Lensless fluorescentie microscopie op een chip

Summary

Een lensless on-chip fluorescentie microscopie platform is aangetoond dat kan afbeelding fluorescerende voorwerpen over een ultra-breed-of-view van bijvoorbeeld,> 0,6-8 cm2 met <4μm resolutie met behulp van een steekproef op basis van compressie-algoritme decodering. Zo'n compacte en wide-field fluorescerende on-chip beeldvormende modaliteit kan waardevol zijn voor high-throughput cytometrie, zeldzame-cel onderzoek en microarray-analyse.

Abstract

On-chip lensless beeldvorming in het algemeen gericht op omvangrijke lens geïntegreerde optische microscopen te vervangen door eenvoudiger en meer compacte ontwerpen, vooral voor high-throughput screening toepassingen. Deze opkomende technologie platform heeft het potentieel om de noodzaak van omvangrijke en / of kostbare optische elementen met de hulp van nieuwe theorieën en digitale reconstructie algoritmen te elimineren. In dezelfde lijn, hier tonen we aan een on-chip fluorescentie microscopie modaliteit die bijvoorbeeld <4μm ruimtelijke resolutie over een ultra-breed-of-view (FOV) van> kan 0,6-8 cm ² te bereiken zonder het gebruik van de lenzen , mechanische-scanning of dunne-film gebaseerd interferentie filters. In deze techniek wordt fluorescerende excitatie bereikt door middel van een prisma of bolrond-glas-interface verlicht door een onsamenhangend bron. Na interactie met het hele object volume, wordt deze excitatie licht verworpen door het totaal-interne-reflectie (TIR) ​​proces dat plaatsvindt aan de onderkant van het monster micro-vloeibare chip. De fluorescentie-emissie van de aangeslagen voorwerpen wordt dan verzameld door een fiber-optische voorpaneel of een taper en wordt geleverd aan een opto-elektronische sensor array, zoals een charge-coupled-device (CCD). Door het gebruik van een compressie-sampling gebaseerde decodering algoritme, de verworven lensfree ruwe fluorescerende beelden van het monster snel kan worden verwerkt tot bijvoorbeeld opbrengst, <4μm resolutie over een beeldhoek van> 0,6 tot 8 cm ^2. Bovendien, verticaal gestapeld micro-kanalen die worden gescheiden door bijvoorbeeld, kan 50 tot 100 micrometer ook met succes worden afgebeeld met dezelfde lensfree on-chip microscopie platform, dat een verdere stijging van de totale doorvoer van deze modaliteit. Deze compacte on-chip fluorescerende beeldvorming platform, met een snelle druk-decoder achter de rug, kan nogal waardevol zijn voor high-throughput cytometrie, zeldzame-cel onderzoek en microarray-analyse.

Protocol

In deze sectie zullen we de experimentele methoden van onze lensless on-chip fluorescentie microscopie platform ^1-4. Om aan te tonen de mogelijkheden van deze techniek, zullen we laten zien on-chip imaging resultaten voor TL-micro-deeltjes en gelabeld witte bloedcellen. Hoewel het hier niet besproken, kan dezelfde lensfree fluorescentie microscopie platform ook gebruikt worden om de afbeelding klein model dieren zoals transgene C. elegans monsters ^3.

1. Ontwerp van de Lensless On-Chip Imaging Platform

Onze lensless on-chip imaging platform bestaat uit verschillende optische componenten, waaronder een digitale sensor array (bijvoorbeeld een CCD-chip), een onsamenhangende verlichting bron, een prisma, een absorptie filter, een glasvezel-voorpaneel of een glasvezel-afbouw. Zoals weergegeven in figuur 1, zijn deze onderdelen gemonteerd met micro-fluïduminrichtingen tot fluorescerende beeldvorming van een grote steekproef volume op een chip te bereiken, zonder het gebruik van de lenzen, mechanische scanners of dunne-film gebaseerd interferentie filters.

1. Digitale Sensor Array: Onze lensless imaging configuratie maakt gebruik van een opto-elektronische sensor array om de fluorescentie-emissie te nemen van target micro-objecten. In dit platform, voor de detectie van het fluorescentie-signaal, kunnen verschillende types van de sensor-arrays worden gebruikt, zoals CCD's (bv modellen: KAF-8300, KAI-11002, KAF-39000, allen uit KODAK) en complementaire metaal-oxide -halfgeleider imagers (CMOS, bijvoorbeeld, Model: MT9T031C12STCD, van Micron Technologies). De belangrijkste parameters die van belang voor deze sensor-arrays zijn de pixelgrootte (bijvoorbeeld 5,4 micrometer, 9 um, um 6,8 en 3,2 micrometer voor de KAF-8300, KAI-11002, KAF-39000 en MT9T031C12STCD, respectievelijk) en de actieve beeldvorming gebied ( bijvoorbeeld 2,4 cm ^2, 8 cm ^2, 18 cm ² en 32 mm ² voor KAF-8300, KAI-11002, KAF-39000 en MT9T031C12STCD, respectievelijk). Voor lensfree on-chip beeldvorming, kan CCD-sensoren in het algemeen de voorkeur aan een hogere doorvoer (breder actief gebied) en een betere gevoeligheid te bereiken, terwijl de CMOS-sensoren kan de voorkeur voor relatief goedkoper en lichter gewicht ontwerpen (bijvoorbeeld voor gebruik in het veld).
2. Lichtbronnen: In ons platform, een onsamenhangend lichtbron, bijvoorbeeld een eenvoudige light-emitting diode (LED, bijvoorbeeld van Thorlabs, M455L2-C2 en LEDD1B), kan worden gebruikt voor fluorescentie excitatie. In de experimentele set-up getoond in Fig. 1, een multi-mode fiber-optische kabel (Thorlabs, BFH37-1000) met 1 mm kern afmeting is butt-gekoppeld aan een LED-bron (zonder het gebruik van de lenzen of koppeling optica) en de excitatie licht wordt vervolgens geleverd aan de monster volume via de uitgang opening van deze vezel. In dit systeem moet het gewenste vermogen van de fluorescentie excitatie rond ~ 0,2-5 mW voor een FOV van> 2-8 cm ² bij de uitgang van de verlichting vezel, maar de LED's moeten in staat zijn om output ~ 5 mW-1W energieniveaus, de butt-koppeling aanpak is aanzienlijk lossy die de excitatie kracht afneemt aan de uitgang van de vezel. Om dit te bereiken excitatie van verschillende kleurstoffen, kunnen verschillende kleuren LED's ook worden gemultiplext met behulp van een fiber-optische koppeling.
   Naast de on-chip fluorescerende beeldvorming, kan lensfree holografische beelden overdracht van hetzelfde monster ook verkregen worden met dit platform door gebruik te maken van een verticale verlichting bron zoals geïllustreerd in Fig. 2. In tegenstelling tot de fluorescentie excitatie vezels, voor het holografisch beeld acquisitie, een ander glasvezelkabel met een kleinere kern omvang (bijvoorbeeld ~ 50 tot 400 micrometer) is kont gekoppeld aan een andere LED-bron (Mightex, FCS-0625-000). Deze verticale verlichting licht, na het verlaten van de vezel-end, begint te verwerven gedeeltelijke ruimtelijke samenhang als het plant zich voort in de richting van het monster. De diameter van dit ruimtelijk samenhangend gebied is evenredig met de afstand die het licht reist en is omgekeerd evenredig met de uitgang openingen van de vezel. Zolang deze ruimtelijke samenhang diameter aan het monster vliegtuig is groter dan de diffractie grootte van elk monster bij de sensor vliegtuig, kan het verstrooide licht van elk object trouw bemoeien met de achtergrond verlichting, het creëren van een lensfree in-line hologram van het monster. Deze verworven lensfree hologrammen kan dan worden snel verwerkt met behulp van fase herstel aanpak iteratief naar een transmissie-bright-field beeld van het monster volume ^5-7 te reconstrueren. Voor deze holografische verlichting einde, een langere golflengte LED (dat wil zeggen, ~ 625-700 nm) is geselecteerd, omdat de absorptie filters die gebruikt worden om het excitatie licht blok zijn high-pass filters met typische cut-off golflengte van bijvoorbeeld 500-600 nm , die het mogelijk maakt overname van transmissie-in-lijn hologrammen van de monsters, zonder een probleem.
3. Andere optische componenten: In deze on-chip fluorescentie microscopie platform, twee verschillende excitatie filtering methodes worden gebruikt in parallel aan het vereiste dark-field achtergrond te creëren zoals weergegeven in figuur 2. Eerste, een glazen prisma (bv, EdmundOptica, ruitvormige of duif prisma's) of een glas hemi-sfeer wordt gebruikt voor het totaal-interne reflectie (voor de excitatie licht) te creëren aan de onderkant van de micro-vloeibare chip die de monsters van belang hosts. Parallel aan deze, is een goedkoop absorptie filter (bijvoorbeeld van Roscolux) gebruikt te verwijderen van de zwak verstrooid excitatielicht die niet gehoorzamen aan de TIR-proces. Na een succesvolle afwijzing van de excitatie gebruik van deze twee mechanismen, wordt alleen de fluorescentie-emissie van de monsters verkregen op de detector vliegtuig. Merk hier op dat een bepaalde fractie van de uitgezonden fluorescerende signaal ook TIR ervaringen bij dezelfde interface. Echter, dit slechts beperkt de detectie numerieke apertuur van deze lensfree on-chip-imaging benadering tot ~ 1.0, zodanig dat alleen de schuine stralen boven een dergelijke hoge detectie-numerieke apertuur blijft gevangen in de micro-chip, terwijl de rest van de tl-stralen kan nog steeds raakte het actieve gebied van de sensor-array te bemonsteren door zijn pixels.
   Ondanks deze een grote detectie numerieke apertuur, de ruwe fluorescerende vlekken op de sensor-array worden vrij breed (bijvoorbeeld ~ 150 tot 200 micrometer), omdat fluorescentie-emissie is niet richtingsgevoelig en dus snel divergeert. Om ingenieur en een betere controle van de ruimtelijke verspreiding van deze fluorescent signaal in onze lensless platform, hebben we gebruik gemaakt van een planaire optische component, dat wil zeggen, een glasvezel-voorpaneel (bijv. Edmund Optics, NT55-142), dat wordt geplaatst tussen het object en de sensor vliegtuigen. Een glasvezel-voorplaat is samengesteld uit een 2D-array van glasvezelkabels die optische intensiteit van informatie van de ene kant van het apparaat naar het andere. De belangrijkste functie in onze lensfree on-chip microscopie set-up is te koppelen van de vrije ruimte modi van de fluorescentie-emissie van het monster volume in begeleide optische golven reizen zonder ruimtelijke spreiding binnen elke vezel, die gedeeltelijk kan een beperking van de lensfree tl-punt -spread functie (PSF) tussen het object en de detector vliegtuigen. Deze verdere toename van onze signaal-ruisverhouding (SNR) als de ruimtelijke resolutie die kan worden bereikt met behulp van onze lensless platform.
   Als alternatief voor een gewone faceplate, kunnen we ook gebruiken in onze on-chip-imaging platform een ​​"taps toelopende 'fiber-optic voorkant, die een veel grotere dichtheid van glasvezel-kabels op de top facet heeft ten opzichte van de onderste. Zo'n een taps toelopende faceplate niet alleen ons helpen om een ​​beter PSV, maar ook kan vergroting introduceren in ons platform (bijv.> 2-3x), die verder helpt ons om onze lensless resolutie te verbeteren naar bv, <4 micrometer. We moeten ook rekening mee dat het gebied-van-beeld van een dergelijke taps toelopend ontwerp wordt verminderd met op zijn minst het kwadraat van de geïntroduceerde vergrotingsfactor in vergelijking met een gewone faceplate op basis van imaging systeem, dat een vermindering van bijvoorbeeld kunnen vormen, van ~ 8 cm ² FOV in eerste instantie (CCD: KAI-11002) omlaag tot <2 cm ² met de afbouw.
   Ten slotte moeten we ook rekening mee dat het gebruik van een glasvezel-voorpaneel of een afbouwen van de lensfree hologrammen van de steekproef als gevolg van verschillende optische modi van de glasvezel-serie ³ vervormt. Hoewel dergelijke vervormde lensfree patronen op de detector-array kan nog steeds nuttig zijn voor bepaalde cytometrie relatie toepassingen, voor holografische reconstructie van transmissie-beelden, de glasvezel-array (bijvoorbeeld het voorpaneel of de conus) moet worden verwijderd uit de on-chip assemblage ten koste van iets lagere ruimtelijke resolutie in de TL-mode ^3.
4. Micro-fluïde Chips: De micro-vloeibare chips die worden gebruikt in ons platform zijn vervaardigd met behulp van PDMS (Polydimethylsiloxaan) wanden geplaatst op glasplaatjes het maken van de micro-kanalen die nodig zijn voor on-chip imaging. Te fabriceren deze micro-vloeibare kanalen streven wij het volgende recept:
   1. PDMS A-en B-elastomeren zijn uniform gemengd en geroerd met 1:10 volume verhouding.
   2. Zodra deze heterogene oplossing wordt uitgegoten op een petrischaal, is het uitgehard bij 65 ° C gedurende 2 uur.
   3. Met behulp van een X-Acto mes, is de gewenste grootte en vorm van de micro-vloeibare kanaal muur uit de petrischaal.
   4. Het apparaat hechting wordt dan bereikt door het gebruik van een hoogfrequente plasma generator (Electro-Technic Products Inc, BD-10AS), die moet bloot te leggen zowel het dekglas dia's en PDMS verlijmen vlak.
   5. Na deze plasma behandeling, wordt het apparaat geplaatst in een oven voor ~ 40-50 minuten bij 70 ° C om de binding te versterken.
5. Montage en uitlijning van de lensless on-chip microscopie platform:
   De assemblage procedures voor onze lensfree on-chip imaging platform kan als:
   1. Afdekglas van de opto-elektronische sensor-array is verwijderd.
   2. Met behulp van een vacuüm pen (Edmund Optics, NT57-636), is een dunne absorptie filter voorzichtig geplaatst op de top van de detector actieve gebied.
   3. Een glasvezel-voorpaneel of een taper is geplaatst op de top van deze absorptie fIlter.
   4. De gefabriceerde micro-vloeibare chip wordt dan direct geplaatst op de top van de glasvezel-array.
   5. Een glazen prisma of een hemi-sfeer wordt gemonteerd boven de micro-vloeibare chip met behulp van een index-matching olie (Cargille, Immersion Oil 300-serie), zodanig dat de brekingsindex van de interface is afgestemd op het glas brekingsindex.
   6. Side verlichting vezel is dichter bij het prisma (of de hemi-sfeer) worden verplaatst en de hoek wordt aangepast om ervoor te zorgen dat de totale-interne reflectie vindt plaats op het glas-lucht-interface die overeenkomt met de onderkant van het micro-vloeibare-chip van de ondergrond. De verticale verlichting (voor lensfree transmissie imaging) is afgestemd op loodrecht op de detector-array en is gecentreerd om een ​​gewenst veld-of-view.
   7. Side en verticale licht-bronnen zijn opeenvolgend aan / uit om zowel de fluorescerende beeldvorming en bright-field imaging transmissie met behulp van dezelfde on-chip platform te bereiken.
   8. Lensfree RAW-beelden worden dan verkregen met behulp van een op maat ontwikkeld Labview-interface via een PC (bijv. 3,2 GHz processor, Intel Core).

2. Monstervoorbereiding

We gebruikten fluorescerende micro-kralen (bijv. Invitrogen, Fluospheres) om onze imaging platform te kalibreren, door het meten zijn lensfree het systeem point-spread-functie (PSF). Na deze eerste PSF meting wordt gedaan, kunnen verschillende cellen of klein model dieren (bijvoorbeeld transgene C. elegans monsters) worden afgebeeld met dezelfde on-chip platform.

Te beginnen met de volgende paragraaf, zullen wij meer informatie over onze monstervoorbereiding stappen.

1. Fluorescerende micro-parels:
   1. Raw TL-bead-oplossingen worden gecombineerd met DI-water om de concentratie van de monsters te optimaliseren.
   2. ~ 10 pi van TL-bead-oplossing wordt gemengd met 40 pi, 5 ml en 20 ml water voor DI 10 urn, 4 micrometer en 2 micrometer diameter kralen, respectievelijk. Heterogene oplossingen van verschillende kralen (bv. niet-fluorescerende en TL) worden bereid zo nodig door het mengen van verschillende kraal-oplossingen met elkaar.
   3. De uiteindelijke oplossing van het monster wordt vervolgens geïnjecteerd in de micro-vloeibare chip vanaf de zijkant PDMS muren met een scherp injectienaald (Fisher Scientific, BD PrecisionGlide Naalden, 14 tot 826-serie)
2. Witte bloedcellen de etikettering:
   1. Een volume van ~ 100 ul bloed wordt gemengd met ~ 1 ml rode bloedcellen lyseren buffer (eBioscience).
   2. Na incubatie gedurende ~ 3 min, de gelyseerd bloed oplossing wordt gecentrifugeerd en de pellet geresuspendeerd laag is in ~ 200 pi PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing).
   3. Om het etiket van de nucleïnezuur van de cellen met fluorescentie kleurstoffen, is 5 pi van 1mm SYTO 16 toegevoegd aan de 200 pi van resuspensie, waarna het monster wordt gedurende ~ 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
   4. Tweede centrifugeren wordt toegepast op dit label monster, voor zover het supernatant wordt verwijderd om het achtergrondgeluid als gevolg van fluorescentie-emissie van niet-gebonden kleurstoffen verminderen.
   5. Witte bloedcellen pellet laag wordt geresuspendeerd in PBS die vervolgens kan worden overgebracht naar een micro-vloeibare chip voor lensfree on-chip fluorescerende beeldvorming (zie bijvoorbeeld figuur 7).

3. Digitale verwerking van de verworven lensless fluorescerende beelden

In deze lensless imaging platform, zijn twee verschillende algoritmes gebruikt voor het digitaal verhoging van de resolutie van het systeem, namelijk het Lucy-Richardson deconvolutie en Druksterkte steekproeven op basis van decodering. Door het gebruik van deze digitale verwerkingsmethoden, we gekwantificeerd de resolutie verbetering die kan met elke benadering worden bereikt door het oplossen van dicht op elkaar gepakte bead-pairs (zie Fig. 5-6). De gereconstrueerde lensfree fluorescerende beelden kunnen vervolgens worden pseudocolored (indien gewenst) om de natuurlijke kleur van de micro-objecten, die zeker vereist voorkennis van het fluorescerende signaal golflengte te markeren, tenzij er een kleur (bijvoorbeeld, een RGB: rood-groen-blauw CCD / CMOS) sensor-chip wordt gebruikt. Voor deze digitale verwerkingsmethoden, zijn op maat ontwikkelde algoritmes gebruikt die slechts een CPU vereisen (bij voorbeeld, een 3,2 GHz processor, Intel Core). Potentieel zou next-generation graphics processing units (GPU's) ook gebruikt worden voor een snellere verwerking. Naast de beeldvorming, indien nodig, kan de gedecodeerde fluorescerende objecten ook automatisch worden geteld met behulp van een speciaal ontwikkelde interface (zie Fig. 8) voor on-chip cytometrie toepassingen.

1. Meting van het systeem Point-Spread Function (PSF):
   Voorafgaand aan elke digitale verwerking voor resolutie verbetering (zoals deconvolutie of druksterkte decodering), het onsamenhangende point-spread functie van de on-chip systeem moet worden geschat, die kan worden bereikt door het gemiddelde aantal gemeten lensfree fluorescerende patronen ontstaan ​​door geïsoleerde kleine fluorescerende kralen zich op een bepaalde hoogte van de sensor-chip. Dezeindividuele fluorescerende patronen worden vervolgens afgestemd met betrekking tot hun zwaartepunt coördinaten worden gemiddeld na een juiste intensiteit normalisatie ^1,2. Dit gemiddelde lensfree patroon kan dan gebruikt worden als de TL-point-spread functie van onze on-chip microscoop.
2. Lucy-Richardson Deconvolutie ^1: Om digitaal verbeteren van de ruimtelijke resolutie van ons platform, voeden we de ruwe verworven tl-beeld en de gemeten onsamenhangende point-spread functie in een versnelde Lucy-Richardson algoritme ^8-10. Door het toepassen van de Bayes 'theorema, de Lucy-Richardson algoritme maakt gebruik van het gemeten punt-spread functie iteratief verfijnen van de maximum-likelihood schatting van de fluorescentie bron distributie op het object vliegtuig ^8,9. De iteratie proces is meestal beëindigd na een paar honderd cycli voor de komst van geluid versterking om een ​​minimale vierkante fout tussen de geprojecteerde en de gemeten lensfree fluorescerende patronen te verzekeren. De convergentie van deze deconvolutie algoritme werd ook versneld door een vector extrapolatie methode om de rekentijd ¹⁰ verkorten. Om een idee te geven: dit algoritme zorgt voor een effectieve ruimtelijke resolutie van ~ 20 urn (met behulp van een CCD / CMOS-chip met een pixelgrootte van bijv. ~ 9μm) en kan een FOV van ~ 8 cm ² deconvolve binnen een paar tientallen minuten op een normale PC die draait Matlab ^1. Merk op dat dezelfde rekentijd daalt tot slechts een paar seconden voor bijvoorbeeld, ~ 1mm ² FOV die vergelijkbaar is met de beeldhoek van een typische 10x objectief.
3. Druksterkte bemonstering / detectie op basis van dunne-signaal decoderen ^2: Verdere verbetering resolutie (tot <4 micrometer) ⁴ kan worden bereikt door gebruik te maken Druksterkte Sensing / Sampling gebaseerd decoderingsalgoritmen ^11,12. Druksterkte Steekproeven / Sensing biedt een recent opkomende theoretisch kader ^13-15 dat tot doel heeft om te herstellen een schaars signaal van veel minder monsters dan dat nodig is volgens de sampling theorema. Terwijl in het algemeen, het signaal het herstel van onder de steekproef-metingen is een slecht gesteld probleem, voor een specifieke klasse van functies (namelijk voor sparse functies), de bekende sampling theorema en de weergave ervan basis is onlangs aangetoond om heel inefficiënt in termen van het aantal metingen die nodig zijn, dat wil zeggen, kan dezelfde schaarse signaal in het algemeen uniek worden verhaald op heel weinig monsters in vergelijking met de klassieke sampling theorie.
   Lensless fluorescerende beelden die door onze on-chip microscoop inherent aan een belangrijke eis van Druksterkte decoderen: Voor de toepassingen die van belang zijn voor dit werk, zoals wide-field tl-cytometrie, zeldzame cel analyse en high-throughput micro-array beeldvorming, fluorescerende objecten van belang kan beschouwd worden al schaars. Daarom is in onze lensless fluorescentie microscoop, kan het decoderen van de distributie en de relatieve sterkte van de tl-stralers gelegen aan het object vliegtuig worden gemodelleerd als een grootschalige l _{1-geregulariseerde} Least Squares probleem dat kan worden opgelost met behulp van bijvoorbeeld een interieur- punt methode ^2,12. Deze optimalisatie probleem kan wiskundig worden uitgedrukt als:
   
   waar | | u | | _k = (Σ _i ⁿ | u _i | ^{k) (1 / k)} en | | u | | _∞ = max _i | u _i |. Daarom hebben we een minimum te beperken l _{1-geregulariseerde} l _2-norm van het verschil tussen de opgenomen / gemeten (y) en de geschatte (Ax) lensfree beelden, waarbij x en A vormen de bron distributie worden gedecodeerd en de meting matrix gevormd met behulp van de experimentele PSF van het systeem, respectievelijk. We gebruiken ook een constraint functie dwingen de bron distributie op het object vliegtuig niet negatief zijn. Dit iteratieve druksterkte decodering proces eindigt wanneer de waarde van de kostenfunctie reikt tot een vooraf bepaalde tolerantie waarde. Regularisatie (β) en tolerantie parameters worden in het algemene functies van het object sparsity en het meten geluidsniveau, en zijn geoptimaliseerd in ons systeem te ~ en ~ βmax/10 0,01, respectievelijk.
   Op basis van de hierboven beschreven numerieke schema, druk-decodering van ruwe fluorescerende beelden verbetert ons platform in staat is om schaarse voorwerpen en vertoont een verwerkingssnelheid die vergelijkbaar zijn met Lucy-Richardson Deconvolutie ² op te lossen. Naast de beeldvorming een enkele laag, kan fluorescerende objecten die zich op verschillende diepten worden gedecodeerd en gescheiden van elkaar tegelijkertijd door dezelfde algoritme met alle PSFs overeenkomen met verschillende diepte lagen ^twee.
4. Pseudocoloring: Hoewel niet een fundamentele beperking, de gepresenteerde on-chip imaging platform maakt gebruik van monochrome meestal opto-elektronische sensor arrays die in het algemeen een betere signaal-ruisverhouding voor biologisch monster beeldvorming. Daarom worden de ruwe fluorescerende beelden die in grijstinten-formaat, dat niet bevat de echte kleur informatie van de monsters. Dit kan worden verzacht door het gebruik van kleur CCD / CMOS-chips in onze lensfree imaging architectuur zodanig dat 3 kleurkanalen (rood, groen en blauw) worden verworven in elk lensfree TL-meting. Aan de andere kant, als de etikettering kleurstof emissie-eigenschappen al bekend zijn, RAW-indeling grijstinten fluorescerende beelden van een monochrome sensor-chip en hun gedecodeerd / deconvoled versies kunnen ook kunstmatig worden geconverteerd naar kleur beelden met behulp van een pseudocoloring algoritme geïmplementeerd in bijvoorbeeld MATLAB. Voor dit doel, kan de verworven grijswaardenafbeeldingen worden uitgebreid naar 3-dimensionale data-cubes, waar elke kleur van belang kan worden gesynthetiseerd door gebruikmaking van passende wegingsfactoren bij elke pseudo-kanaal van de gegevens kubus. Als gevolg van deze verwerking kan monochrome lensfree fluorescerende beelden worden omgezet (indien gewenst) om multi-channel beelden die bekende kleur informatie van een bepaald fluorescerend object te bieden.
5. Geautomatiseerde fluorescerende cel tellen: Voor cytometrie toepassingen, we hebben ook een op maat ontworpen user interface (zie afbeelding 8.) Die automatisch kan rekenen van de fluorescerende voorwerpen / cellen op basis van hun lensfree beelden die met onze on-chip microscopie platform. In de richting van deze taak is in eerste instantie een zachte drempel toegepast op RAW-beelden lensfree om een ​​beperking van de potentiële locaties van fluorescerende voorwerpen. Vervolgens worden een reeks van functies (in het bijzonder regionprops) gebruikt om beeld eigenschappen van elke sub-regio van belang, zoals positie, ruimte, vorm en intensiteit te meten. Met behulp van deze data object, zijn binaire objecten ingedeeld in subgroepen, zoals cellen, dode pixels, maar ook stof-of achtergrond auto fluorescentie. Zodra het uiteindelijke resultaat van regionprops functie wordt gefilterd zodat alleen de cellen van belangstelling te tonen, kan de lengte van de resulterende structuur array gebruikt om het aantal cellen over de hele FOV van onze lensfree on-chip imager te krijgen.

4. Representatieve resultaten:

Een overzicht van onze set-up is weergegeven in figuur 1, met een aantal optische componenten die gebruikt worden in de montage. Belangrijkste kenmerken van onze on-chip microscopie platform worden toegelicht in figuur 2, inclusief TL-excitatie en detectie, totale interne reflectie en gedeeltelijk-coherente verlichting voor holografische transmissie beeldvorming op hetzelfde platform. Lensless fluorescerende on-chip beeldvorming de resultaten van een heterogeen mengsel met verschillende micro-deeltjes (4 micrometer groen en 10 um groen / rood) worden getoond in de figuren 3-4. Vergelijking van Lucy-Richardson deconvolutie en Druksterkte Sampling / Sensing gebaseerd decodering wordt gegeven in figuur 5 voor het digitaal vergroten van de resolutie van ruwe lensless fluorescerende beelden. Druksterkte decoderen ingeschakeld ruimtelijke resolutie (<4 pm) is gekwantificeerd in figuur 6. Lensless on-chip microscopie van fluorescent gelabelde witte bloedcellen wordt geïllustreerd in figuur 7, die voorziet ook in vergelijking beelden die met een conventionele tl-microscoop. Tot slot is onze geautomatiseerde fluorescerende voorwerp tellen interface die getoond wordt in figuur 8.

Figuur 1. Overzicht van onze lensless on-chip imaging set-up wordt getoond met een aantal optische componenten die gebruikt worden in de montage.

Figuur 2. Het schema van de on-chip lensfree fluorescerende beeldvorming platform is weergegeven (linker afbeelding). Fluorescentie excitatie wordt bereikt door de kant facet van een ruitvormige prisma met behulp van een onsamenhangend bron. De experimentele set-up van onze on-chip fluorescerende beeldvorming platform is ook te zien (afbeelding rechts). Volbloedmonster binnen een microfluïdische chip (afmetingen: 2,5 x 3,5 x 0,3 cm) werd enthousiast door het prisma-interface, waar de index matching olie werd gebruikt om de chip en het prisma monteren. Bij de afwijzing van de excitatie licht door TIR en de kleur filter, was alleen de fluorescentie-emissie van de gelabelde bloedcellen geregistreerd door onze CCD-sensor chip (KODAK 11.002) over een FOV van ~ 2,5 x 3,5 cm.

Figuur 3. Wide-field lensless fluorescerende on-chip beeldvorming van een mengsel met 4 pm en 10 urn groen fluorescerende deeltjes wordt geïllustreerd. Voor vergelijkingsdoeleinden zijn 10x microscoop objectief beelden ook voorzien, die goed overeenkomen met onze lensless fluorescerende beelden.

Figuur 4.

Figuur 5. Prestaties vergelijking van de Lucy-Richardson (LR) deconvolutie en druk-sampling (CS) op basis van decoderingsalgoritmen is voorzien, voor de beeldvorming van verschillende 10 urn kraal-paren. De bovenste rij geeft de lensless ruwe fluorescerende beelden. De inzet afbeeldingen in de bovenste rij tonen de microscoop vergelijkingen van dezelfde deeltjes die worden verworven met behulp van een 10x objectief. De middelste rij toont onze druk-decodering resultaten, terwijl de onderste rij geeft de Lucy-Richardson deconvolutie resultaten. d, d _CS, en d _LR verwijzen naar het midden-op-hart afstanden in microscoop beelden, CS gedecodeerd lensless beelden, en LR deconvolved lensless beelden, respectievelijk.

Figuur 6. Digitale verwerking van lensless tl-RAW-afbeeldingen is geïllustreerd. Een Druksterkte Sampling gebaseerd algoritme wordt gebruikt om de <4 micrometer ruimtelijke resolutie te bereiken door het oplossen van dicht op elkaar gepakte 2 micrometer diameter kraal paren. De inzetstukken tonen ook 40X microscoop objectieve vergelijkingen, die zeer goed overeenkomen met de gedecodeerde fluorescerende beelden. Hier d verwijst naar het midden-op-hart afstanden in microscoop beelden, terwijl d _CS verwijst naar het midden-op-hart afstanden in het CS gedecodeerde lensless fluorescerende beelden.

Figuur 7. Lensless beeldvorming van fluorescent (SYTO 16) gelabelde witte bloedcellen wordt geïllustreerd. De ruwe lensfree beelden worden snel gedecodeerd met behulp van een CS op basis van decoder, die zeer goed is het eens met een conventionele microscoop beeld van hetzelfde monster dat is verkregen met een 10x objectief.

Figuur 8. Een op maat ontworpen geautomatiseerde fluorescerende voorwerp tellen interface (in MATLAB) is geïllustreerd.

Discussion

Hebben we laten zien een on-chip fluorescentie microscopie platform dat bijvoorbeeld kan bereiken <4μm ruimtelijke resolutie dan bv> 0,6-8 cm ² veld-of-view zonder het gebruik van de lenzen, mechanische-scanning of dunne-film-interferentie-filters. In deze techniek, met het gebruik van een glasvezel-voorpaneel of een taper, is de tl-emissie van de voorwerpen die verzameld werden met een 2D-array van de glasvezel-kabels alvorens te worden geleverd aan een opto-elektronische sensor-array, zoals een CCD / CMOS chip. Deze verworven lensfree beelden worden vervolgens snel verwerkt tot <4μm resolutie over> opbrengst 0,6-8 cm ² veld-of-view met behulp van een compressie bemonstering / detectie op basis van decodering algoritme. Zo'n compacte en wide-field fluorescerende beeldvorming platform kan erg nuttig zijn voor high-throughput cytometrie, zeldzame-cel onderzoek en voor microarray-analyse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Charge-coupled device(CCD)	KODAK	KAF-8300
Charge-coupled device(CCD)	KODAK	KAF-11002
Charge-coupled device(CCD)	KODAK	KAF-39000
Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS)	Micron	MT9T031C12STCD
High power LED light source	Thorlabs Inc.	M455L2-C2
High power LED driver	Thorlabs Inc.	LEDD1B
Fiber coupled LED light source	Mightex	FCS-0625-000
Vacuum Pen	Edmund Scientific	NT57-636
2, 4, 10 μm Fluospheres	Invitrogen	F-8826, F-8859, F-8836
RBS lysis buffer 1X	eBioscience	00-4333
SYTO 16 labeling reagent	Invitrogen	S7578
Fiber-optic faceplate	Edmund Scientific	NT55-142
Fiber-optic taper	Edmund Scientific	NT55-134
Prisms	Edmund Scientific	NT47-626, NT45-403
Filters	Edmund Scientific	NT39-417
PDMS Elastomers	Dow Corning	Slygard 184