Summary
Här beskriver vi isolering av CD133 uttrycker leverstamceller och cancer stamceller från hela murina lever, en process som kräver vävnads matsmältning, celler anrikning och flödescytometri isolering. Vi inkluderar metoder för avancerad enda cell isolering och klonal expansion.
Abstract
Lever stamceller eller ovala celler, föröka vid kronisk leverskada och föreslås differentieras till både hepatocyter och cholangiocytes. Dessutom, är levern stamceller hypotes att vara prekursorer för en delmängd av levercancer, hepatocellulärt karcinom. En av de viktigaste utmaningarna för att stamceller arbete i fast organ som levern är isoleringen av en sällsynt population av celler för detaljerad analys. Till exempel, den stora majoriteten av celler i levern är hepatocyter (parenkymal fraktion), som är väsentligt större än icke-parenkymala celler. Genom att berika de specifika cellulära utrymmen i levern (dvs. parenkymal och icke-parenkymala fraktioner), och selektera för CD45-negativa celler, kan vi berika utgångspopulation av stamceller med över 600-fold.The proceduresdetailed i denna rapport tillåter en relativt sällsynt population av celler från en fast organ som skall sorteras effektivt. Denna process kan användas för att isolateliver stamceller från normala murina lever samt kroniska lever modeller skada, som visar ökad lever spridning stamceller. Denna metod har klara fördelar jämfört med vanliga immunohistokemi av frysta eller formalinfixerade lever som funktionella studier med levande celler kan utföras efter första samlokalisering experiment. För att åstadkomma det förfarande som beskrivs i denna rapport är ett samarbete med en forskningsbaserad flödescytometri kärna uppmuntras som detaljerna i FACS isolering är starkt beroende av inrättningar och goda kunskaper om grundläggande flödescytometri förfaranden. Det särskilda målet med denna process är att isolera en population av leverstamceller som kan klonalt expanderade in vitro.
Protocol
Alla lösningar, media, instrument, filter och rör bör vara steril och hanteras med steril teknik för att minska risken för kontaminering. Förbered alla buffertar och medier 24 timmar i förväg och förvara vid 4 ° C.
1. Parenkymal och icke-parenkymal separation från hela lever
- Bered enzymlösningen för digerering med hjälp av en 15 cc rör med skruvlock i 10 ml steril PBS innehållande 5 mg kollagenas, 5 mg pronas, och 1 mg DNas.
- Avliva musen med som godkänts (Institutional Animal Care och användning kommittén) metod såsom CO 2 kvävning. Torka buken av euthanized djur med 70% etanol-lösning. Med hjälp av sterila instrument, öppna bukhålan och explantat lever en-blocket. Ta gallblåsa från explanterade lever. Överför hela levern till laminärt flöde huva i slutna sterila skålen.
- Detta förfarande är klar i ett laminärt flöde huva. Använd en steril rakblad, finhacka lever medkombination av flera horisontella och vertikala skärningar för 1 minut i steril skål. Plats ¼ av malet lever massa 15 cc rör med 10 ml PBS med kollagenas, pronas och DNAs från steg 1,1 ovan. Upprepa med varje ¼ malet lever.
- Placera rören med ¼ malet lever massa och enzymer i vattenbad vid 37 ° C under 45 minuter, med skakare vid 1-2 cykler / sekund. Torka rören med 70% etanol efter avlägsnande från vattenbad före överföring till huv med laminärt flöde.
- Detta förfarande är klar i ett laminärt flöde huva. Sila ned lever massa genom 70 mikron nätfilter för att samla i en steril skål. Använda 2 ml alikvoter av steril DMEM: F12 media med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum, skölj filtret och använda gummi änden av en sprutkolven till mosa kokad massa genom filtret. Upprepa 5 gånger för att göra den totala volymen av filtrat approximativt 20 ml. Dela upp filtratet i 2 lika 15 ml rör.
- Alla överföringar skall fyllas i laMinar dragskåp och använda kyld centrifug vid 4 ° C om tillgänglig. Centrifugera vid 50 x g under 1 minut. Spara supernatanten # 1 och kasta parenkymala pellet. Centrifugera supernatanten # 1 vid 50 x g under 1 minut. Spara supernatanten # 2 och kassera pellet. Centrifugera supernatanten # 2 vid 50 x g under 1 minut. Spara supernatanten # 3 och kassera pellet. Centrifugera slutliga supernatanten # 3 för 180 xg under 8 minuter att få icke-parenkymal fraktionen.
2. Röda cellys
Arbete i huv med laminärt flöde, hålla cellerna kall, och användningslösningar kyldes till 4 ° C.
- Natten innan proceduren, förbereda röda buffert cellys genom att späda 10x koncentration lager BD Pharm Lyse buffert med en 1:10 spädning med sterilt destillerat vatten. 1X solutionshould lagras i 30 dagar vid 4 ° C.
- Natten innan proceduren, förbereda Miltenyi buffert med steril PBS, 0,5% bovint serumalbumin och 2 mM EDTA. Filter lösning med vakuumfilterenhet med 0,45 mikron filter. Omslag toppen av vipporganet enhet med ursprunglig plastlock och säkra med plastfolie. Storeentire filterenheten vid 4 ° C under 12 timmar till avgasa EDTA. Filterenhet kan ersättas med vanlig steril lock efter 12 timmar.
- Detta förfarande är klar i ett laminärt flöde huva. Med användning av en 5 ml sterilt rör, återsuspendera icke-parenkymal pelleten från steg 1,6 ovan i 1 ml 1X utspädda röda blodkroppar lysbuffert från 2,1 ovan. Förslut röret för överföring från laminärt flöde huva.
- Vortexa försiktigt för 5seconds och inkubera 15 minuter vid 4 ° C skyddat från ljus.
- Centrifugera vid 200 x g under 5 minuter.
- Detta förfarande är klar i ett laminärt flöde huva. Kasta lyserade RBC i supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml iskall och steril Miltenyi buffert.
- Centrifugera vid 200 x g under 5 minuter.
- Detta förfarande är klar i ett laminärt flöde huva. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml iskall och sterilaMiltenyi-buffert.
- Ta 10 pl PBS cellsuspension och tillsätt 10 ul Tryan blå. Räkna remainingnon-parenkymceller med hemocytometer.
3. CD45 hematopoetiska celler utarmning av icke-parenkymal fraktion
Arbete i huv med laminärt flöde, hålla cellerna kall, och användningslösningar kyldes till 4 ° C.
- Suspendera cellerna i 100 mikroliter av Miltenyi-buffert per 107 celler upp till 108 totala celler.
- Applicera 20 mikroliter Miltenyi CD45 mikrokorn antikropp för varje 107-celler och inkubera vid 4 ° C under 15 minuter.
- Tillsätt ytterligare 2 ml Miltenyi-buffert och centrifugera vid 200 xg under 5 minuter. Avlägsna supernatanten. Återsuspendera cellpelleten (upp till 108 totalt celler) i 1 ml Miltenyi buffert.
- I laminärt flöde huva, filter celler med Miltenyi LD magnetisk kolumn. Börja med att placera kolumn i magnetisk hållare (Miltenyi MidiMACS eller QuadroMACS). Placera sterilt 5 ml tub under filtret för att fånga filtrat. Förbered kolumn genom att ladda 2 ml Miltenyi buffert.
- När förfilter tvätt är klar, ladda celler på LD kolumn. När cellsuspensionen är inom kolumnen, tillsätt 1 ml Miltenyi buffert och upprepa 1 ml Miltenyi buffert tvätta 2 ytterligare gånger. Använd INTE kolven är försedd med kolonn för att öka hastigheten på filtrering. Endast samla filtratet när filtret i placerad i den magnetiska hållaren.
- Centrifugera det uppsamlade filtratet av ca 5 ml (kolonnen innehar resterande 1 ml) av CD45-utarmade icke-parenkymceller vid 200 xg under 5 minuter. Kassera kolumnen med balanserade CD45 positiva celler.
4. Flödescytometri isolering av CD133 positiva celler
- Förbered ovala cellmedium. Använd 01:01 DMEM: F12-medium med 10% värmeinaktiverat fetalt kalvserum som bas, och tillsätt insulin (1 | ig / ml), HEPES (5 mol / L), och penicillin / streptomycin (1% volym / volym). Filter lösning med vakuum filterenhet med 0,45 mikron filter.
- Återsuspendera celler i Miltenyi buffert på 100 μL per 10 7 celler. Tillsätt 2 mikroliter av CD133-PE-konjugerad antikropp. Användning av en andra grupp av celler, inkubera med IgG-PE-konjugerad antikropp som en kontroll. Behåll en tredje grupp av celler utan färgning som en ofärgad kontroll för FACS.
- Inkubera vid 4 ° C under 15 minuter i mörker. Återsuspendera i 2 ml färgning buffert. Centrifugera vid 200 x g under 5 minuter. Kasta supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml Miltenyi-buffert.
- Detta steg utförs med standardiserade flödescytometriska förfaranden cellsortering, som kan vara institution specifika. Använda ofärgade celler och IgG PE färgade celler, justera sortering parametrar för optimal gating av CD133 + cellpopulation. PE (R-Phytoerythrin) kan generellt användas med alla flödescytometer som har en laser som emitterar vid 488 nm. Toppen utsläppet för PE är 575 nm och detekteras i FL-2-kanal.
Obs: Om du använder en BD FACS Calibur eller BD FACS Vantage maskiner med Cell Quest-programmet för datainsamling, använder vi framåt Scatter och Side Scatter vy i log-skala för att identifiera cellpopulationer med sidospridning inställd på 250. FL1 och FL2 är både logaritmisk skala och inställd på 550. Dessa parametrar ger en initial startpunkt för att visa lever icke parenkymceller, och justeras vid behov utifrån färgningsintensitet av positiva och negativa populationer. - Isolera CD133 + cellpopulationen med CD133 + grind och samla cellerna i sterila filtrerade cell medier.
5. Cell odlingsmetoder
- Centrifugera FACS insamlade celler vid 200 xg under 5 minuter. Återsuspendera cellpelleten i ovala cellmedia med ca 5000 celler per ml. Kan börja med högre koncentrationer, upp till 50.000 celler / ml för inledande experiment, och minskar som tekniken förbättras och total cellviabilitet och utbytet förbättras.
- Plate celler på BD Biocoat lamininbelagda plattor med 96 brunnar med 1000 celler / cm 2. Placera i befuktad cellkultur inkubator vid 37 ° C, med 5% CO 2. Efter 24 timmar tillsattes Hepatocyte Growth Factor (50 ng / nl) och epidermal tillväxtfaktor (20 ng / ml).
- För enstaka celler, isolera celler direkt in 50 pl ovala cellmedia i varje brunn av en 96 väl laminin belagda plattan. Använd encelliga FACS inställningar för strikt urval av en positiv cell bara. Efter 24 timmar, tillsätt 50 | il ovala cellmedia med HGF och EGF såsom ovan i steg 5,2. Byta media helt efter 5-7 dagar.
- När expanderande kolonierna är större än 50% konfluenta, vilket normalt inträffar efter 2 veckor, beroende på det totala antalet celler pläterade och cellviabilitet kan cellerna delas 01:03 enligt nedan.
- Split celler med trypsin 0,05%-EDTA. Applicera precis tillräckligt för att täcka väl botten, 50-100 pl / brunn på 96-brunnars platta. Placera i inkubator vid 37 ° C under 3-5 minuter.
- Tillsätt 100 | il av media till varje brunn och överföra all vätska till 5 ml rör. Tillsätt 1 ml medium till varje rör och centrifugera vid 200 xg under 5 minuter.
- Återsuspendera celler i media platta in lamininbelagda skål, med celler från 1 väl plattan i 3 nya brunnar (1:3 förhållande).
6. Bekräftelse av bi-potentiell status med RT-PCR
Detta förfarande beskrivs närmare i RNeasy protokollet handbok som medföljer RNeasy Kit.
- Använd RNeasy mikro kolumner för 96 brunnar kolonier. Aspirera odlingsmedier från varje brunn. Lägg 75 pl buffert RLT (från RNeasy Kit) direkt till varje brunn. Skrapa platta botten med steril gummiskrapa. Pipettelysate i mikro-centrifugrör och vortexa blandningen i 1 minut. Lägg 70% etanol till lysat och blanda med pipettering.
- Överför lösningen till RNeasy kolumn placeras i en 2 ml uppsamlingsrör (som levereras i RNeasy Kit) och centrifugera i mikro-centrifug under 15 sekunder vid 10.000 rpm. Kasta eluerad filtrat.
- Återanvända insamlingen röret. Tillsätt 350 pl buffert RW1 (RNeasy Kit) till RNeasy kolonnen och centrifugera i 15 sekunder vid 10.000 varv per minut för att tvätta kolonnenmembran. Kassera eluerade tvätt.
- Tillsätt 10 mikroliter DNas I stamlösning till 70 il buffert RDD (båda levereras i RNeasy Kit). Tillsätt 80 mikroliter DNas I-buffert FUD inkubationstid blandning till RNeasy kolonnen membranet och inkubera under 15 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt 350 pl buffert RW1 (RNeasy kit) till RNeasy kolonnen och centrifugera i 15 sekunder vid 10.000 varv per minut för att tvätta membranet. Kasta eluerad tvätt och provröret.
- Placera RNeasy kolonnen i ett nytt 2 ml uppsamlingsrör (levereras i RNeasy kit). Tillsätt 500 pl buffert RPE (RNeasy Kit) till RNeasy kolonnen och centrifugera i 15 sekunder vid 10.000 varv per minut för att tvätta membranet. Kassera eluerade tvätt.
- Bered 80% etanol med användning av RNas-fritt vatten (RNeasy Kit). Lägg 500 pl 80% etanol till RNeasy columnand centrifug under 2 minuter vid 10.000 varv per minut. Kassera eluerade tvätt.
- Placera RNeasy kolonnen i ett nytt 2 ml uppsamlingsrör (RNeasy Kit) och centrifugera vid full hastighet under 5 minuter. Kassera eluerade tvätt och Colling röret.
- Placera RNeasy kolumnen i en ny 1,5 ml uppsamlingsrör (RNeasy kit). Lägg 14 il RNas-fritt vatten (RNeasy Kit) till mitten av kolonnen membranet och centrifugera i 1 minut vid full hastighet. Samla filtratet med renat RNA och överför till is om att skapa cDNA omedelbart eller förvara vid minus 80 ° C för framtida användning.
- Omvänd transkription med användning Omniscript.Dilute RNas-inhibitor till en slutlig koncentration av 10 enheter / pl i iskall 1x buffert RT. Vortex i 5 sekunder och puls Centrifugera i 5 sekunder. Förbered en ny huvudblandning på is efter sidan 13 i Omniscript protokollet. Vortex i 5 sekunder och puls Centrifugera i 5 sekunder. Rekommenderar att framställa en volym av mastermix 10% större än den som erfordras för den totala erforderliga för alla reaktioner.
- Lägg mall-RNA till de enskilda rören som innehåller Master Mix. Vortex i 5 sekunder och puls Centrifugera i 5 sekunder. Inkubera under 60 minuter vid 37 ° C.
- PCR-amplifiering av hepatocyt(Albumin) och cholangiocyte specifika gener med HotStarTaq DNA-polymeras. Förbered reaktionsblandning per sida 15 av HotStarTaq protokoll bok. Rekommendera späda lager primrar till en koncentration av 20 pm / il, och med 1 pl / reaktionsrör som används för framåt-och bakåt-primers. Beroende på antalet celler som ursprungligen användes för RNA-extraktion, rekommenderar vi dela slutliga cDNA bland 3 reaktionsrör (β-aktin för lastning kontroll, albumin och KRT19) att starta.
- PCR-primer konstruktion anges i tabell 1.
- Placera reaktionsrören i termocykler. Recommend följande program för inledande experiment: 95 ° Cfor 15 minuter x 1 cykel följt av 95 ° C under 30 sekunder, 55 ° C under 30 sekunder, 72 ° C under 30 sekunder x 35 cykler, följt av 72 ° C under 10 minuter.
- PCR-produkter analyseras med etidiumbromid impregnerade agarosgel.
7. Bekräftelse av tumör potential CD133 + stamceller
- Detta förfarande kangöras med nyisolerade celler från steg 4 eller användning av celler som har odlats från steg 5. Vi rekommenderar att utföra initiala experiment med odlade celler, kommer så nyisolerade celler har nedsatt livsduglighet och minskad avkastning.
- Trypsinisera celler under användning av trypsin 0,05%-EDTA från steg 5,5 ovan. Efter 3-5 minuters inkubering vid 37 ° C, tillsätt 100 pl av media till varje brunn och överföra all vätska från varje brunn till individuella 5 ml rör (1 väl = 1 tub). Lägg 1 ml medium till varje rör och centrifugera vid 200 xg under 5 minuter.
- Återsuspendera celler i 1 ml iskall PBS. Avlägsna 10 pl av PBS cellsuspension och tillsätt 10 pl trypanblått. Använda trypanblåttexklusion, bestämma antalet levande celler. Om du använder FACS isolerade celler, kommer antalet celler bestäms genom FACS isolering räknas.
- Centrifugera cellerna vid 200 x g under 5 minuter och åter-suspenderades i PBS vid en koncentration av 1 x 10 6 levande celler/100 pl. Tillsätt 100 | il Matrigel. Sex veckor gamla immun-brist Nude möss injicerades subkutant med 28 gague nål. Injicera 1 x 10 6 celler i 200 pl per plats.
- Möss övervakades för tumörtillväxt dagligen. När tumörer bildas, vanligen efter 3-4 veckors inkubation tumörvolymen mäts med skjutmått (höjd x längd x bredd).
8. Representativa resultat:
Från normal, frisk mus lever, är den förväntade cellulära utbytet av CD133 + celler leverstamceller 1.000 till 5.000 per levern. Dessa celler är relativt sällsynta i vilande lever och kommer inte expandera bra i kultur. Vi rekommenderar inte att använda en enda cell analys på normal lever och utbytet av livsdugliga celler som kommer att expandera är extremt låg.
För lever med betydande kronisk skada, såsom DDC 0,1% diet i 6 veckor 1 eller genetisk modifiering resulterar i kronisk skada, såsom MAT1a - / - eller lever specifik PTEN - / - möss, 2-4 förväntat antal cells isolerade ökar med upp till 100.000 celler isolerade / lever (figur 2). Om du använder genetiska modeller, kunskap om spontan tumör kurs är kritisk, eftersom dessa förfaranden för lever stamceller isolering bör utföras i tumörfria djur. Till exempel, om MAT1a - / - blanketter spontana tumörer vid 18 månader, rekommenderar vi att du använder djur senast 15-16 månader, före eventuella rapporterade spontana tumörer.
Isolering av enskilda celler från kronisk skada modeller kommer att ge flera (3-9 colonies/96 brunnar) kolonier som expanderar från enstaka celler när förfarandet behärskar, och cellviabiliteten säkerställs. Figur 3 nuvarande representativa bilder faskontrast av kolonier härledda från enkla CD133 + celler expanderade efter 7 dagar.
Bekräftelse av bi-potentiell status under användning Albumin och Krt19 RT-PCR. Kolonier från expanderade enstaka celler kommer att visa både uttryck för markörer av hepatocyter (Albumin) och cholangiocytes (Krt19). Figur 4 visar bi-potentiell uttryck från tre isolerade kolonier, med approximativt 25 celler / koloni vid 7 dagar.
CD133 + stamceller från normal lever och kemiskt inducerad leverskada (t.ex. DDC 0,1% diet under 6 veckor) kommer inte bilda tumörer i nakna möss. CD133 + stamceller från specifika genetiska modeller (MAT1a - / - eller lever specifik PTEN - / - möss) kommer att bilda tumörer i nakna möss om isolerade sent i slutet av pre-tumör kronisk skada fas. Denna tumör bildar fenotyp närvarande identifieras som en cancer stamceller till exempel 2-4, för MAT1a -. / - Möss bildar spontana levertumörer vid 18 veckors ålder. CD133 + leverceller stamceller isolerade vid 15-16 veckor, under en sen kronisk skada fas av leversjukdom, kommer att bilda tumörer i nakna möss. Figur 5 visar representativa tumörer från bilaterala injektion av 1 x 10 6 celler expanderas in vitro från enkel CD133 + lever stamcellers..
| Gen | Framåt Primer | Omvänd primer |
| β-aktin | 5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3 ' | 5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3 ' |
| Albumin | 5'-CATGCCAAATTAGTGCAGGA-3 ' | 5'-GCTGGGGTTGTCATCTTTGT-3 ' |
| Keratin 19 | 5'-TGCTGGATGAGCTGACTCTG-3 ' | 5'-AATCCACCTCCACACTGACC-3 ' |
Tabell 1: Primer design för RT-PCR
Figur 1: Total schematiskt metoder.
Figur 2: CD133 + lever stamceller identifierats i höganrikat CD45 utarmat icke parenkymal fraktion kontroll oskadad lever från vildtyp. möss visar 0,4% CD133 + celler inom höganrikat CD45 utarmat icke parenkymal fraktionen. I den genetiska knock-out MAT1a - / -, som är en modell av kronisk leverskada, expanderar CD133 befolkningen 10 gånger eller mer i samma höganrikat fraktion.
Figur 3: Utöka kolonier från enstaka CD133 + kloner faskontrast bilder på fyra kolonier som härrör från enstaka CD133 + celler expanderade på lamininbelagda 96 brunnar..
Figur 4: Bi-potentiell genuttryck från CD133 + lever stamceller klonalt expanderade kolonier vid dag 7, kolonier är ca 25 celler.. Genuttryck visar uttryck av hepatocyte markör Albumin och cholangiocyte markör Krt19, bekräftar bi-potentiell status CD133 + celler.
Figur 5: CD133 + levern stamceller bilda tumörer i nakna möss Pilar visar tumörer växer 4 veckor efter 1x10 6 CD133 + celler injicerade från MAT1a - / - modell.. CD133 + celler från toxin inducerad kronisk leverskada, såsom CCL 4 eller 0,1% DDC kost, inte bilda tumörer. Tumörbildning används för att identifiera malign potential, eller cancer stamceller fenotyp inom stamcellspopulation.
Discussion
Till skillnad från det hematopoietiska systemet, i vilket hematopoetiska stamceller är ansvariga för att upprätthålla en cellulär differentiering system som replacesnormal fysiologiskt omsättningen av leukocyter, röda blodkroppar och blodplättar, lever stamceller, eller vuxen lever progenitorceller, inte deltar i normal lever homeostas. 5,6 efter akut leverskada eller partiell hepatektomi, hepatocyter, som differentierade lever epitel, genomgår flera omgångar av proliferation för att ersätta den förlorade levern massa. 5,6 Endast vid kronisk skada är leverstamceller observerade celler att föröka sig. 1,5 -11 Dessa vuxna, organspecifika stamceller föreslås att differentiera i både hepatocyter och cholangiocytes. 1,5-8 Intressant, utvecklar den stora majoriteten av levercancer på bakgrunden av kronisk skada, och således levern stamceller också hypotesen att prekursorerna för en delmängd av levercancer. 2-4,12-17
On av de stora utmaningarna att stamceller arbete i levern är isolering av sällsynta populationer av celler för funktionell analys. Till exempel, den stora majoriteten av celler i levern är hepatocyter, som är väsentligt större än cholangiocytes och andra mindre icke-parenkymala celler. Genom att bryta hela levern till cellavdelningar (stora hepatocyter - parenkymal fraktion och mindre celler - icke-parenkymal fraktion), och ytterligare selektera för CD45 negativa celler (icke-hematopoetiska celler), kan vi berika start populationen av stamceller från över 600-faldigt. 1,18-21 Notera, vi inte på något sätt indikerar att CD133 + befolkningen är en 100% ren stamceller befolkningen, men klart är en heterogen population av celler med olika härstamning och återinsättning potential. En av de största begränsningarna för fältet är definitioner av stamceller och progenitorceller. Vi använder termen "stamceller" bredare i detta arbete, men i strikt definition, CD133 + icke-parencHymal celler representerar en bi-härstamning stamceller befolkningen. Med tanke på tillståndet i nuvarande stam-och stamfader forskning i levern, gör rapporten ger en utgångspunkt för utredare som är intresserade av detta område. När nya markörer uppstår, såsom EpCAM, 22,23 eller transkriptionsfaktorer, såsom Sox9, 24 kan de införlivas. Till exempel har vi funnit en ganska hög grad av överlappning mellan EpCAM + celler och CD133-celler +.
I denna rapport, detalj vi en process för stamceller isolering från normal murin lever liksom kronisk lever-modeller skada, som visar ökad lever spridning stamceller. Denna metod har klara fördelar jämfört med vanliga immunohistokemi av frysta eller formalinfixerade lever som funktionella studier med levande celler kan utföras efter isolering. 1,3,4 Det särskilda målet för denna process är att isolera en relativt ren population av celler leverstamceller som kan vara klonalt expanderade in vitro.
Alternativ för detta förfarande inkluderar mNDRING för en alternativ cellytmarkör såsom CD49f, EpCAM, eller en kombination av markörer, såsom CD133 + EpCAM + En andra publicerad rapport använder en densitetsgradient att isolera leverstamceller från en icke-parenkymal fraktionen. Denna procedur kräver en Ultra-centrifug (8000 xg), har ett betydande tid förfarandet och enligt vår erfarenhet, signifikant minskade före FACS cellulär avkastning och efter FACS livskraft. 8
Framtida experiment inkluderar en bredare genuttrycksanalys, inklusive fetala leverceller gener, såsom HNF3, HNF4α och αfp.In addition, Western blot-analys och immunocytokemi av uttryckta proteiner kan användas för att bekräfta RT-PCR-resultat av celler i odling.
En fråga att notera är senaste arbete som identifierade CD133 uttryck på celler hepatiska stellatceller. 25 Nu rutinmässigt screena våra prover för markörer för stellatceller celler (se avsnitt Felsökning) och har inte identified betydande kontaminering i våra fraktioner. Detta kan relateras till olika tekniker för lever-digerering och cellisolering. 2,3,26
Baserat på det faktum att majoriteten av celler inte kommer att vara lönsam omedelbart efter FACS isolering, rekommenderar vi att cellerna skall pläteras, antingen som bulk CD133 + celler eller enstaka celler, före användning i djur. 5-7 dagar in vitro kommer att avsevärt förbättra resultaten av tumör analys. Dessutom, med tanke på påfrestningarna i en enda cell isolering, bör detta endast göras en gång kolonier kan expanderas från bulk CD133 + isolerade celler. En mer ingående diskussion om de olika odlingsbetingelser och byggnadsställning proteiner som kan användas till kultur lever stam-och stamfaderceller har väl präglats av Lola Reid. Detta arbete ger alternativa villkor och ändringar, vilka utredarna kan införliva i sina forskningsprogram gång grundläggande isolering tekniker behärskar. 27,28 Dr Reids work ger också en mer detaljerad analys av härstamning biologi och mognad mellan celler hepatiska stamceller och stamceller.
När det gäller in vivo-tumör analys har vi haft framgång med nyligen isolerade celler och celler från klonalt expanderade CD133 + celler in vitro, främst med 1x10 6 celler. Vi har fokuserat ontwo genetiska stammar av kronisk leverskada, den MAT1a - / - och lever specifika PTEN - / - möss, och vi har utnyttjat både nakna möss och vildtyp möss som värdar för tumörtillväxt. Enligt vår erfarenhet kommer CD133 + lever stamceller bildas endast tumörer om de är isolerade från betydande modeller leverskada som är pre-maligna. Observera att tumörerna bildas av CD133 + celler allmänhet har både hepatocellulär cancer och funktioner cholangiocarcinoma, vilket tyder på en stamcell eller progenitorceller ursprung till tumörerna. 2-4,29
Uppföljning efter tumörer dokumenteras inkludes standarden patologisk analys av tumörvävnad (H & E-färgning) och immunohistokemisk färgning. Dessutom kan tumörer hackas och digererades under FACS-analys eller re-kultur. 2-4,30
Sammanfattningsvis har vi i detalj ett förfarande för isolering, expansion och grundläggande karakterisering av CD133 + leverstamceller och CD133 + cancer stamceller.
Felsökning:
CD45 kontaminering:
För steg 3, om det finns kontamination av CD45 + celler, som kan bedömas genom att lägga till en CD45-FITC AB inför FACS-analys och isolering, kontrollera att CD45 mikrokorn antikroppen inte har löpt ut och att filtratet samlas in endast när Filtret var i den magnetiska hållaren. Varje filtrat samlas under filtret inte är i den magnetiska hållaren kommer att innehålla CD45 + celler.
Lågt cellantal:
För oskadade levern, den totala number av CD133 + icke-parenkymal isolerad kan vara mindre än 10.000. Dessa celler är sällsynta i det obelastade levern. För en kronisk skada modell, såsom DDC 0,1% diet, kommer antalet att öka kraftigt till 100.000 celler. Om det totala antalet celler är betydligt lägre än dessa siffror, är en fråga att överväga FACS Ab färgning. Kontrollera att den CD133 AB inte har löpt ut, som dålig färgning kommer att resultera i en dålig avkastning. Dessutom rekommenderar vi att utföra en FACS-analys av lever icke parenkymceller för att bestämma den relativa befolkningen innan du försöker FACS isolering.
Låg cellviabilitet efter FACS:
En av de frågor om lönsamheten kan vara relaterade till hur cellerna bearbetas och under vilken tid. Helst ska hela cellen isolering förfarande steg 1-4, genomföras utan förseningar mellan steg och avslutas under samma dag. Varje betydande fördröjning mellan stegen 1-4 kommer att kraftigt minska cellviabiliteten. En andra fråga rör Cell livsduglighet kan vara relaterad till höljet tryck som används för FACS isolering. Vi rekommenderar att du använder ett lägre hölje tryck. Slutligen, när cellerna isoleras, bör de vara omedelbart pläteras, eftersom varje betydande lagring på is efter sortering kommer också att minska lönsamheten.
CD133 + icke-parenkymal heterogenitet:
Färska rapporter visar att hepatiska stellatceller celler kan också ha CD133 uttryck och ha lite plasticitet. 25 Därför kan förutom att kontrollera bi-potens gener med Albumin och Krt19, ytterligare verifiering inkludera gener associerade med stellatceller celler, såsom gliafibrillärt surt protein i vilande stellatceller celler och alfa-aktin i glatt muskulatur och desmin i aktiverade stellatceller. 3,4,26 dessutom representerar CD133 + befolkningen en bredare stamceller befolkning. Tillsatsen av en andra markör, såsom EpCAM, kan hjälpa till att förfina befolkningen ytterligare, och begränsa heterogenitet.
Disclosures
Dr Rountree får forskningsstöd från Bayer Pharmaceutics. Dr. Ding och Crooks och Ms Dang och Ms VanKirk har inga upplysningar att rapportera.
Acknowledgments
Dr Rountree erkänner det nuvarande stödet från Barnens Miracle Network, National Institute of Health, K08DK080928 och R03DK088013, och American Cancer Society Research Scholar Award, MgO-11.651. Dr Rountree erkänner att detta förfarande ursprungligen utvecklats och förfinats under finansieras av Pediatric Scientist Development Program (NICHD Grant Award K12-HD00850).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM:F12 | Invitrogen | 10565-018 | With phenol red |
| CD45 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Hepatocyte Growth Factor | Sigma-Aldrich | H1404 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | DN25 | 1 gram |
| Collagenase D | Roche Group | 1088874 | |
| Pronase | Roche Group | 0165921 | |
| 70 micron mesh strainer | Fisher Scientific | 352350 | |
| Omniscript RT | Qiagen | 205111 | 50 reactions |
| HotStarTaq | Qiagen | 203203 | |
| Miltenyi LD column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| CD133-PE FACS Ab | eBioscience | 12-1331-82 | |
| Laminin coated plates | BD Biosciences | 354410 | 96 well |
| Trypsin 0.05% EDTA | Invitrogen | 25300-354 | 100 mL |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | 50 columns for 5x105 cells or less |
| Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | 10X concentration |
References
- Rountree, C. B. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential. Stem Cells. 25, 2419-2429 (2007).
- Ding, W. CD133+ liver cancer stem cells from methionine adenosyl transferase 1A-deficient mice demonstrate resistance to transforming growth factor (TGF)-beta-induced apoptosis. Hepatology. 49, 1277-1286 (2009).
- Rountree, C. B., Ding, W., He, L., Stiles, B. Expansion of CD133-expressing liver cancer stem cells in liver-specific phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10-deleted mice. Stem Cells. 27, 290-299 (2009).
- Rountree, C. B., Senadheera, S., Mato, J. M., Crooks, G. M., Lu, S. C. Expansion of liver cancer stem cells during aging in methionine adenosyltransferase 1A-deficient mice. Hepatology. 47, 1288-1297 (2008).
- Michalopoulos, G. K.
- Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J.
- Theise, N. D. Gastrointestinal Stem Cells. III. Emergent themes of liver stem cell biology: niche, quiescence, self-renewal, and plasticity. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 290, 189-193 (2006).
- Wang, X. The origin and liver repopulating capacity of murine oval cells. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 100, 11881-11888 (2003).
- Greenbaum, L. E., Wells, R. G. The role of stem cells in liver repair and fibrosis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 222-229 (2011).
- Choi, S. S., Omenetti, A., Syn, W. K., Diehl, A. M. The role of Hedgehog signaling in fibrogenic liver repair. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 43, 238-244 (2011).
- Khurana, S. Scopolamine treatment and muscarinic receptor subtype-3 gene ablation augment azoxymethane-induced murine liver injury. J. Pharmacol. Exp. Ther. 333, 639-649 (2010).
- Sell, S., Leffert, H. L.
- Lee, J. S. A novel prognostic subtype of human hepatocellular carcinoma derived from hepatic progenitor cells. Nat. Med. 12, 410-416 (2006).
- Sell, S., Dunsford, H. A. Evidence for the stem cell origin of hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma. Am. J. Pathol. 134, 1347-1363 (1989).
- Amin, R., Mishra, L. Liver stem cells and tgf-Beta in hepatic carcinogenesis. Gastrointest Cancer Res. 2, 27-30 (2008).
- Tang, Y. Progenitor/stem cells give rise to liver cancer due to aberrant TGF-beta and IL-6 signaling. Proc Natl Acad Sci. 105, 2445-2450 (2008).
- Kitisin, K., Pishvaian, M. J., Johnson, L. B., Mishra, L. Liver stem cells and molecular signaling pathways in hepatocellular carcinoma. Gastrointest Cancer Res. 1, 13-21 (2007).
- Rountree, C. B. Bone marrow fails to differentiate into liver epithelium during murine development and regeneration. Hepatology. 45, 1250-1260 (2007).
- Shimano, K. Hepatic oval cells have the side population phenotype defined by expression of ATP-binding cassette transporter ABCG2/BCRP1. Am J Pathol. 163, 3-9 (2003).
- Suzuki, A. Flow cytometric isolation and clonal identification of self-renewing bipotent hepatic progenitor cells in adult mouse liver. Hepatology. , (2008).
- Suzuki, A. Clonal identification and characterization of self-renewing pluripotent stem cells in the developing liver. J Cell Biol. 156, 173-184 (2002).
- Yamashita, T. EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features. Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).
- Yamashita, T., Budhu, A., Forgues, M., Wang, X. W. Activation of hepatic stem cell marker EpCAM by Wnt-beta-catenin signaling in hepatocellular carcinoma. Cancer Res. 67, 10831-10839 (2007).
- Furuyama, K. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43, 34-41 (2011).
- Kordes, C. CD133+ hepatic stellate cells are progenitor cells. Biochem Biophys Res Commun. 352, 410-417 (2007).
- Berg, T. Fibroblast Growth Factor 10 is critical for liver growth during embryogenesis and controls of hepatoblast survival via b-catenin activation. Hepatology. , (2007).
- Turner, R. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology. Hepatology. 53, 1035-1045 (2011).
- Wang, Y. Lineage restriction of human hepatic stem cells to mature fates is made efficient by tissue-specific biomatrix scaffolds. Hepatology. 53, 293-305 (2011).
- Galicia, V. A. Expansion of hepatic tumor progenitor cells in Pten-null mice requires liver injury and is reversed by loss of AKT2. Gastroenterology. 139, 2170-2182 (2010).
- Ding, W. Epithelial-to-mesenchymal transition of murine liver tumor cells promotes invasion. Hepatology. 52, 945-953 (2010).
