Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

عزل CD133 خلايا + الجذعية الكبد للتوسع نسيلي

Published: October 10, 2011 doi: 10.3791/3183
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3
1Department of Pediatrics and Pharmacology, Pennsylvania State College of Medicine, 2Department of Pharmacology, Pennsylvania State College of Medicine, 3Department of Pediatrics, University of California Los Angeles, School of Medicine

Summary

نحن هنا وصف عزل الخلايا الجذعية CD133 معربا عن الكبد والخلايا الجذعية السرطانية من الكبد الفئران كله، وهي عملية الهضم يتطلب الأنسجة، والإثراء الخلية، وتدفق الخلوي العزلة. نحن تشمل أساليب متقدمة لعزل خلية واحدة والتوسع نسيلي.

Abstract

الكبد الخلايا الجذعية، أو الخلايا البيضاوي، تتكاثر خلال إصابة الكبد المزمن، واقترح على التمايز إلى خلايا الكبد على حد سواء وcholangiocytes. وبالإضافة إلى ذلك، يتم الافتراض الكبد الخلايا الجذعية لتكون السلائف لمجموعة فرعية من سرطان الكبد، سرطان الكبد. واحدة من التحديات الرئيسية لوقف العمل في أي خلية الأعضاء الصلبة مثل الكبد هو عزل السكان نادرة من الخلايا لتحليل مفصل. على سبيل المثال، فإن الغالبية العظمى من الخلايا في الكبد هي خلايا الكبد (جزء متني)، والتي هي أكبر بكثير من الخلايا غير متني. من إثراء حجرات محددة الخلوية في الكبد (أي متني والكسور غير متني)، واختيار لخلايا CD45 السلبية، ونحن قادرون على إثراء السكان بدءا من الخلايا الجذعية أكثر من fold.The-600 proceduresdetailed في هذا التقرير يسمح لل يمكن فرز عدد سكانها نادرة نسبيا من الخلايا من الأعضاء الصلبة بكفاءة. ويمكن استخدام هذه العملية لisolateliالخلايا الجذعية النسخة من الكبد الفئران العادية وكذلك نماذج اصابة الكبد المزمنة، والتي تثبت زيادة انتشار الخلايا الجذعية الكبد. هذا الأسلوب له مزايا واضحة على مستوى الكبد المناعية الثابتة المجمدة أو الفورمالين كما يمكن إجراء الدراسات الفنية باستخدام الخلايا الحية بعد التجارب الأولية شارك في الترجمة. لإنجاز إجراءات المبينة في هذا التقرير، وتشجع بقوة على علاقة عمل مع مجموعة أساسية التدفق الخلوي البحوث القائمة على المعلومات من العزلة FACS تعتمد اعتمادا كبيرا على الأجهزة المتخصصة ومعرفة قوية تعمل من إجراءات التدفق الخلوي الأساسية. الهدف المحدد لهذه العملية هو عزل السكان من الخلايا الجذعية الكبد التي يمكن توسيعها clonally في المختبر.

Protocol

ينبغي لجميع الحلول، ووسائل الإعلام، والأدوات، والمرشحات، وأنابيب تكون معقمة والتعامل معها تقنية معقمة للحد من مخاطر التلوث. إعداد جميع مخازن وسائل الإعلام قبل 24 ساعة وتخزينها في C. ° 4

1. متني وغير متني-الانفصال عن الكبد كله

  1. إعداد الحل انزيم لهضم باستخدام أنبوب سم مكعب 15 مع كبار المسمار في 10 مل العقيمة PBS تحتوي على 5 ملغ كولاجيناز، 5 pronase ملغ، و 1 الدناز ملغ.
  2. الموت ببطء الماوس باستخدام المؤسسة المعتمدة (المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام) الطريقة مثل الاختناق 2 CO. مسح منطقة البطن من الحيوانات الموت الرحيم مع الحل الايثانول 70٪. استخدام معقم الصكوك، تجويف البطن المفتوح والكبد يزدرع EN-كتلة. إزالة المرارة، المثانة من الكبد explanted. نقل الكبد كله هود تدفق الصفحي في طبق عقيمة مغلقة.
  3. اكتمال هذا الإجراء في الصفحي هود التدفق. باستخدام شفرة حلاقة معقمة، اللحم المفروم الكبد معمزيج من عدة تخفيضات الأفقي والرأسي لمدة 1 دقيقة في طبق العقيمة. مكان ¼ عجينة الكبد المفروم في أنبوب سم مكعب 15 مع PBS سم مكعب 10 مع كولاجيناز، pronase، والدناز من الخطوة 1.1 أعلاه. تكرار مع كل الكبد ¼ المفروم.
  4. أنابيب مكان مع ¼ اللب الكبد المفروم والانزيمات في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة، مع شاكر 1-2 في دورة / الثانية. مسح أنابيب مع الايثانول 70٪ بعد إزالة من حمام الماء قبل نقلها إلى غطاء محرك السيارة تدفق الصفحي.
  5. اكتمال هذا الإجراء في الصفحي هود التدفق. توتر هضمها اللب الكبد من خلال 70 ميكرون تصفية شبكة لجمع في طبق العقيمة. باستخدام 2 مليلتر مأخوذة من DMEM العقيمة: F12 وسائل الاعلام مع 10٪ مصل الحرارة المعطل بقري جنيني، وشطف تصفية واستخدام نهاية مطاط من المكبس حقنة لمزج اللب هضمها من خلال التصفية. كرر 5 مرات لجعل الحجم الكلي للمل حوالي 20 الراشح. تقسيم الترشيح في 2 يساوي أنابيب مل 15.
  6. وينبغي الانتهاء من جميع عمليات نقل في لوس انجليسمينار هود التدفق، واستخدام أجهزة الطرد المركزي المبردة في 4 درجات مئوية إذا كانت متوفرة. أجهزة الطرد المركزي في 50 x ج لمدة 1 دقيقة. حفظ طاف رقم 1 وتجاهل متني بيليه. أجهزة الطرد المركزي طاف رقم 1 في 50 x ج لمدة 1 دقيقة. حفظ طاف رقم 2 وتجاهل بيليه. أجهزة الطرد المركزي طاف رقم 2 في 50 x ج لمدة 1 دقيقة. حفظ طاف رقم 3 وتجاهل بيليه. أجهزة الطرد المركزي طاف النهائي رقم 3 لمدة 180 XG لمدة 8 دقائق للحصول على غير متني الكسر.

2. الأحمر خلية تحلل

العمل في غطاء محرك السيارة تدفق الصفحي، والحفاظ على الخلايا الباردة، وحلول استخدام تبريد إلى 4 ° C.

  1. في الليلة التي سبقت إجراء وإعداد الأحمر العازلة تحلل الخلايا عن طريق تمييع 10X تركيز الأسهم BD فارم ليز العازلة مع التخفيف 1:10 بالماء المقطر المعقم. solutionshould يتم تخزين 1X لمدة 30 يوما في C. ° 4
  2. في الليلة التي سبقت إجراء وإعداد Miltenyi العازلة باستخدام العقيمة PBS، المصل البقري 0.5٪ الزلال، وEDTA 2MM. مرشح الحل باستخدام فلتر فراغوحدة مع فلتر ميكرون 0.45. الغطاء العلوي وحدة مميل مع غطاء من البلاستيك الأصلي وتأمين مع غلاف بلاستيكي. Storeentire تصفية وحدة في 4 درجات مئوية لمدة 12 ساعة للEDTA ديغا. يمكن استبدال وحدة تصفية مع غطاء العقيمة القياسية بعد 12 ساعة.
  3. اكتمال هذا الإجراء في الصفحي هود التدفق. باستخدام أنبوب 5 مل العقيمة، وإعادة تعليق غير متني بيليه من الخطوة 1.6 أعلاه في 1 مل من 1X المخفف العازلة الدم الحمراء تحلل الخلايا من 2.1 أعلاه. سقف الأنبوب لنقل من الصفحي هود التدفق.
  4. دوامة بلطف ل5seconds واحتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية بعيدا عن الضوء.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
  6. اكتمال هذا الإجراء في الصفحي هود التدفق. تجاهل كرات الدم الحمراء lysed في طاف، واعادة تعليق بيليه في 1 مل العازلة Miltenyi الجليد الباردة والعقيمة.
  7. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
  8. اكتمال هذا الإجراء في الصفحي هود التدفق. تجاهل طاف وبيليه اعادة تعليق في 1 مل الباردة الجليد وعقيمةMiltenyi العازلة.
  9. إزالة 10 ميكرولتر من التعليق الخلية PBS وإضافة 10 الزرقاء tryan ميكرولتر. عد remainingnon-متني الخلايا باستخدام عدادة الكريات.

3. CD45 استنفاد الخلايا المكونة للدم من غير متني جزء

العمل في غطاء محرك السيارة تدفق الصفحي، والحفاظ على الخلايا الباردة، وحلول استخدام تبريد إلى 4 ° C.

  1. تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من العازلة Miltenyi في 107 الخلايا تصل إلى 108 خلايا الكلية.
  2. تطبيق 20 ميكرولتر Miltenyi الأجسام المضادة microbead CD45 لكل الخلايا 107 واحتضان في C ° 4 لمدة 15 دقيقة.
  3. إضافة 2 إضافية عازلة Miltenyi مل وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف. اعادة تعليق بيليه الخلية (الي 108 الخلايا الكل) في 1 عازلة Miltenyi مل.
  4. في هود تدفق الصفحي، وخلايا تصفية باستخدام Miltenyi LD العمود المغناطيسي. تبدأ من خلال وضع عمود في حامل المغناطيسي (Miltenyi MidiMACS أو QuadroMACS). وضع معقم أنبوب مل 5 أدناه مرشح للقبض على الترشيح. إعداد العمود عن طريق تحميل 2 مل Milteنيي العازلة.
  5. مرة واحدة قبل تصفية غسيل كاملة، تحميل خلايا على عمود LD. مرة واحدة في التعليق الخلية داخل العمود، إضافة 1 عازلة Miltenyi مل وتكرار 1 مل Miltenyi العازلة غسل 2 مرات إضافية. لا تستخدم الغطاس المقدمة مع عمود لزيادة سرعة الترشيح. فقط بجمع الترشيح عند تصفية في وضعها في حامل المغناطيسي.
  6. أجهزة الطرد المركزي الترشيح التي تم جمعها من حوالي 5 مل (العمود يحمل ما تبقى من 1 مل) من CD45-المنضب الخلايا غير متني في 200 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل العمود مع خلايا CD45 الاحتفاظ إيجابية.

4. تدفق العزلة الخلوي من CD133 الخلايا إيجابية

  1. إعداد وسائل الإعلام خلية بيضاوية. استخدام 01:01 DMEM: F12 المتوسطة مع الحرارة المعطل 10٪ مصل العجل الجنين كقاعدة، وإضافة الأنسولين (1 ميكروغرام / مل)، HEPES (5 مول / لتر)، والبنسلين / الستربتوميسين (1٪ حجم / حجم). مرشح الحل باستخدام وحدة فراغ فلتر مع فلتر ميكرون 0.45.
  2. اعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت Miltenyi في 100 μL في الخلايا 7 10. إضافة 2 ميكرولتر من CD133-PE الأجسام المضادة مترافق. باستخدام مجموعة ثانية من الخلايا، احتضان مع مفتش-PE الأجسام المضادة مترافق كمجموعة تحكم. تحتفظ مجموعة ثالثة من الخلايا دون تلطيخ كعنصر تحكم غير ملوثين لFACS.
  3. احتضان في C ° 4 لمدة 15 دقيقة في الظلام. في 2 مل العازلة تلطيخ إعادة تعليق. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف وبيليه اعادة تعليق في 1 عازلة Miltenyi مل.
  4. ويجري هذه الخطوة باستخدام معيار خلية الإجراءات الخلوي الفرز تدفق، والتي قد تكون محددة المؤسسة. باستخدام الخلايا غير ملوثين ومفتش الخلايا PE الملون، وضبط فرز المعلمات لالنابضة الأمثل من CD133 السكان خلية +. عموما يمكن PE (R-Phytoerythrin) يمكن أن تستخدم مع أي قياس التدفق الخلوي الذي يحتوي على الليزر التي تنبعث في 488 نانومتر. انبعاث الذروة لPE هو 575 نانومتر ويتم الكشف في القناة FL-2.

    ملاحظة: استخدام FACS BD Calibur أو BD آلات FACS الفضل، مع خلية برنامج كويست لجمع البيانات، ونحن نستخدم الأمام Scatteص والجانب الشخصي مبعثر في نطاق السجل لتحديد السكان الخلية، مع مبعثر الجانب لتعيين 250. FL1 وFL2 على حد سواء في نطاق السجل وتعيين إلى 550. هذه المعلمات توفير مكان الأولي بدأت عرض الكبد غير متني الخلايا، ويتم تعديلها حسب الحاجة بناء على تلطيخ كثافة السكان الإيجابية والسلبية.
  5. عزل CD133 السكان خلية + باستخدام CD133 + بوابة وجمع الخلايا في معقمة وسائل الاعلام الخلية التي تمت تصفيتها.

5. طرق خلية ثقافة

  1. FACS أجهزة الطرد المركزي التي جمعت الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق. اعادة تعليق بيليه الخلية في وسائل الإعلام خلية البيضاوي مع نحو 5000 خلية لكل مل. قد تبدأ مع تركيزات أعلى، والخلايا يصل إلى 50،000 / مل للتجارب الأولية، والحد من وتحسن الاسلوب ويحسن عموما بقاء الخلية والعائد.
  2. خلايا لوحة على BD Biocoat Laminin المغلفة 96 لوحات جيدا باستخدام 1000 خلية / سم 2. مكان في ترطيب الخلية الحاضنة الثقافة في C ° 37، مع CO 5٪ 2. بعد 24 ساعة، إضافة الكبدية عامل نمو (50 نانوغرام / NL) وعامل نمو البشرة (20 نانوغرام / مل).
  3. للخلايا واحدة، عزل الخلايا مباشرة في 50 ميكرولتر من وسائل الإعلام في كل خلية البيضاوي جيدا لوحة 96 Laminin جيدا المغلفة. استخدام الخلايا FACS واحدة إعدادات لاختيار صارمة من خلية واحدة فقط إيجابية. بعد 24 ساعة، إضافة 50 ميكرولتر من وسائل الإعلام خلية البيضاوي مع HGF وEGF على النحو الوارد أعلاه في الخطوة 5.2. تغيير وسائل الاعلام بشكل كامل بعد 5-7 أيام.
  4. مرة واحدة المستعمرات توسيع أكبر من 50٪ متموجة، والذي يحدث عادة بعد 2 أسابيع، اعتمادا على العدد الإجمالي للبقاء الخلايا والخلايا مطلي، يمكن تقسيم خلايا 01:03 النحو المبين أدناه.
  5. انقسام الخلايا باستخدام التربسين 0.05٪، EDTA. تطبيق ما يكفي لتغطية الجزء السفلي بشكل جيد، 50-100 ميكرولتر / جيد على 96 لوحة جيدا. مكان في الحاضنة في C ° 37 لمدة 3-5 دقائق.
  6. إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام إلى كل بئر ونقل جميع السائل إلى أنبوب 5 مل. إضافة 1 مل سائل الإعلام إلى كل أنبوب الطرد المركزي في 200 وx ج لمدة 5 دقائق.
  7. اعادة تعليق الخلايا في وسائل الاعلام لوحة طن laminin طبق المغلفة، وذلك باستخدام خلايا من 1 جيد لوحة في آبار جديدة 3 (1:3 نسبة).

6. تأكيد ثنائية محتملة الحالة باستخدام RT-PCR

وترد تفاصيل هذا الإجراء في دليل بروتوكول RNeasy، الذي تم توفيره مع مجموعة RNeasy.

  1. استخدام الأعمدة الدقيقة RNeasy لمدة 96 لوحة جيدا المستعمرات. نضح سائل الإعلام والثقافة من كل بئر. إضافة 75 ميكرولتر العازلة RLT (من مجموعة RNeasy) مباشرة إلى كل بئر. كشط أسفل لوحة مع شرطي المطاط العقيمة. Pipettelysate في الدقيقة أنبوب الطرد المركزي وخليط دوامة لمدة 1 دقيقة. إضافة الإيثانول 70٪ للست] وتخلط بواسطة pipetting.
  2. نقل الحل إلى العمود RNeasy وضعت في أنبوب جمع 2 مل (مرفق كما هو الحال في عدة RNeasy) وأجهزة الطرد المركزي في الدقيقة أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في 10،000 دورة في الدقيقة. تجاهل مزال الترشيح.
  3. إعادة استخدام أنبوب جمع. إضافة 350 ميكرولتر العازلة RW1 (كيت RNeasy) إلى العمود RNeasy وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في 10،000 دورة في الدقيقة لغسل العمودالغشاء. تجاهل غسل مزال.
  4. إضافة 10 ميكرولتر الأسهم I الدناز الحل إلى 70 ميكرولتر العازلة RDD (سواء في توفير أدوات RNeasy). إضافة ال 80 ميكرولتر الدناز I الحضانة RDD العازلة مزيج لغشاء العمود RNeasy واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. إضافة 350 ميكرولتر العازلة RW1 (طقم RNeasy) إلى العمود RNeasy وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في 10،000 دورة في الدقيقة لغسل الغشاء. تجاهل غسل مزال وأنبوب جمع.
  6. وضع العمود RNeasy في أنبوب جمع 2 الجديدة مل (مرفق في عدة RNeasy). إضافة 500 ميكرولتر العازلة RPE (كيت RNeasy) إلى العمود RNeasy وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في 10،000 دورة في الدقيقة لغسل الغشاء. تجاهل غسل مزال.
  7. إعداد الايثانول 80٪ باستخدام ريبونوكلياز خالية الماء (كيت RNeasy). إضافة 500 ميكرولتر من الايثانول 80٪ إلى أجهزة الطرد المركزي columnand RNeasy لمدة 2 دقيقة في 10،000 دورة في الدقيقة. تجاهل غسل مزال.
  8. وضع العمود RNeasy في أنبوب جمع 2 الجديدة مل (كيت RNeasy) وبأقصى سرعة أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق. تجاهل أي غسل مزال والعقيدفصل من الكتاب المقدس الأنبوب.
  9. وضع العمود RNeasy في أنبوب جمع 1،5 الجديدة مل (طقم RNeasy). اضافة 14 ميكرولتر ريبونوكلياز خالية الماء (كيت RNeasy) إلى مركز للغشاء العمود وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة بأقصى سرعة. جمع الراشح مع RNA تنقية ونقل إلى جليد إذا خلق [كدنا] فورا أو تخزينها في ناقص 80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
  10. عكس النسخ باستخدام Omniscript.Dilute ريبونوكلياز المانع لتركيز النهائي من 10 وحدات / ميكرولتر في الجليد الباردة العازلة RT 1X. دوامة لمدة 5 ثوان، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 ثوان نبض. إعداد مزيج الرئيسي على الجليد جديدة وفقا لصفحة 13 من بروتوكول Omniscript. دوامة لمدة 5 ثوان، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 ثوان نبض. يوصي بإعداد حجم mastermix 10٪ أكبر من تلك المطلوبة لإجمالي التمويل المطلوب لجميع ردود الفعل.
  11. إضافة RNA القالب إلى أنابيب تحتوي على مزيج الفردية الرئيسي. دوامة لمدة 5 ثوان، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 ثوان نبض. احتضان لمدة 60 دقيقة عند 37 ° C.
  12. PCR التضخيم من الكبدية(الزلال) وباستخدام جينات معينة cholangiocyte HotStarTaq البلمرة DNA. إعداد مزيج رد فعل في كل صفحة 15 من كتاب بروتوكول HotStarTaq. يوصي تمييع الاشعال الأسهم إلى تركيز من 20 مساء / ميكرولتر، مع أنبوب وميكرولتر / 1 رد فعل المستخدمة في الاشعال إلى الأمام والعكس. اعتمادا على عدد من الخلايا المستخدمة في البداية لاستخراج الحمض النووي الريبي، نوصي بتقسيم النهائي بين [كدنا] أنابيب رد فعل 3 (β-الأكتين لتحميل السيطرة، الزلال، وKRT19) للبدء.
  13. يتم سرد PCR تصميم التمهيدي في الجدول 1.
  14. وضع أنابيب في thermocycler رد فعل. يوصي البرنامج التالي للتجارب الأولية: 95 ° Cfor 15 دقيقة × 1 دورة تليها 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية × 35 دورات، تليها 72 ° C لمدة 10 دقيقة.
  15. ويتم تحليل PCR باستخدام المنتجات بروميد إيثيديوم مشربة الاغاروز هلام.

7. تأكيد المحتملة من الورم CD133 + الخلايا الجذعية

  1. يمكن هذا الإجراءأن يتم عزل الخلايا مع طازجة من الخطوة 4 أو باستخدام الخلايا التي تم زرعها انطلاقا من الخطوة 5. نوصي إجراء التجارب الأولية مع الخلايا المستزرعة، كما ستنخفض عزل الخلايا كما طازجة الجدوى والعائد المنخفض.
  2. يعرض للتريبسين الخلايا باستخدام التربسين 0.05٪ EDTA-من الخطوة 5.5 أعلاه. بعد 3-5 دقائق في الحضانة C ° 37، إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام إلى كل بئر ونقل جميع السائل من كل بئر إلى الفردية أنابيب مل 5 (1 = 1 أنبوب جيدا). إضافة 1 مل سائل الإعلام إلى كل أنبوب الطرد المركزي في 200 وx ج لمدة 5 دقائق.
  3. اعادة تعليق الخلايا في 1 مل الجليد الباردة PBS. إزالة 10 ميكرولتر من التعليق الخلية PBS وإضافة 10 ميكرولتر التريبان الأزرق. باستخدام الاستبعاد التريبان الأزرق، وتحديد عدد الخلايا الحية. إذا باستخدام الخلايا FACS معزولة، سيتم تحديد عدد الخلايا عن طريق العد العزلة FACS.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 200 XG الخلايا لمدة 5 دقائق وإعادة معلقة في PBS بتركيز 1 × 10 6 ميكرولتر cells/100 الحية. إضافة 100 ميكرولتر Matrigel. ستة أسابيع من العمر تعاني من نقص المناعة النودتم حقن الفئران تحت الجلد باستخدام البريد 28 إبرة gague. حقن 1 × 10 6 خلايا في 200 ميكرولتر لكل موقع.
  5. يتم مراقبة الفئران لنمو الورم يوميا. مرة واحدة الأورام تشكيل، وعادة بعد 3-4 أسابيع الحضانة، يتم قياس حجم الورم باستخدام الفرجار (ارتفاع عرض طول X X).

8. ممثل النتائج:

من الكبد طبيعية صحية، الفئران، والعائد المتوقع من CD133 + الخلوية الخلايا الجذعية الكبد هو 1،000 إلى 5،000 في الكبد. هذه الخلايا هي نادرة نسبيا في الكبد وهادئة لن توسيع جيدا في الثقافة. لا نوصي باستخدام واحد على تحليل الخلية الكبد طبيعية والعائد من خلايا قابلة للحياة من شأنها توسيع نطاق منخفض للغاية.

لكبد مزمن مع إصابة كبيرة، مثل النظام الغذائي DDC 0.1٪ لمدة 6 أسابيع 1 أو التعديل الوراثي يؤدي إلى الإصابة المزمنة، مثل MAT1a - / - أو PTEN الكبد محددة - / - الفئران، 2-4 للعدد المتوقع من سلزيادات ليرة سورية معزولة، مع ما يصل إلى 100،000 الخلايا المعزولة / الكبد (الشكل 2). إذا باستخدام نماذج الوراثية والمعارف من معدل الورم عفوية أمر بالغ الأهمية، وينبغي أن تجري هذه الإجراءات لعزل الخلايا الجذعية الكبد في الحيوانات مجانا الورم. على سبيل المثال، إذا كان MAT1a - / - نموذج أشكال الأورام العفوية في 18 شهرا، ونحن نوصي باستخدام الحيوانات في موعد لا يتجاوز 15-16 شهرا، قبل أي أورام عفوية المبلغ عنها.

وعزل الخلايا واحد من النماذج الإصابة المزمنة تسفر عدة مستعمرات (3-9 colonies/96 لوحة أيضا) التي تعمل على توسيع الخلايا واحد من مرة واحدة ويتقن الداخلي، ويتم ضمان بقاء الخلية. الشكل 3 المرحلة الحالية على النقيض ممثل الصور من المستعمرات المستمدة من الخلايا واحدة + CD133 توسيع بعد 7 أيام.

ويجري التأكيد على ثنائية محتملة الحالة باستخدام الزلال وKrt19 RT-PCR. سوف المستعمرات واحدة من الخلايا الموسع إظهار كل تعبير عن علامات خلايا الكبد (آلbumin) وcholangiocytes (Krt19). الشكل 4 يوضح ثنائية محتملة التعبير من ثلاثة مستعمرات معزولة، مع ما يقرب من 25 خلية / مستعمرة في 7 أيام.

CD133 + الخلايا الجذعية من الكبد طبيعية والتي يسببها كيميائيا اصابة الكبد (مثل النظام الغذائي DDC 0.1٪ لمدة 6 أسابيع) لن تشكل الأورام في الفئران عارية. CD133 + الخلايا الجذعية من نماذج جينية محددة (MAT1a - / - أو PTEN الكبد محددة - / - الفئران) ستشكل الأورام في الفئران عارية إذا عزل في وقت متأخر من مساء الورم قبل مرحلة الإصابة المزمنة. يتم تعريف هذا النمط الظاهري حاليا تشكيل مثل الورم لسرطان الخلايا الجذعية من 2-4 سبيل المثال، MAT1a - / - الفئران تشكل أورام الكبد عفوية في 18 أسابيع من العمر. سوف CD133 + الخلايا الجذعية الكبد معزولة في 15-16 أسابيع، وخلال مرحلة الإصابة المزمنة في وقت متأخر من أمراض الكبد، وتشكيل الأورام في الفئران عارية. يوضح الشكل 5 الأورام ممثل من حقن الخلايا الثنائية من 1 6 10 X توسعت في المختبر من خلايا واحد + CD133 الجذعية الكبدق.

جينة إلى الأمام التمهيدي عكس التمهيدي
β-أكتين 5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3 ' 5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3 '
الألبومين 5'-CATGCCAAATTAGTGCAGGA-3 ' 5'-GCTGGGGTTGTCATCTTTGT-3 '
الكيراتين 19 5'-TGCTGGATGAGCTGACTCTG-3 ' 5'-AATCCACCTCCACACTGACC-3 '

الجدول 1: تصميم التمهيدي لRT-PCR

الشكل 1
الشكل 1: التخطيطي الإجمالي للطرق.

الشكل 2
الشكل 2: CD133 + الخلايا الجذعية التي تم تحديدها في الكبد عالية التخصيب CD45 جزء غير متني المنضب الكبد من نوع لم يصب تحكم البرية. الفئران يوضح CD133 + 0.4٪ داخل خلايا CD45 عالي التخصيب جزء غير متني المنضب. الجينية في ضرب المغادرة MAT1a - / -، والذي هو نموذج للإصابة الكبد المزمن، والسكان CD133 توسع 10 أضعاف أو أكثر في نفس الكسر عالي التخصيب.

الشكل 3
الشكل 3: توسيع المستعمرات واحد من الحيوانات المستنسخة + CD133 المرحلة على النقيض من أربعة المستعمرات الصور المستمدة من الخلايا واحدة + CD133 توسيع على لوحات laminin 96 المغلفة جيدا.

الشكل 4
الشكل 4: نصف المحتملة التعبير الجيني من CD133 + الخلايا الجذعية الكبد المستعمرات توسيع clonally في يوم 7، والمستعمرات هي حوالي 25 الخلايا. التعبير الجيني يوضح التعبير عن علامة علامة الكبدية الزلال وcholangiocyte Krt19، مؤكدا ثنائية محتملة حالة الخلايا CD133 +.

ve_content "> الشكل 5
الرقم 5: CD133 + الخلايا الجذعية الكبد تشكيل الأورام في الفئران عارية سهام تشير إلى تزايد الأورام 4 أسابيع بعد 1x10 6 خلايا CD133 + حقن من MAT1a - / - نموذج. CD133 + الخلايا من السموم التي يسببها اصابة الكبد المزمنة، مثل لجنة علم المناخ 4 أو 0.1٪ النظام الغذائي DDC، لا تشكل الأورام. ويستخدم لتحديد تكوين الأورام الخبيثة المحتملة، أو النمط الظاهري سرطان الخلايا الجذعية داخل الخلية الجذعية السكان.

Discussion

وخلافا للنظام المكونة للدم، والخلايا الجذعية المكونة للدم والتي هي المسؤولة عن الحفاظ على نظام تمايز الخلايا التي replacesnormal الفسيولوجية تسليم أكثر من الكريات البيض، وخلايا الدم الحمراء، والصفائح الدموية والكبد الخلايا الجذعية، أو الخلايا الاصلية الكبار الكبد، لا تشارك في الكبد طبيعية التوازن. 5،6 بعد اصابة الكبد الحاد أو استئصال الكبد الجزئي، خلايا الكبد، والكبد ظهارة متباينة، والخضوع عدة جولات من الانتشار الشامل لتحل محل الكبد المفقودة. 5،6 فقط خلال الإصابة المزمنة هي الخلايا الجذعية الكبد لوحظ في الانتشار. 1،5 وتقترح هذه -11 الكبار، وخلايا جذعية محددة الجهاز على التمايز إلى خلايا الكبد على حد سواء وcholangiocytes. 1،5-8 ومن المثير للاهتمام، أن الغالبية العظمى من سرطان الكبد يتطور على خلفية إصابة مزمنة، وبالتالي يتم الافتراض أيضا الخلايا الجذعية لتكون الكبد السلائف لمجموعة فرعية من سرطان الكبد. 2-4،12-17

Oشمال شرق التحديات كبيرة لوقف العمل في خلية الكبد هو عزل السكان نادرة من الخلايا لتحليل وظيفي. على سبيل المثال، فإن الغالبية العظمى من الخلايا في الكبد هي خلايا الكبد، والتي هي أكبر بكثير من cholangiocytes وأصغر الخلايا الأخرى غير متني. عن طريق كسر الكبد كله الى حجرات خلية (خلايا الكبد كبيرة - جزء متني وأصغر الخلايا - غير متني آسر)، وأخرى لاختيار الخلايا CD45 السلبية (غير المكونة للدم الخلايا)، ونحن قادرون على إثراء السكان بدءا من الخلايا الجذعية أكثر من مرة-600. 1،18-21 وتجدر الإشارة، ونحن بأي حال من الأحوال مشيرا إلى أن السكان + CD133 هو 100٪ نقية الخلايا الجذعية السكان، لكنها تمثل بوضوح السكان غير متجانسة من الخلايا، مع نسب مختلفة وإمكانية إعادة تعمير. واحدة من العوائق الرئيسية الحقل هو تعريف الخلايا الجذعية والخلايا الاولية. نستخدم مصطلح "الخلايا الجذعية" على نطاق أوسع في هذا العمل، ولكن في التعريف الدقيق، CD133 + غير parenc- الخلايا hymal تمثل السكان السلف ثنائية النسب. نظرا لحالة الجذعية الحالية والبحوث السلف في الكبد، فإن هذا التقرير لا توفر مكان انطلاق لالمحققين الذين يهتمون في هذا المجال. كما يمكن علامات جديدة تظهر، مثل EpCAM، أو 22،23 عوامل النسخ، مثل Sox9، 24 إدراجها. على سبيل المثال، وجدنا نسبة عالية إلى حد ما من التداخل بين الخلايا والخلايا + + EpCAM CD133.

في هذا التقرير، إلا أننا التفاصيل عملية لعزل الخلايا الجذعية من الكبد الفئران العادية وكذلك نماذج اصابة الكبد المزمنة، التي تبين زيادة انتشار الكبد الخلايا الجذعية. هذا الأسلوب له مزايا واضحة على مستوى الكبد المناعية الثابتة المجمدة أو الفورمالين كما يمكن إجراء الدراسات الفنية باستخدام الخلايا الحية بعد العزلة. 1،3،4 الهدف المحدد لهذه العملية هو عزل السكان نقية نسبيا من الخلايا الجذعية التي يمكن أن الكبد يمكن توسيع clonally في المختبر.

معشوقة = "jove_content"> والقيد الرئيسي لهذا الإجراء هو أن غالبية خلايا معزولة لن تكون قابلة للحياة بعد التدفق الخلوي (انظر القسم المتاعب رماية). هذا هو نتيجة لساعات اللازمة لإعداد الخلايا، والإجراءات اللازمة لصقل العديد من السكان قبل العزلة. إذا هضم الكبد في تعليق خلية واحدة لتحليل FACS الفوري، والفرق بين حجم خلايا الكبد وخلايا أخرى غير متني تفعيل إنشاء بوابة FACS مستحيلا. إذا تستخدم الكبد غير متني الخلايا، دون القضاء على الخلايا المكونة للدم، وهناك خطر يتمثل في أن عددا كبيرا من الخلايا CD133 + قد تكون ذات المنشأ المكونة للدم قد تلوث الكسر. وعلاوة على ذلك، عن طريق معالجة خلايا من خلال تصفية Miltenyi، يتم جمع الخلايا فقط واحد ومجموعات صغيرة جدا من الخلايا. وهذا يضمن أن العينة لن تسد الإبرة تناول FACS.

بدائل لهذا الإجراء تشمل مodification لأي علامة الخلية السطحية البديلة، مثل CD49f، EpCAM، أو مزيج من علامات، مثل CD133 + + A EpCAM نشر التقرير الثاني يستخدم التدرج الكثافة لعزل الخلايا الجذعية من الكبد جزء غير متني. هذا الإجراء يتطلب وجود أجهزة الطرد المركزي فائقة (8000 XG)، ويضيف وقتا كبيرا لهذا الإجراء، وتجربتنا، انخفاضا كبيرا قبل FACS العائد الخلوية وقدرتها على البقاء بعد FACS .. 8

التجارب في المستقبل تشمل مجموعة أوسع من تحليل التعبير الجيني، بما في ذلك الجينات الكبد الجنين، مثل HNF3، HNF4α، وبالإضافة إلى ذلك αfp.In، تحليل لطخة غربية ويمكن استخدامها كيمياء سيتولوجية مناعية للبروتينات وأعرب لتأكيد RT-PCR النتائج من الخلايا في الثقافة.

قضية واحدة هو أن نلاحظ أن الأعمال الأخيرة التي تم تحديدها CD133 التعبير على الخلايا النجمية الكبدية 25 ونحن الآن فحص روتيني لدينا عينات من علامات الخلايا النجمية (انظر القسم المتاعب الرماية)، وليس لديها معرفentified تلوث كبير في الكسور لدينا. قد يكون ذلك متعلقا تقنيات مختلفة من الهضم الكبد والعزلة الخلية. 2،3،26

استنادا إلى حقيقة أن غالبية الخلايا لن تكون قابلة للحياة على الفور بعد العزلة FACS، من المستحسن أن تكون الخلايا مطلي، إما معظم الخلايا CD133 + أو الخلايا واحدة، قبل استخدامها في الحيوانات. سوف 5-7 أيام في المختبر تحسن إلى حد كبير نتائج تحليل الورم. وبالإضافة إلى ذلك، وبالنظر إلى قسوة العزلة خلية واحدة، ينبغي أن تجرى إلا مرة واحدة هذا ويمكن توسيع المستعمرات من CD133 + جل الخلايا المعزولة. وقد تم مناقشة أشمل لمختلف الظروف الثقافة والبروتينات التي يمكن أن سقالة تستخدم لالجذعية الكبد الثقافة والخلايا الاصلية تتميز بشكل جيد من قبل لولا ريد. هذا العمل يوفر الظروف البديلة والتعديلات التي قد المحققين يدرج في برنامج أبحاثهم بمجرد يتقن تقنيات عزل الأساسية. 27،28 د. ريد العك كما يوفر تحليلا أكثر تفصيلا لعلم الأحياء ونسب نضوج الخلايا الجذعية بين الكبد والأسلاف ملتزمة.

من حيث تحليل الورم في الجسم الحي، ونحن حققنا نجاحا باستخدام الخلايا المعزولة حديثا والخلايا من الخلايا توسيع clonally + CD133 في المختبر، وذلك باستخدام أساسا 1x10 6 خلايا. فقد ركزنا سلالات ontwo الوراثية للإصابة الكبد المزمن، وMAT1a - / - وPTEN الكبد محددة - / - الفئران، ونحن على حد سواء استخدمت الفئران عارية والبرية من نوع الفئران باعتبارها الدولة المضيفة لنمو الورم. في تجربتنا، فإن CD133 + الجذعية الكبد الخلايا تشكل الأورام فقط إذا تم عزلها من النماذج الهامة التي هي إصابة الكبد قبل الخبيثة. لاحظ أن الأورام يتكون من خلايا CD133 + العامة على حد سواء سرطان الكبد سرطانة الأوعية الصفراوية والميزات، مما يشير إلى الخلايا الجذعية أو خلايا المنشأ السلف إلى أورام. 2-4،29

يتم توثيق أعمال المتابعة بعد أورام incluقصر معيار تحليل أنسجة الورم مرضية من (H & E تلطيخ) وتلطيخ المناعى. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن مفروم الأورام وهضمها لتحليل FACS أو إعادة الثقافة. 2-4،30

في الختام، لقد فصلنا إجراء لعزل وتوسيع وتوصيف CD133 + الأساسية للخلايا الجذعية الكبد وCD133 + الخلايا الجذعية السرطانية.

متاعب إطلاق النار:

CD45 التلوث:

لخطوة 3، إذا كان هناك تلوث من الخلايا + CD45، والتي يمكن تقييمها من خلال إضافة آب CD45-FITC قبل FACS تحليل والعزلة، تحقق لضمان عدم صلاحية الأجسام المضادة microbead CD45 والتي تم تجميعها في الترشيح في حين فقط وكان مرشح في حامل المغناطيسي. أي جمع الراشح في حين أن المرشح هو ليس في حامل المغناطيسي سوف تحتوي على خلايا CD45 +.

انخفاض الخلية رقم:

للكبد لم يصب، ومجموع numbeقد ص CD133 + من غير معزولة متني يكون أقل من 10،000. هذه الخلايا هي نادرة في الكبد هادئة. لنموذج إصابة مزمنة، مثل اتباع نظام غذائي DDC 0.1٪، وزيادة عدد الخلايا إلى حد كبير إلى 100،000. إذا كان عدد الخلايا الإجمالي أقل بكثير هذه الأرقام، قضية واحدة للنظر هو تلطيخ أب FACS. تحقق لضمان عدم صلاحية أب CD133، وتلطيخ الفقراء سيؤدي إلى العائد الفقراء. أيضا، نوصي بإجراء تحليل FACS من الخلايا غير متني الكبد لتحديد السكان النسبي قبل محاولة FACS العزلة.

انخفاض بقاء الخلية بعد FACS:

قد تكون ذات صلة واحدة من القضايا ذات جدوى لكيفية معالجة الخلايا وأكثر من أي وقت من الناحية المثالية، ينبغي أن تتم بمعزل الخلية بأكملها الداخلي، الخطوات 1-4، دون أي تأخير بين الخطوات ويتم الانتهاء منها في نفس اليوم. فإن أي تأخير كبير بين الخطوات 1-4 يقلل كثيرا من بقاء الخلية. المسألة الثانية تتعلق جقد تكون ذات صلة الجدوى الذراع لضغوط غمد تستخدم لعزل FACS. نوصي باستخدام خفض ضغط غمد. وأخيرا، مرة واحدة يتم عزل الخلايا، ينبغي أن تكون مطلية على الفور، لأن أي تخزين كبيرة على الجليد بعد الفرز سوف يقلل أيضا قدرتها على البقاء.

CD133 + غير متني عدم التجانس:

التقارير الأخيرة تشير إلى أن الخلايا النجمية الكبدية قد يكون لها أيضا CD133 التعبير وبعض اللدونة 25 لذلك، بالإضافة إلى التحقق من فاعلية الجينات ثنائية مع التحقق، والزلال Krt19 إضافية يمكن أن تشمل الجينات المرتبطة الخلايا النجمية، مثل البروتين ييفي الحمضية الدبقية في الخلايا النجمية هادئة وسلسة ألفا أكتين العضلات والخلايا النجمية في desmin المنشط. 3،4،26 وبالإضافة إلى ذلك، فإن عدد سكان + CD133 يمثل السكان أوسع السلف. إن إضافة علامة ثانية، مثل EpCAM، وتساعد على صقل المزيد من السكان، وعدم التجانس الحد.

Disclosures

الدكتور Rountree يتلقى الدعم من المستحضرات الصيدلانية باير البحوث. دائرة الاستعلام والأمن. قرع والمحتالون والسيدة دانغ وVanKirk السيدة ليس لديهم الكشف عن أن يقدم.

Acknowledgments

الدكتور Rountree يعترف الدعم الحالي من شبكة معجزة الأطفال، المعهد الوطني للصحة، وK08DK080928 R03DK088013، والجمعية الأميركية للسرطان بحوث جائزة الباحث، MGO-11651. الدكتور Rountree يعترف التي تم تطويرها في البداية هذا الإجراء وصقلها في حين تمول من برنامج عالم الأطفال التنمية (معاهد الصحة القومية منح جائزة K12-HD00850).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM:F12 Invitrogen 10565-018 With phenol red
CD45 microbeads Miltenyi Biotec 130-052-301
Hepatocyte Growth Factor Sigma-Aldrich H1404
Epidermal Growth Factor Sigma-Aldrich E4127
DNase Sigma-Aldrich DN25 1 gram
Collagenase D Roche Group 1088874
Pronase Roche Group 0165921
70 micron mesh strainer Fisher Scientific 352350
Omniscript RT Qiagen 205111 50 reactions
HotStarTaq Qiagen 203203
Miltenyi LD column Miltenyi Biotec 130-042-901
CD133-PE FACS Ab eBioscience 12-1331-82
Laminin coated plates BD Biosciences 354410 96 well
Trypsin 0.05% EDTA Invitrogen 25300-354 100 mL
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 50 columns for 5x105 cells or less
Pharm Lyse BD Biosciences 555899 10X concentration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rountree, C. B. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential. Stem Cells. 25, 2419-2429 (2007).
  2. Ding, W. CD133+ liver cancer stem cells from methionine adenosyl transferase 1A-deficient mice demonstrate resistance to transforming growth factor (TGF)-beta-induced apoptosis. Hepatology. 49, 1277-1286 (2009).
  3. Rountree, C. B., Ding, W., He, L., Stiles, B. Expansion of CD133-expressing liver cancer stem cells in liver-specific phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10-deleted mice. Stem Cells. 27, 290-299 (2009).
  4. Rountree, C. B., Senadheera, S., Mato, J. M., Crooks, G. M., Lu, S. C. Expansion of liver cancer stem cells during aging in methionine adenosyltransferase 1A-deficient mice. Hepatology. 47, 1288-1297 (2008).
  5. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J. Cell. Physiol. 213, 286-300 (2007).
  6. Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. Liver regeneration. Hepatology. 43, 45-53 (2006).
  7. Theise, N. D. Gastrointestinal Stem Cells. III. Emergent themes of liver stem cell biology: niche, quiescence, self-renewal, and plasticity. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 290, 189-193 (2006).
  8. Wang, X. The origin and liver repopulating capacity of murine oval cells. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 100, 11881-11888 (2003).
  9. Greenbaum, L. E., Wells, R. G. The role of stem cells in liver repair and fibrosis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 222-229 (2011).
  10. Choi, S. S., Omenetti, A., Syn, W. K., Diehl, A. M. The role of Hedgehog signaling in fibrogenic liver repair. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 43, 238-244 (2011).
  11. Khurana, S. Scopolamine treatment and muscarinic receptor subtype-3 gene ablation augment azoxymethane-induced murine liver injury. J. Pharmacol. Exp. Ther. 333, 639-649 (2010).
  12. Sell, S., Leffert, H. L. Liver cancer stem cells. J. Clin. Oncol. 26, 2800-2805 (2008).
  13. Lee, J. S. A novel prognostic subtype of human hepatocellular carcinoma derived from hepatic progenitor cells. Nat. Med. 12, 410-416 (2006).
  14. Sell, S., Dunsford, H. A. Evidence for the stem cell origin of hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma. Am. J. Pathol. 134, 1347-1363 (1989).
  15. Amin, R., Mishra, L. Liver stem cells and tgf-Beta in hepatic carcinogenesis. Gastrointest Cancer Res. 2, 27-30 (2008).
  16. Tang, Y. Progenitor/stem cells give rise to liver cancer due to aberrant TGF-beta and IL-6 signaling. Proc Natl Acad Sci. 105, 2445-2450 (2008).
  17. Kitisin, K., Pishvaian, M. J., Johnson, L. B., Mishra, L. Liver stem cells and molecular signaling pathways in hepatocellular carcinoma. Gastrointest Cancer Res. 1, 13-21 (2007).
  18. Rountree, C. B. Bone marrow fails to differentiate into liver epithelium during murine development and regeneration. Hepatology. 45, 1250-1260 (2007).
  19. Shimano, K. Hepatic oval cells have the side population phenotype defined by expression of ATP-binding cassette transporter ABCG2/BCRP1. Am J Pathol. 163, 3-9 (2003).
  20. Suzuki, A. Flow cytometric isolation and clonal identification of self-renewing bipotent hepatic progenitor cells in adult mouse liver. Hepatology. , (2008).
  21. Suzuki, A. Clonal identification and characterization of self-renewing pluripotent stem cells in the developing liver. J Cell Biol. 156, 173-184 (2002).
  22. Yamashita, T. EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features. Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).
  23. Yamashita, T., Budhu, A., Forgues, M., Wang, X. W. Activation of hepatic stem cell marker EpCAM by Wnt-beta-catenin signaling in hepatocellular carcinoma. Cancer Res. 67, 10831-10839 (2007).
  24. Furuyama, K. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43, 34-41 (2011).
  25. Kordes, C. CD133+ hepatic stellate cells are progenitor cells. Biochem Biophys Res Commun. 352, 410-417 (2007).
  26. Berg, T. Fibroblast Growth Factor 10 is critical for liver growth during embryogenesis and controls of hepatoblast survival via b-catenin activation. Hepatology. , (2007).
  27. Turner, R. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology. Hepatology. 53, 1035-1045 (2011).
  28. Wang, Y. Lineage restriction of human hepatic stem cells to mature fates is made efficient by tissue-specific biomatrix scaffolds. Hepatology. 53, 293-305 (2011).
  29. Galicia, V. A. Expansion of hepatic tumor progenitor cells in Pten-null mice requires liver injury and is reversed by loss of AKT2. Gastroenterology. 139, 2170-2182 (2010).
  30. Ding, W. Epithelial-to-mesenchymal transition of murine liver tumor cells promotes invasion. Hepatology. 52, 945-953 (2010).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 56، CD133 والكبد الخلايا الجذعية، الخلايا البيضاوي، الخلية الجذعية السرطانية في الكبد والخلايا الجذعية، والعزلة الخلية، غير متني جزء من الكبد، التدفق الخلوي
عزل CD133 خلايا + الجذعية الكبد للتوسع نسيلي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., … More

Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., VanKirk, C., Crooks, G. M. Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion. J. Vis. Exp. (56), e3183, doi:10.3791/3183 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter