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Biology

Isolamento de CD133 + células tronco do fígado de Expansão Clonal

Published: October 10, 2011 doi: 10.3791/3183
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3
1Department of Pediatrics and Pharmacology, Pennsylvania State College of Medicine, 2Department of Pharmacology, Pennsylvania State College of Medicine, 3Department of Pediatrics, University of California Los Angeles, School of Medicine

Summary

Aqui nós descrevemos o isolamento de células do fígado CD133 expressando-tronco e células-tronco do câncer de fígado murino todo, um processo que requer a digestão dos tecidos, o enriquecimento de células eo isolamento de citometria de fluxo. Nós incluem métodos para o isolamento de células avançado única e expansão clonal.

Abstract

Células-tronco do fígado, ou células ovais, proliferam durante a lesão hepática crônica, e são propostas para se diferenciar em ambos os hepatócitos e cholangiocytes. Além disso, as células-tronco do fígado são a hipótese de ser os precursores de um subconjunto de câncer de fígado, carcinoma hepatocelular. Um dos principais desafios para conter trabalho em células de qualquer órgão sólido como o fígado é o isolamento de uma população rara de células para análise detalhada. Por exemplo, a grande maioria das células do fígado são hepatócitos (fração parenquimatosa), que são significativamente maiores do que os não-parenquimatosa células. Através do enriquecimento das compartimentos específicos celulares do fígado (ou seja, parenquimatosas e não parenquimatosas frações), e selecionando para CD45 células negativas, somos capazes de enriquecer a população a partir de células-tronco por mais de 600 fold.The proceduresdetailed neste relatório permitem uma população relativamente raro de células de um órgão sólido a ser classificado de forma eficiente. Este processo pode ser utilizado para as células-tronco do fígado murino isolateliver normal, assim como modelos de lesão crônica no fígado, que demonstram um aumento da proliferação de células-tronco do fígado. Este método tem vantagens claras sobre imuno-histoquímica padrão de congelados ou formol fígado fixado como estudos funcionais utilizando células vivas podem ser realizadas após a primeira co-localização experimentos. Para realizar o procedimento descrito neste relatório, uma relação de trabalho com uma pesquisa do núcleo de citometria de fluxo baseado é fortemente encorajado, como os detalhes de isolamento FACS são altamente dependentes de instrumentos especializados e um forte conhecimento de básico citometria de fluxo dos procedimentos. O objetivo específico deste processo é isolar uma população de células-tronco do fígado que pode ser expandida clonal in vitro.

Protocol

Todas as soluções, meios de comunicação, instrumentos, filtros e tubos devem ser estéreis e manuseadas com técnica estéril para reduzir o risco de contaminação. Prepare todos os tampões e media 24 horas de antecedência e armazenar a 4 ° C.

1. Separação parenquimatosas e não parenquimatosas do fígado inteiro

  1. Prepare a solução de enzima para a digestão, utilizando um tubo cc 15 com tampa de rosca em PBS estéril 10 ml contendo 5 mg de colagenase, 5 pronase mg e 1 mg DNAse.
  2. Euthanize mouse usando instituição aprovado (Animal Care Institucional e Comitê Use) método de asfixia, como o CO 2. Limpe área abdominal dos animais sacrificados com solução de etanol 70%. Utilizando instrumentos estéreis, a cavidade abdominal aberta e fígado explante en-bloco. Remover vesícula biliar do fígado explantado. Transferência de fígado toda a capa de fluxo laminar no prato estéril fechado.
  3. Este procedimento é concluído em uma capela de fluxo laminar. Usando uma lâmina estéril, mince fígado com a combinação de vários cortes horizontais e verticais por 1 minuto no prato estéril. Coloque ¼ de polpa picada do fígado em 15 tubos com 10 cc cc PBS com colagenase, pronase e DNAse a partir do passo 1.1 acima. Repita com cada fígado ¼ picada.
  4. Colocar os tubos com ¼ de celulose e enzimas do fígado picada em banho-maria a 37 ° C por 45 minutos, com agitador, 1-2 ciclos / segundo. Limpe os tubos com álcool 70% após a remoção do banho de água antes da transferência para a capela de fluxo laminar.
  5. Este procedimento é concluído em uma capela de fluxo laminar. Tensão de celulose digerida fígado através de 70 mícron filtro de rede para coletar em um prato estéril. Usando alíquotas de 2 ml de DMEM estéril: F12 media com 10% de calor soro fetal bovino inativado, lavar o filtro e usar o final de borracha de um êmbolo da seringa para amasse a polpa digerida através do filtro. Repita 5 vezes para fazer volume total de filtrado cerca de 20 mL. Divide-se o filtrado em dois tubos de 15 mL igual.
  6. Todas as transferências devem ser concluídas em capela de fluxo laminar, e usar centrífuga refrigerada a 4 ° C, se disponível. Centrifugar a 50 xg por 1 minuto. Guarde o sobrenadante # 1 e descarte do parênquima pellet. Centrífuga sobrenadante # 1 a 50 xg por 1 minuto. Guarde o sobrenadante # 2 e descarte da pelota. Centrífuga sobrenadante # 2 a 50 xg por 1 minuto. Guarde o sobrenadante # 3 e descarte da pelota. Centrífuga sobrenadante final # 3 para 180 xg por 8 minutos para a obtenção não-parenquimatosa fração.

2. Lise de células vermelhas

Trabalhar em capela de fluxo laminar, manter as células frio, e soluções de uso resfriado a 4 ° C.

  1. A noite antes do procedimento, prepare tampão de lise das células vermelhas, diluindo a concentração de ações 10X BD Pharm Lyse buffer com uma diluição de 1:10 com água destilada estéril. 1X solutionshould ser armazenadas por 30 dias a 4 ° C.
  2. A noite antes do procedimento, prepare Miltenyi buffer usando estéril PBS, 0,5% de soro albumina bovina, e 2mM EDTA. Solução de filtro com unidade de vácuo com filtro de 0,45 mícron filtro. Tampa superior da unidade tilter com tampa de plástico original e segura com filme plástico. Storeentire unidade de filtro a 4 ° C por 12 horas para degas EDTA. Unidade de filtro pode ser substituído com tampa estéril padrão após 12 horas.
  3. Este procedimento é concluído em uma capela de fluxo laminar. Usando um tubo de 5 ml estéril, re-suspensão não-parenquimatosa pellet a partir do passo 1.6 em 1 mL de 1X tampão vermelho sangue diluído lise celular de 2.1 acima. Tampe o tubo de transferência para fora da capela de fluxo laminar.
  4. Suavemente vórtice para cinco segundo e incubar por 15 minutos a 4 ° C protegido da luz.
  5. Centrifugar a 200 xg por 5 minutos.
  6. Este procedimento é concluído em uma capela de fluxo laminar. Descartar hemácias lisadas no sobrenadante e re-suspensão sedimento em 1 ml de tampão Miltenyi gelada e estéril.
  7. Centrifugar a 200 xg por 5 minutos.
  8. Este procedimento é concluído em uma capela de fluxo laminar. Elimine o sobrenadante e re-suspensão sedimento em 1 ml de tampão Miltenyi gelada e estéril.
  9. Retire 10 ml de PBS suspensão celular e adicionar 10 ml tryan azul. Contar remainingnon-parenquimatosa células usando hemocitômetro.

3. CD45 a depleção de células hematopoiéticas de não-parenquimatosa fração

Trabalhar em capela de fluxo laminar, manter as células frio, e soluções de uso resfriado a 4 ° C.

  1. Suspender as células em 100 mL de Miltenyi buffer por 107 células de até 108 células total.
  2. Aplicar 20 mL de anticorpos CD45 Miltenyi microbead para cada 107 células e incubar a 4 ° C por 15 minutos.
  3. Adicionar mais 2 ml de tampão Miltenyi e centrifugar a 200 xg por 5 minutos. Remover o sobrenadante. Re-suspender pellet celular (até 108 células total) em um buffer de Miltenyi ml.
  4. Na capela de fluxo laminar, as células do filtro com Miltenyi coluna LD magnético. Comece por colocar coluna em suporte magnético (Miltenyi MidiMACS ou QuadroMACS). Coloque o tubo ml estéril 5 abaixo filtro para pegar filtrado. Prepare coluna por carregar 2 ml Miltenyi buffer.
  5. Uma vez pré-filtro de lavagem é completa, células de carga em coluna LD. Uma vez que a suspensão celular está dentro da coluna, adicionar 1 ml de tampão e repetir Miltenyi 1 ml Miltenyi tampão de lavagem 2 vezes. Não use êmbolo fornecido com coluna para aumentar a velocidade de filtração. Apenas recolhemos filtrado quando o filtro de colocado no suporte magnético.
  6. Centrifugar o filtrado recolhido de cerca de 5 ml (a coluna tem o restante 1 ml) de CD45 com depleção de células não-parenquimatosas a 200 xg por 5 minutos. Descartar a coluna com o retido CD45 células positivas.

4. Isolamento citometria de fluxo de células CD133 positivo

  1. Prepare a mídia celular oval. Use 1:01 DMEM: F12 média com 10% de soro fetal bezerro inactivado pelo calor como base, e adicionar insulina (1 mg / ml), HEPES (5 mol / L) e penicilina / estreptomicina (1% volume / volume). Solução de filtro com unidade de vácuo com filtro de 0,45 mícron filtro.
  2. Re-suspender as células em tampão a 100 mL Miltenyi por 10 7 células. Adicione 2 mL de CD133-PE anticorpo conjugado. Usando um segundo grupo de células, incube com IgG-PE anticorpo conjugado como um controle. Manter um terceiro grupo de células sem coloração como um controle sem mácula para FACS.
  3. Incubar a 4 ° C por 15 minutos no escuro. Re-suspender, buffer de 2 ml coloração. Centrifugar a 200 xg por 5 minutos. Elimine o sobrenadante e re-suspensão sedimento em 1 ml de buffer Miltenyi.
  4. Esta etapa é realizada usando o padrão de citometria de fluxo procedimentos de classificação de células, que podem ser específicos instituição. Usando células imaculada e células IgG PE manchado, ajustar parâmetros para classificação gating otimizada de população de células CD133 +. PE (R-Phytoerythrin) pode geralmente ser usado com qualquer citômetro de fluxo que tem um laser que emite a 488 nm. A emissão de pico para PE é 575 nm e é detectada no canal de FL-2.

    Nota: Usando uma BD FACS Calibur ou máquinas BD FACS Vantage, com o programa da Quest celular para coleta de dados, usamos Encaminhar Scatter e Side Scatter vista na escala log para identificar populações de células, com dispersão lateral definido para 250. FL1 e FL2 estão ambos em escala logarítmica e definido para 550. Estes parâmetros fornecem um lugar de partida inicial para ver o fígado não-parenquimatosa células, e são ajustadas conforme a necessidade com base na intensidade de coloração das populações positivos e negativos.
  5. Isolar a população de células CD133 + + utilizando CD133 portão e recolher as células em células estéreis media filtrada.

5. Cultura métodos celular

  1. FACS centrífuga coletadas células a 200 xg por 5 minutos. Re-suspender pellet celular na mídia célula oval, com cerca de 5.000 células por ml. Pode começar com concentrações mais elevadas, de até 50.000 células / ml para experimentos iniciais, e reduzir, melhora técnica e viabilidade celular global e melhora o rendimento.
  2. Células em placa de BD Biocoat laminina revestido 96 placas de bem com 1000 células / cm 2. Lugar em cultura de células incubadora umidificada a 37 ° C, com 5% de CO 2. Após 24 horas, adicione Fator de Crescimento de Hepatócito (50 ng / nl) e Fator de Crescimento Epidérmico (20 ng / ml).
  3. Para células individuais, isolar as células diretamente em 50 ul de mídia célula oval em cada poço de uma placa de 96 laminina bem revestido. Use FACS configurações única célula de rigorosa seleção de uma célula positivas. Após 24 horas, adicione 50 ul de mídia célula oval com HGF e EGF como acima no passo 5.2. Mudança de mídia totalmente após 5-7 dias.
  4. Uma vez que as colônias em expansão são superiores a 50% confluentes, que tipicamente ocorre após duas semanas, dependendo do número total de células viabilidade banhado e celular, as células podem ser divididos 01:03 como abaixo.
  5. Dividir células utilizando tripsina-EDTA 0,05%. Aplicar apenas o suficiente para cobrir bem fundo, 5-10 mL / poço em placa de 96 poços. Colocar em estufa a 37 ° C por 3-5 minutos.
  6. Adicionar 100 mL de mídia a cada poço e transferir todos os líquidos a 5 ml do tubo. Adicionar 1 mL de mídia a cada tubo e centrifugar a 200 xg por 5 minutos.
  7. Re-suspender as células em meios de prato em prato revestido laminina, usando células de um bem a placa em três novos poços (1:3).

6. Confirmação de bi-potencial status usando RT-PCR

Este procedimento é detalhado no RNeasy protocolo manual, que é fornecido com o Kit RNeasy.

  1. Use RNeasy colunas micro por 96 colônias placa bem. Aspirar meios de cultura de cada poço. Adicionar 75 mL tampão RLT (de Kit RNeasy) diretamente a cada poço. Raspar a placa com fundo policial de borracha estéreis. Pipettelysate em micro-tubo de centrífuga e mistura vortex por 1 minuto. Adicionar álcool 70% para lisados ​​e misture por pipetagem.
  2. Transferir a solução para a coluna RNeasy colocado em um tubo de coleta de 2 ml (como fornecido no Kit RNeasy) e centrifugar em centrífuga de micro-por 15 segundos a 10.000 rpm. Descartar eluída filtrado.
  3. Re-utilizar o tubo de coleta. Adicionar 350 mL de buffer RW1 (Kit RNeasy) para a coluna RNeasy e centrifugar por 15 segundos a 10.000 rpm para lavar a colunamembrana. Descartar lavar eluídos.
  4. Adicionar 10 mL de solução stock DNase I para 70 mL de buffer RDD (ambos fornecidos no Kit RNeasy). Adicione o 80 mL DNase I Tampão mix de incubação RDD à membrana coluna RNeasy e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente.
  5. Adicionar 350 mL de buffer RW1 (kit RNeasy) para a coluna RNeasy e centrifugar por 15 segundos a 10.000 rpm para lavar a membrana. Descartar lavar eluído e tubo de coleta.
  6. Coloque a coluna RNeasy em um novo tubo de recolha de 2 ml (fornecido no kit RNeasy). Adicionar 500 mL de buffer RPE (Kit RNeasy) para a coluna RNeasy e centrifugar por 15 segundos a 10.000 rpm para lavar a membrana. Descartar lavar eluídos.
  7. Prepare etanol 80% usando RNase água (Kit RNeasy). Adicionar 500 mL de etanol 80% para a centrífuga columnand RNeasy por 2 minutos a 10.000 rpm. Descartar lavar eluídos.
  8. Coloque a coluna RNeasy em um novo tubo de recolha de 2 ml (Kit RNeasy) e centrifugar a toda a velocidade por 5 minutos. Descartar qualquer lavar eluído e tubo de coleta.
  9. Coloque a coluna RNeasy em um novo tubo de coleta de 1,5 ml (kit RNeasy). Adicionar 14 água RNase mL (Kit RNeasy) para o centro da membrana coluna e centrifugar por 1 minuto em velocidade máxima. Coletar filtrado com RNA purificado e transferência para a criação de cDNA de gelo se imediatamente ou loja a menos 80 ° C para uso futuro.
  10. Transcrição reversa utilizando um inibidor da RNase Omniscript.Dilute para uma concentração final de 10 unidades / mL na gelada 1x tampão RT. Vortex por 5 segundos, pulso e centrifugar por 5 segundos. Prepare uma mistura mestre fresco no gelo de acordo com a página 13 do Omniscript protocolo. Vortex por 5 segundos, pulso e centrifugar por 5 segundos. Recomendo para preparar um volume de Mastermix 10% maior do que o necessário para o total exigido para todas as reações.
  11. Adicionar RNA modelo para os tubos individuais contendo mix master. Vortex por 5 segundos, pulso e centrifugar por 5 segundos. Incubar por 60 min a 37 ° C.
  12. PCR amplificação de hepatócitos (albumina) e cholangiocyte genes específicos usando HotStarTaq DNA polimerase. Prepare mistura de reacção por página 15 do livro HotStarTaq protocolo. Recomendar ações para diluir primers concentração de 20 pm / mL, e com um tubo mL / reação primers usados ​​para frente e para trás. Dependendo do número de células inicialmente utilizado para a extração de RNA, recomenda-se dividindo cDNA final entre 3 tubos de reação (β-actina para o controle de carga, albumina e KRT19) para iniciar.
  13. PCR desenho de primers é listada na Tabela 1.
  14. Coloque os tubos de reação em termociclador. Recomendo seguinte programa para experimentos iniciais: 95 ° Cpara 15 minutos x 1 ciclo seguido de 95 ° C por 30 segundos, 55 ° C por 30 segundos, 72 ° C por 30 segundos x 35 ciclos, seguidos de 72 ° C por 10 minutos.
  15. Os produtos de PCR são analisados ​​usando brometo de etídio impregnada agarose gel.

7. Confirmação do potencial de tumor de células CD133 +-tronco

  1. Este procedimento pode ser feito com recém-células isoladas a partir do passo 4 ou uso de células que foram cultivadas a partir do passo 5. Recomendamos a realização de experimentos iniciais com células cultivadas, como as células recém-isoladas terão reduziu a viabilidade e produtividade reduzida.
  2. Trypsinize células utilizando tripsina-EDTA 0,05% a partir do passo 5.5 acima. Depois de 3-5 minutos de incubação a 37 ° C, adicionar 100 mL de mídia para cada bem e transferir todo o líquido de cada poço a cada 5 tubos de ml (1 tubo bem = 1). Adicionar 1 ml de mídia a cada tubo e centrifugar a 200 xg por 5 minutos.
  3. Re-suspender as células em 1 ml de gelo frio PBS. Retire 10 ml de PBS suspensão celular e adicionar 10 ml azul de tripano. Usando trypan exclusão azul, determinar o número de células vivas. Se estiver usando FACS células isoladas, o número de células será determinado pela FACS contar isolamento.
  4. Células Centrifugar a 200 xg por 5 minutos e ressuspensas em PBS na concentração de 1 x 10 6 cells/100 mL ao vivo. Adicionar 100 mL Matrigel. De seis semanas de idade, imuno-deficientes camundongos Nude foram injetados com 28 agulha gague. Injectar 1 x 10 6 células em 200 mL por site.
  5. Ratos são monitorados para o crescimento do tumor diária. Uma vez que os tumores forma, geralmente após 3-4 semanas de incubação, o volume de tumor é medido com paquímetro (altura x comprimento x largura).

8. Resultados representativos:

De normal, fígado saudável de camundongo, o rendimento esperado celular da CD133 + células-tronco do fígado é de 1.000 a 5.000 por fígado. Estas células são relativamente raros no fígado quiescente e não expandir também na cultura. Nós não recomendamos o uso de análise única célula no fígado normal e no rendimento de células viáveis ​​que irá expandir é extremamente baixo.

Para fígados com lesão crônica significativos, tais como a dieta DDC 0,1% para 6 semanas 1 ou modificação genética, resultando em lesão crônica, tais como o MAT1a - / - ou PTEN específica do fígado - / - ratos, 2-4 o número esperado de celaumenta ls isolada, com até 100.000 células do fígado / isolada (Figura 2). Se utilizando modelos genéticos, o conhecimento da taxa de tumor espontâneo é crítica, uma vez que estes procedimentos para o isolamento de células-tronco do fígado deve ser realizado em animais livres de tumor. Por exemplo, se o MAT1a - / - modelos de formulários tumores espontâneos em 18 meses, recomendamos o uso de animais, o mais tardar 15-16 meses, antes de qualquer tumores relatados espontânea.

Isolamento de células isoladas a partir de modelos lesão crônica trará várias (3-9 placa colonies/96 bem) colônias que se expandem a partir de células individuais, uma vez que o procedimento é dominado, e viabilidade das células é garantida. Figura 3 apresentam representante imagens de contraste de fase de colônias derivadas de um único CD133 + células expandidas após 7 dias.

Confirmação do bi-estado em potencial é realizado usando albumina e Krt19 RT-PCR. Colônias de células expandidas única irá demonstrar tanto a expressão de marcadores de hepatócitos (albumina) e cholangiocytes (Krt19). A Figura 4 demonstra potencial bi-expressão de três colônias isoladas, com cerca de 25 células / colônia de 7 dias.

CD133 + células-tronco do fígado normal e lesão hepática induzida quimicamente (por exemplo, dieta DDC 0,1% para 6 semanas) não vai formar tumores em camundongos nude. CD133 + células-tronco a partir de modelos específicos de genética (MAT1a - / - ou PTEN específica do fígado - / - ratos) irá formar tumores em camundongos nus se isolada no final de tarde fase de lesões pré-tumorais crônica. Este fenótipo tumor formando atualmente é identificado como uma célula-tronco do câncer 2-4 Por exemplo, o MAT1a -. / - Ratos formar tumores de fígado espontâneo em 18 semanas de idade. CD133 + células-tronco isoladas de fígado em 15-16 semanas, durante uma fase final de lesão crônica da doença de fígado, irá formar tumores em camundongos nude. A Figura 5 demonstra tumores representante de injeção bilateral de 1 x 10 6 células expandidas in vitro de um único CD133 + células-tronco do fígado.

Gene Primer para a frente Primer reverso
β-Actina 5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3 ' 5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3 '
Albumina 5'-CATGCCAAATTAGTGCAGGA-3 ' 5'-GCTGGGGTTGTCATCTTTGT-3 '
Queratina 19 5'-TGCTGGATGAGCTGACTCTG-3 ' 5'-AATCCACCTCCACACTGACC-3 '

Tabela 1: design Primer para RT-PCR

Figura 1
Figura 1: Esquema geral de métodos.

Figura 2
Figura 2: CD133 + células-tronco hepáticas identificadas na altamente enriquecido CD45 esgotados fração não-parenquimatosas hepáticas Controle ileso de camundongos selvagens demonstra 0,4% CD133 + células dentro do altamente enriquecido CD45 empobrecido fracção não-parenquimatosas.. Na genética knock-out MAT1a - / -, que é um modelo de lesão hepática crônica, a população CD133 expande 10 vezes ou mais na mesma fração altamente enriquecido.

Figura 3
Figura 3: Expansão colônias de um único CD133 + clones de contraste de fase imagens de quatro colônias derivadas de células CD133 + única expandiu laminina revestido 96 placas bem..

Figura 4
Figura 4:. Bi-potencial de expressão gênica de células-tronco CD133 + fígado colônias clonalmente expandiu no dia 7, as colónias são cerca de 25 células. Expressão do gene demonstra expressão do marcador marcador hepatócito Albumina e cholangiocyte Krt19, confirmando bi-potencial status de células CD133 +.

Figura 5
Figura 5: CD133 + células-tronco do fígado formar tumores em camundongos nus As setas indicam tumores de crescimento de 4 semanas após 1x10 6 células CD133 + injetado de MAT1a - / - modelo.. CD133 + células de toxina lesão hepática crônica induzida, como CCl 4 ou 0,1% da dieta DDC, não formam tumores. Formação de tumores é usado para identificar potencial maligno, ou câncer de fenótipo de células-tronco dentro da população de células-tronco.

Discussion

Ao contrário do sistema hematopoético, em que as células-tronco hematopoiéticas são responsáveis ​​por manter um sistema de diferenciação celular que replacesnormal fisiológicas turn-over de leucócitos, glóbulos vermelhos e plaquetas, células-tronco do fígado, ou células progenitoras adultas fígado, não participam de fígado normal homeostase. 5,6 Após lesão hepática aguda ou hepatectomia parcial, hepatócitos, epitélio como fígado diferenciados, passam por várias fases de proliferação para substituir a massa hepática perdido. 5,6 Somente durante lesão crônica são células-tronco do fígado observada a proliferar. 1,5 -11 Estes adultos, órgão células-tronco específicas são propostas para diferenciar-se em ambos os hepatócitos e cholangiocytes. 1,5-8 Curiosamente, a grande maioria de câncer de fígado desenvolve no fundo da lesão crônica, e, assim, as células-tronco do fígado também são hipótese a ser os precursores de um subconjunto de câncer de fígado. 2-4,12-17

Um dos grandes desafios para conter o trabalho celular no fígado é o isolamento de populações raras de células para análise funcional. Por exemplo, a grande maioria das células do fígado são hepatócitos, que são significativamente maiores do que cholangiocytes e outros menores não-parenquimatosa células. Quebrando todo o fígado em compartimentos celulares (hepatócitos grande - fração de parênquima e células menores - não-parenquimatosa fração), e ainda a seleção de células CD45 negativo (não-hematopoiéticas células), somos capazes de enriquecer a população a partir de células-tronco por mais de 600 vezes. 1,18-21 De notar que estamos de maneira nenhuma o que indica que a população + CD133 é um 100% da população de células-tronco pura, mas representa claramente uma população heterogênea de células, com diferentes linhagens e potencial de repovoamento. Uma das principais limitações do campo é definições de células-tronco e células progenitoras. Nós usamos a "célula-tronco" termo mais amplamente neste trabalho, mas em definição estrita, CD133 + não-parenquimatosa células representam uma população progenitora bi-linhagem. Dado o estado atual da haste e pesquisa de células progenitoras no fígado, este relatório não fornece um ponto de partida para os investigadores que estão interessados ​​neste campo. Como marcadores surgem novos, como EpCAM, 22,23 ou fatores de transcrição, tais como Sox9, 24 podem ser incorporados. Por exemplo, nós encontramos uma taxa bastante alta de sobreposição entre células EpCAM + e células CD133 +.

Neste relatório, detalhamos um processo para isolamento de células-tronco do fígado de camundongos normais, bem como modelos de lesão crônica no fígado, que demonstram um aumento da proliferação de células-tronco do fígado. Este método tem vantagens claras sobre imuno-histoquímica padrão de congelados ou formol fígado fixado como estudos funcionais utilizando células vivas podem ser realizadas após o isolamento. 1,3,4 O objetivo específico deste processo é isolar uma população relativamente pura de células tronco do fígado que pode clonalmente ser expandidas in vitro.

A principal limitação para este procedimento é que a maioria das células isoladas não será viável após a citometria de fluxo (ver secção Resolução de Problemas). Este é o resultado de as horas necessárias para preparar as células, e os inúmeros procedimentos necessários para refinar a população antes de isolamento. Se o fígado é digerido em suspensão única célula para análise FACS imediato, a diferença de tamanho entre os hepatócitos e outras células não-parenquimatosas fará criação portão eficaz FACS impossível. Se o fígado não-parenquimatosa células são utilizadas, sem eliminação de células hematopoiéticas, há um risco de que um número significativo de células CD133 + pode ser de origem hematopoiéticas podem contaminar a fração. Além disso, através do processamento das células através do filtro Miltenyi, apenas uma única célula e clusters muito pequena de células são coletadas. Isso garante que a amostra não vai entupir a agulha ingestão FACS.

Alternativas para este procedimento incluem a modificação de qualquer marcador alternativa da superfície celular, tais como CD49f, EpCAM, ou a combinação de marcadores, como CD133 + + EpCAM Um segundo relatório publicado utiliza um gradiente de densidade para isolar células-tronco do fígado de uma fração não-parenquimatosas. Este procedimento requer uma centrífuga Ultra-(8000 xg), acrescenta um tempo significativo para o procedimento, e em nossa experiência, reduziu significativamente o rendimento pré-FACS celular e pós-FACS viabilidade 8.

Experimentos futuros incluem uma ampla gama de análise de expressão gênica, incluindo genes do fígado fetal, tais como HNF3, HNF4α, e além αfp.In, análise de Western blot e imunocitoquímica das proteínas expressas podem ser utilizados para confirmar a RT-PCR, os resultados de células em cultura.

Uma questão a se notar é um trabalho recente que identificou CD133 expressão em células estreladas hepáticas. 25 Nós agora rotineiramente tela nossas amostras para os marcadores de células estreladas (ver secção Resolução de Problemas), e não identified contaminação significativa no nosso frações. Isso pode estar relacionado com as diferentes técnicas de digestão do fígado e do isolamento de células. 2,3,26

Baseado no fato de que a maioria das células não vai ser viável imediatamente após o isolamento FACS, recomendamos que as células sejam banhados, seja como massa CD133 + células ou células isoladas, antes da sua utilização em animais. 5-7 dias in vitro irá melhorar significativamente os resultados da análise do tumor. Além disso, dado os rigores de isolamento única célula, este deverá ser realizado apenas uma vez colônias pode ser expandida a partir de CD133 + granel células isoladas. Uma discussão mais aprofundada das condições de cultivo e várias proteínas de andaime que podem ser utilizadas para conter a cultura do fígado e células progenitoras foi bem caracterizada por Lola Reid. Este trabalho oferece condições alternativas e modificações, que os investigadores podem incorporar em seu programa de pesquisa uma vez que técnicas de isolamento básicos são dominados. 27,28 Dr. Trabalho de Reid também fornece uma análise mais detalhada da biologia linhagem e maturação entre as células-tronco e progenitores hepática comprometida.

Em termos de análise de tumor in vivo, temos tido sucesso usando recém células isoladas e células de expansão clonal CD133 + células in vitro, usando principalmente 1x10 6 células. Nós nos concentramos cepas ontwo genética de lesão hepática crônica, a MAT1a - / - e PTEN específica do fígado - / - ratos, e nós utilizamos camundongos nude e camundongos selvagens como hospedeiros de crescimento do tumor. Em nossa experiência, CD133 + células-tronco do fígado só vai formar tumores se eles são isolados a partir de modelos hepática significativa lesão que são pré-malignas. Note-se que os tumores formados a partir de células CD133 + geral têm tanto carcinoma hepatocelular e características colangiocarcinoma, sugerindo uma célula-tronco ou células progenitoras origem aos tumores. 2-4,29

Trabalho de acompanhamento após tumores são documentados inclui a análise patológica padrão de tecido tumoral (coloração H & E) e coloração imuno-histoquímica. Além disso, os tumores podem ser picadas e digeridas para FACS análise ou re-cultura. 2-4,30

Em conclusão, temos um procedimento detalhado para o isolamento, expansão e caracterização básica de CD133 + células tronco do fígado e CD133 + células-tronco cancerosas.

Resolução de Problemas:

CD45 contaminação:

Para o Passo 3, se houver contaminação do CD45 células +, que pode ser avaliado pela adição de um Ab CD45-FITC antes FACS análise e isolamento, verifique se o anticorpo microbead CD45 não expirou e que o filtrado foi coletado somente enquanto o filtro foi no suporte magnético. Qualquer filtrado recolhido enquanto que o filtro não está no suporte magnético irá conter células CD45 +.

Número de células de baixa:

Para o fígado sem ferimentos, o número total de CD133 + não-parenquimatoso isolado pode ser inferior a 10.000. Estas células são raras no fígado quiescente. Para um modelo de lesão crônica, tais como a dieta DDC 0,1%, o número irá aumentar enormemente a 100.000 células. Se o número total de células é significativamente abaixo desses números, uma questão a considerar é o FACS coloração Ab. Verifique para garantir que o Ab CD133 não expirou, como coloração pobres irá resultar em um rendimento pobre. Além disso, recomendamos realizar uma análise FACS do fígado não-parenquimatosa células para determinar a população relativa antes de tentar o isolamento FACS.

Viabilidade celular baixa após FACS:

Uma das questões de viabilidade pode ser relacionado à forma como as células são processadas e sobre o que o tempo. Idealmente, todo o procedimento de isolamento de células, os passos 1-4, deve ser realizada sem atrasos entre as etapas e concluída no mesmo dia. Qualquer atraso significativo entre os passos 1-4 irá reduzir significativamente a viabilidade celular. Uma segunda questão relacionada com a viabilidade das células podem estar relacionados à pressão bainha utilizado para o isolamento FACS. Recomendamos a utilização de uma menor pressão bainha. Por último, uma vez que as células são isoladas, elas devem ser imediatamente banhado, como qualquer armazenamento significativo no gelo após a triagem também irá reduzir sua viabilidade.

CD133 + não-parenquimatosa heterogeneidade:

Relatórios recentes indicam que as células estreladas hepáticas também podem ter CD133 expressão e ter alguma plasticidade. 25 Por isso, além de verificar a potência bi-genes com albumina e Krt19, verificação adicional pode incluir genes associados com as células estreladas, como a proteína fibrilar glial ácida em células estreladas quiescentes e alfa-actina de músculo liso e desmina em células estreladas ativadas. 3,4,26 Além disso, a população CD133 + representa uma população mais ampla progenitor. A adição de um segundo marcador, como EpCAM, pode ajudar a refinar ainda mais a população, e heterogeneidade limite.

Disclosures

Dr. Rountree recebe apoio de pesquisa da Bayer Farmacêutica. Drs. Ding e Crooks e Ms. Dang e Ms. Vankirk não têm divulgações para relatar.

Acknowledgments

Dr. Rountree reconhece o actual apoio da Rede das Crianças Miracle, National Institute of Health, K08DK080928 e R03DK088013, ea American Cancer Society Award Scholar Research, MGO-11651. Dr. Rountree reconhece que este processo foi inicialmente desenvolvido e refinado, enquanto financiado pelo Programa Pediátrica Scientist Desenvolvimento (NICHD Grant Award K12-HD00850).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM:F12 Invitrogen 10565-018 With phenol red
CD45 microbeads Miltenyi Biotec 130-052-301
Hepatocyte Growth Factor Sigma-Aldrich H1404
Epidermal Growth Factor Sigma-Aldrich E4127
DNase Sigma-Aldrich DN25 1 gram
Collagenase D Roche Group 1088874
Pronase Roche Group 0165921
70 micron mesh strainer Fisher Scientific 352350
Omniscript RT Qiagen 205111 50 reactions
HotStarTaq Qiagen 203203
Miltenyi LD column Miltenyi Biotec 130-042-901
CD133-PE FACS Ab eBioscience 12-1331-82
Laminin coated plates BD Biosciences 354410 96 well
Trypsin 0.05% EDTA Invitrogen 25300-354 100 mL
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 50 columns for 5x105 cells or less
Pharm Lyse BD Biosciences 555899 10X concentration

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References

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Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., VanKirk, C., Crooks, G. M. Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion. J. Vis. Exp. (56), e3183, doi:10.3791/3183 (2011).

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