Los patrones de las células madre embrionarias usando el Flip Chip Bio

Summary

Demostramos un método sencillo para colocar las células en los puntos deseados en un substrato. Este método de los patrones de las células al lanzar un chip de silicona que contiene micropocillos llena de células en el sustrato. Este método ofrece una nueva forma de modular la señalización difusibles y juxtacrine entre las células.

Abstract

Interacciones célula-célula que consiste en la señalización difusibles y contacto célula-célula (juxtacrine señalización) son importantes en numerosos procesos biológicos como el crecimiento del tumor, la diferenciación de células madre y células madre de la auto-renovación. Una serie de métodos existen actualmente para modular la señalización celular in vitro. Uno de los métodos de la modulación de la cantidad total de la señalización difusibles es variar la densidad de siembra de células durante el cultivo. Debido a la naturaleza aleatoria de la siembra de células, esto se traduce en una variación considerable en la actual célula-célula y la cantidad de espacio de contacto entre células, y no puede prescribir el medio ambiente local. Un enfoque más específico para la modulación de la señalización celular es el uso de inhibidores moleculares o métodos genéticos para derribar a proteínas específicas de señalización, pero ambos de estos métodos son más adecuados para la manipulación de un pequeño número de moléculas. En este caso, se demuestra un nuevo enfoque para la modulación de las células de señalización celular que modula el ambiente local de un grupo de células mediante la colocación de diferentes números de células a los lugares deseados sobre un sustrato. Este método proporciona una forma complementaria para controlar la señalización local difusible y juxtacrine entre las células. Nuestro método se basa en el chip de Bio Flip (BFC), un chip de silicona que contienen cientos microfabricated a miles de micropocillos cada tamaño a suscribir una sola celda o un pequeño número de células. Cargamos el chip con las células simplemente pipeteando ellos en la matriz de los pozos y el lavado de las células sin carga fuera de la matriz. El chip es luego volcó sobre un sustrato, por el cual las células se caen de los pozos y en el sustrato, el mantenimiento de su patrón. Después las células se han unido, el chip se puede quitar (o la izquierda en). Este enfoque de modelado celular es único, ya que: 1) no altera la química del sustrato, lo que permite a las células proliferan y migran, 2) permite a los patrones en cualquier soporte, incluidos los de poliestireno de cultivo de tejidos, vidrio, matrigel, y incluso alimentación capas de células, y 3) es compatible con la impresión de microcontacto tradicionales, permitiendo la creación de islas de la matriz extracelular con células coloca dentro de las islas. En este vídeo, se demuestra el patrón de las células madre embrionarias de ratón en poliestireno de cultivo de tejidos con la BFC.

Protocol

Hacer una BFC

BFC son hechas por moldeo polidimetilsiloxano (PDMS) en un 4 "oblea de silicio maestro.

Hacer una oblea de maestro

1. Comience por la deshidratación de la obleas de silicio durante 30 minutos a 130 ° C.
2. Lugar de la oblea en un spin-aplicador, vierta SU8-2050 (Microchem) sobre la oblea, rampa de 300 rpm / s de 3000-4000 rpm, y el giro de 30 s para obtener la altura característica de 40-30 mm, respectivamente.
3. Después de girar, el lugar de la oblea en una placa 65 ° C, inmediatamente rampa encima de la temperatura a 95 ° C durante 5-6 minutos, y luego la rampa de bajada a 65 ° C.
4. Exponer las obleas a una dosis UV de 200 mJ / cm ² en un alineador de contacto usando una máscara de campo oscuro.
5. Coloque las galletas en una placa de 65 ° C, inmediatamente rampa encima de la temperatura a 95 ° C durante 4-5 minutos, y luego la rampa de bajada a 65 ° C.
6. Desarrollar las obleas en acetato de PM y el isopropanol.
7. Silanizar las obleas durante 30 minutos utilizando hexametildisiloxano (Shin-Etsu MicroSi), o (tridecafluoro-1 ,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-triclorosilano (t2492-KG, Especialidades UCT, Bristol, PA), para evitar que a partir de PDMS la adhesión a la oblea de Si señor.

Chips de moldeo

1. Mezcla de PDMS (Dow Corning, Sylgard 184) en una proporción de 10:1, se vierte sobre la oblea maestro Si (~ 15 g por oblea), y se deja secar toda la noche a temperatura ambiente.
2. Pelar el curado PDMS de la oblea de silicio y corte cada chip con una cuchilla de afeitar.
3. Vínculo cada chip a un portaobjetos de microscopio 1x1 cm de corte para un fácil manejo.

Preparación de la BFC para el uso

1. Remoje la noche a la mañana BFC en PBS con el fin de prevenir la absorción de los medios de comunicación en el PDMS durante el experimento.
2. Seque los chips con un Kimwipe (KIMTECH Science).
3. Ponga una gota de 7,5% albúmina de suero bovino (BSA) (~ 200 ml) en la superficie de estampado de la BFC, y luego raspar con una punta de pipeta para dispersar a la BSA y eliminar las burbujas de los pozos.
4. Salir de la BSA sobre la superficie del BFC, por lo menos 0,5 horas. Lo ideal sería que agitan la BSA cada 15 minutos para evitar la formación de costras.
5. Para adaptarse a la BFC dentro de un plato de 35x10 mm TCPS (Falcon, 35-3.001), corte los bordes de una manera medio plato TCPS abajo para que el ¾ "clips de la carpeta (Office Depot) caben sobre el borde plato para sujetar el chip y plato juntos.
6. Cortar una junta de separador (en forma de marco con el borde exterior de 20'20 mm, borde interno 15'15 mm y 250-500 mm de espesor) de una hoja de PDMS (Productos Especiales de silicona) o cualquier otra de silicona, y aplicarlo a la antena con unas pinzas.

Células con un patrón de BFC

1. Esterilizar el plato, la junta, chip recubierto de BSA, y dos clips de la carpeta a la luz ultravioleta durante 1 minuto.
2. Aspirar a la BSA y enjuague el BFC dos veces con 200 ml de PBS.
3. Añadir la gelatina al plato TCPS corte si es necesario para su línea celular. De lo contrario, humedecer la superficie TCPS con algunos medios de comunicación antes de aplicarlo en el chip (ver más abajo). Esto evita que se formen burbujas en la cámara.
4. Después de aspirar el PBS, una pipeta 200 ml de solución de células (~ 1 × 10 ⁶ células / ml) sobre la superficie del BFC. Vamos a colocar las células durante 5-10 minutos.
5. La inclinación de la BFC a una esquina en un ángulo de ~ 15 ° y lentamente la pipeta la solución de células con una pipeta de 200 ml. Luego, coloque el piso BFC y añadir 100 ml de PBS o medio vacío en la esquina opuesta BFC. Enjuague el BFC de esta manera un adicional de 2.4 veces, según sea necesario, para eliminar todas las células de las regiones entre bien.
6. Pipeta 200 ml de los medios de comunicación en la superficie del chip. Aspirar la gelatina / media de los TCPS. Luego invierta el plato previamente mojado y empuje lentamente hasta la BFC, en el plato.
7. Aplicar una carpeta de clip de cada uno, a dos lados de la cámara para sellarlo. Quitar las púas de metal de los clips de carpeta para que el plato se mantiene el nivel cuando se volcó.
8. Por último, rápidamente la vuelta al la instalación a través, evitando cualquier movimiento innecesario, y lo coloca en la incubadora.

Discussion

Aunque el protocolo y el video se muestra aquí se describe el uso de la BFC ^un patrón de células madre embrionarias de ratón (mESCs), BFC se puede utilizar para patrón de prácticamente cualquier tipo de célula de interés. El único cambio que uno puede necesitar hacer es cambiar el tamaño de las cúpulas. En nuestra experiencia, para utilizar el BFC a las células de un patrón único de otro tipo de células, un diámetro de micropocillos y altura igual a 10 micrones mayor que el diámetro de la celda libre que funciona mejor.

BFC también se puede utilizar a las células de patrón en otros sustratos, incluyendo otras células, sin cambios significativos en el protocolo. Patrones en una capa de células existentes es una de las ventajas del enfoque de BFC sobre los enfoques tradicionales de la célula patrón desde celltypes ciertas, incluyendo mESCs y humanos CES, requieren de las células de soporte o de alimentación para mantener su fenotipo propio de la cultura.

Una aplicación de la BFC que estamos llevando a cabo es el uso de la BFC para investigar la señalización entre las células madre embrionarias de ratón. Por la siembra de células individuales en redes cuadradas con distancia modular diferentes, modulan la velocidad a la que las moléculas de señalización que se intercambian por las células. Al hacer los pozos más grandes (con un diámetro de 40 micras), también puede recoger un mayor número (~ 2.10), las células en un determinado lugar, a nivel local alterando la densidad celular. Además, podemos colocar una serie de pequeños pozos en las proximidades de uno al otro, lo que resulta en un patrón de sustrato donde la densidad celular local es alto por las células no están en contacto. De esta manera, se puede modular de forma independiente de señalización difusibles y juxtacrine entre las células. Tener células en una cuadrícula también hace que sea mucho más fácil de rastrear las células durante varios días. Creemos que la facilidad de los patrones de células con el BFC animará a otros investigadores para usarla en sus estudios.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
Silicon master mould
Tissue culture dishes	Falcon BD	35-3001	35 mm
3/4" binder clips
PBS
hexamethyldisiloxane	Shin-Etsu MicroSi
New Item	MicroChem Corp.	SU8-2050
PM acetate
Isopropanol
BSA			7.5% Bovine Serum Albumin