicazione del BFC che stiamo perseguendo è quello di utilizzare il BFC per indagare i segnali tra le cellule staminali embrionali di topo. Da semina singole cellule in reticoli quadrati con spaziature della griglia differenti, modulare il tasso a cui vengono scambiati molecole di segnalazione da parte delle cellule. Rendendo più grandi pozzi (con un diametro di 40 micron), possiamo anche raccogliere un numero maggiore (~ 2-10) cellule in un determinato luogo, a livello locale alterando densità cellulare. Inoltre, possiamo mettere una serie di piccoli pozzi in prossimità di ogni altro, con un conseguente modello substrato dove la densità delle cellule locali è alta da parte delle cellule non sono in contatto. In questo modo, siamo in grado di modulare in modo indipendente segnalazione diffusibile e juxtacrine tra le cellule. Avendo le celle di una griglia rende anche molto più facile tenere traccia delle cellule più giorni. Siamo convinti che la facilità di patterning cella con il BFC incoraggerà altri ricercatori ad usarlo nei loro studi.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere EB007278.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Silicon master mould | |||
| Tissue culture dishes | Falcon BD | 35-3001 | 35 mm |
| 3/4" binder clips | |||
| PBS | |||
| hexamethyldisiloxane | Shin-Etsu MicroSi | ||
| New Item | MicroChem Corp. | SU8-2050 | |
| PM acetate | |||
| Isopropanol | |||
| BSA | 7.5% Bovine Serum Albumin |
References
- Rosenthal, A., Macdonald, A., Voldman, J. Cell Patterning Chip for Controlling the Stem Cell Microenvironment. Biomaterials. 28, 3208-3216 (2007).
